论著・临床论坛 ２型登革病毒ＮＳ１部分基因原核表达蛋白免疫 小鼠后ＮＫ细胞和ＤＥｓ的动态变化 ＮＫ细胞的激活对适应性免疫具有重要 朱海东 左丽 陈建设 崔艳梅 用ＳＰＳＳＩ７．０软件包，绀 比较采用单［六Ｊ 素办差分析，检验水准ＯＬ＝０．０５。 结果 的功能性影响。但有关ＮＫ细胞、Ｄ（ｄｓ在 登革病毒感染中的作用目前研究较少，本 实验通过小鼠外周血及肝中ＮＫ细胞和 ４７６１Ｏ０河南商丘医学高等专科学校微免 教研室 ＤＣｓ的动态变化的观察，确定人ＮＫ细 ５５５００４贵州贵阳医学院免疫学教研室 摘要 目的：通过ＤＥＮＶ一２ＮＳＩ部分 实验小鼠外周ｍ细胞膜表面分了的 动态表达：①各免疫组外＿『吉ｊ血细胞Ｃ１）３ ＣＤ４９ｂ 分子表达的动态，变化：ＤＥＮＶ一 ２ＮＳ１基凶部分序列原核表达融合蛋白免 疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，免疫绀ＣＤ３一ＣＤ４９ｂ 分 胞、ＤＣｓ在ＤＥＮＶ一２感染中的作用关系。 资料与方法 基因原核表达融合蛋白免疫１３ＡＩ １３／ｅ小 鼠后，观察小鼠外周血及肝脏中ＮＫ细胞 和ＤＣｓ的动态变化 方法：用融合蛋白 材料：①ＤＥＮＶ一２ＮＳ１部分基凶原核 表达融合蛋白：南前期实验获得。②实验 动物：ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，清洁级６～８Ｗ龄，购 于 海中罔科学院动物实验中心。③主 要试剂和仪器：流式细胞术试剂；ＲＰＭＩ一 子表达水平１：第２４小时达最高值（２７．８６ ±２．４６），７天至筇二峰值之后逐渐卜降， 与佐剂组和ＰＢＳ绢比较差异有统汁学息 义（Ｐ＜０．０５）；初次免疫组与加强免疫绑 比较，变化趋势相同，两者比较差异无统 加弗氏佐剂经肌肉免疫ＢＡＩ Ｂ／ｅ小鼠。 采集各组小鼠在初次免疫及再次免疫后 第１２小时、２４小时、７２小时、７天、１４天 外周血及肝标本，分别采用流式细胞术测 定细胞膜表面ＣＩ）３一Ｃ１）４９ｂ 、ＣＤ８６ （ １）¨ｔ－ 分子的表达 结果：免疫组小鼠 １６４０士『｝养液、ＤＭＥＭ培养液．，Ｊ、牛１０【清； ＨＢＳＳ液、细胞生长液、细胞维持液等常规 配制，４￣Ｃ保存；Ｐｅｒｃｏｌ１分离液、红细胞裂解 液。流式细胞检测仪；冷冻高速离一Ｃ，，ＪＯＬ。 ｌ方法：（１）动物模型的建 ：将用完拿 计学意义（Ｐ＞０．０５）。②各免疫绀外例 血细胞ＣＤ８６ ＣＤ１１（－ 分子表达的动态变 化：ＤＥＮＶ一２ＮＳ１基因部分序列原核表达 外周血细胞的（ Ｉ）３一ＣＩ）４９ 表达水平在 第２４小时至峰值，７天至第二峰值此后 下降，肝淋巴细胞的ＣＤ３一ＣＤ４９ 表达水 平在第７２小时至峰值此后下降，ＣＤ８６ ＣＩ）Ｉ１（： 表达水平至第２４小时达高峰值 融合蛋白免疫ＢＡ［ Ｂ／ｃ小鼠，免疫组 ＣＩ）８６ ＣＤＩ１ ｃ 分了的表达水平２４小【ＩＩｆ 弗氏佐剂乳化的ＤＥＮＶ一２ＮＳ１融合蛋门 （０．１ １）肌肉注射免疫小鼠，免疫剂 量ｌＯｎｇ／只，并设完全弗氏佐剂对照和 ＰＢＳ对照，初次免疫后第８天以不完全弗 氏佐剂为佐剂，以减半剂量和相同途径加 强免疫。（２）标本采集：①ｍ标本采集：分 达峰值（６．８７±０．４６）此后Ｆ降， 佐剂 组和ＰＢＳ组比较差异有统汁学意义（Ｐ＜ ０．０５）。初次免疫组与加强免疫绀比较， 此后下降 、与正常对照组差异有统计学 意义（Ｐ＜０．０５），结论：ＤＥＮＶ一２ＮＳ１部 变化趋势相同，两者比较差异尢统计学意 义（Ｐ＞０．０５）。⑧外刷ｍ １）Ｃｓ肢ＮＫ乡ｆｎ 胞的动态变化＿天系：免疫绀ＣＩ）３ 分基因表达原核表达融合蛋白免疫小鼠 后．ＮＫ细胞和Ｉ）Ｃｓ反应较为迅速；且ＤＣｓ 别在初次免疫及再次免疫后第１２小时、 ２４小时、７２小时、７天、１４天眼球放 ，每 次每组３只、每只０．５ｍ］，标本用于流式 细胞术检测ＮＫ细胞、ＤＣ膜表面分了的 柃测。②肝脏淋巴细胞分离：分别在初次 免疫及冉次免疫后第１２小时、２４小时、 ７２ ｄ，Ｉｔ￣、７天、１４天颈椎脱臼处死小鼠， 取小鼠肝脏小Ｉ１ 在２００目金属滤网卜研 ＣＤ４９ｂ 分子表达水平于第２４小ｆｉｌｆ达最 高伉，７天 第 峰值之后逐渐卜降；铯 疫绀ＣＤ８６ ＣＤ１ Ｉ Ｃ 分ｆ的表达水平２４ 有促进ＮＫ细胞的活化、增值的倾向 关键词Ｉ）ＥＮＶ一２原核表达蛋白 流 式细胞术 （ ：１０．３９６９／＿．ｉｓｓｎ．１００７—６１４ｘ．２０１２． ２６．【）２２ 小时达峰值此后 降． ．实验小鼠肝脏淋巴细胞表曲分ｒ的 动态表达：①符免疫绀肝脏淋巴细胞 ＣＤ３一Ｃ１Ｎ９ｂ 分子表达的动念变化： ２ ｔ 痫毒（ＤＥＮＶ一２）的ＮＳＩ部 磨后用１５ｍＬＨＢＳＳ液制成肝细胞悬液，苔 盼蓝染色死细胞，计数活细胞数１×１０ ／ ｍＪ用ｐｅｒｅｏｌ１分离液分离出肝脏淋巴细 ＤＥＮＶ一２ＮＳ１基【大１部分序列原卡炙表达融 合蛋白免疫Ｐ，ＡＩ Ｂ／ｃ小鼠，免疫组（：１）３ ＣＩＮ９ｂ 分了表达水平丁第７２小时达最 分序列表达蛋白是Ｉ）ＥＮＶ一２的重要糖基 化的 结构蛋 ，在产生免疫应答方 起 啦费作用 树突状细胞（１）Ｃｓ）是目前 胞，用于流式细胞术检测ＤＣ及ＮＫ细胞 膜表面分子的检测。（３）检测各组免疫小 鼠外周ｆｆＩＬ细胞及肝脏淋巴细胞膜表面分 子的水平：取外周 细胞及肝脏淋巴细胞 做流式细胞术检测小鼠免疫细胞膜及肝 脏淋巴细胞膜表面分子ＣＤ８６ ＣＤ１１ ｃ （ＤＣｓ）、ＣＤ３一ＣＤ４９ｂ （ＮＫ细胞），观察外 周血及肝脏树突状细胞及ＮＫ细胞的动 态变化。 高值（４３．５７±４．８４）之后逐渐Ｆ降， 饵 剂组和１）Ｂｓ绀比较差异仃统汁学意义（， ＜０．０５）；初次免疫组Ｌｊ力ＩＪ强免疫组比较， 变化趋势相同，两者比较差异无统计学意 所 的机体内功能最强的抗原呈递细胞 （ＡＰＣ），址激发 始Ｔ细胞反应的重要刺 激 ｆ－， 可产生 系列细胞 了参与 免疫州 物作用， ＮＫ细胞 仪具有抗微生 释放一些细胞 子，在炎症 义（Ｐ＞０．０５）。②符免疫绀肝脏淋巴细 胞ＣＤ８６ ＣＤ１１ ｃ 分＿『表达的动态变化： ＤＥＮＶ ２ＮＳ１基凶部分序列原核表达融 中扮演着重要角色，其抗病毒作用是目前 研究的热点之一ｌ２ Ｊ。最近研究证实ＮＫ ～合蛋白免疫ＢＡＩ Ｂ／ｃ小鼠，免疫组ＣＤ８６ ＣＤ１１ ｃ 分子的表达水平２４小时达峰佰 （２．３２±０．１７），与佐剂组和ＰＢＳ￣Ｉ４相比 ＤＣ相互作用对体内病毒感染过稃中免 疫细胞激活起重要作用 。ＤＣｓ介导的 统汁学处理：结果用（ ±Ｓ）表示，采 ２６中国社区医师・医学专业２０１２年第２６期（第１４卷总第３２３期 舍他康唑乳膏治疗浅部真菌感染临床观察 检阳性，就诊前１周内未用任何抗真菌药 王静 伦玉 桑明玉 无效０例。 物治疗。 不良反应：该药外用耐受性良好，少 数患者可出现轻度的局部刺激症状，停药 后症状消失，不影响用药。 讨论 ２６２７００山东寿光皮肤病防治站 ２６２７００寿光市中医院 ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００７—６１４ｘ．２０１２． ２６．０２３ 治疗方法：每次适量涂抹于患处，覆 盖感染部位及其周同皮肤，轻揉片刻。用 于足趾癣时，２次／日，连用４周。用于体 癣、股癣或头癣，２次／日，连用２周。 疗效判断标准：①痊愈：自觉症状及 皮损完全消失，真菌直接镜检阴性；② 效：自觉症状及皮损改善８０％以上，真菌 舍他康唑乳膏是人工合成的咪 唑类广谱抗真菌药，对皮肤真菌、酵母菌、 念珠菌、曲霉菌有抑制和杀灭作用，对革 １年来，应用舍他康唑乳膏治疗 浅部真菌感染，取得显著疗效，现报告如 下。 直接镜检阴性；③好转：自觉症状及皮损 改善３０％～８０％，真菌直接镜检阳性或 兰阳性菌有较强抗菌作用。因舍他 康唑乳膏疗效高，经济、安全、方便、不良 反应少，不失为一种治疗浅部真菌感染的 良药。 阴性；④无效：自觉症状及皮损改善不足 资料与方法 ３０％或加重。 结果 本绀患者１５０例，男７６例，女７４例。 其中体股癣７Ｏ例，手足癣７３例，头癣７ 例。所以患者临床症状典型，真菌直接镜 差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；初次免疫 痊愈１２０例， 效１６例，好转１４例， 体天然免疫反应时可增加１Ｏ倍，可能是 机体最重要的天然免疫的器官，肝脏ＤＣｓ 数量相对不足、但绝对量最大。 本研究表明免疫组外周血细胞 ＣＤ３一ＣＤ４９ｂ 分子及ＣＤ８６ ＣＤ１１ ｃ 分子 ＤＣｓ在２４小时都达峰值，说明它们都参 与早期抗感染免疫；免疫７２后ＮＫ细胞 组与加强免疫组比较，变化趋势相同，两 者比较差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。 又 现峰值说明ＤＣｓ可能促进了ＮＫ细 胞的活化、增值，提高了ＮＫ细胞清除病 原微生物的能力；肝脏ＤＣｓ动态变化与 外周血相同，但是ＮＫ细胞的峰值出现较 晚，可能与融合蛋白随ｍ循环在肝脏代 谢，滞留时间较长，引起天然免疫细胞ＮＫ 细胞在肝脏聚集，以及ＤＣｓ促进了ＮＫ细 胞的活化、增值有关。 参考文献 １ Ｄｅ Ｃｒｅｕｓ Ａ．Ａｂｅ Ｍ，Ｌａｕ ＡＨ，ｅｔ ａ１．Ｌｏｗ ＴＬＲ４ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｌｉｖｅｒ ＤＥＮＶ ｄｒｉｔｉｅ ｃｅｌｌｓ ｅｏｒｒｅ— ｌａｒｅｓ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｃａｐａｃｉｔｙ ｔｏ ａｃｔｉｖａｔｅ ａｌｌｏｇｅ— ③肝脏ＤＣｓ及ＮＫ细胞的动态变化关系： 免疫组ＣＤ３一ＣＤ４９ 分子的表达水平在 第２４ｈ呈现上升趋势，在第７２小时至峰 表达水平，在最高值时比佐剂组和ＰＢＳ 组高几倍；免疫组肝脏淋巴细胞ＣＤ３一 ＣＩＭ９ 分子表达水平在最高值时比免疫 组外周血细胞ＣＤ３一ＣＤ４９ｂ 分子表达水 平还要高，ＣＤ８６ ＣＤ１１Ｃ 分子表达水平 在最高值时比免疫组外周血细胞ＣＤ８６ ＣＤ１１Ｃ 分子表达水平有所下降，但仍比 对照组高的多，ＤＥＮＶ一２ＮＳ１部分序列表 达蛋白作用后ＮＫ细胞和ＤＣｓ的量明 增加，说明ＮＫ细胞和ＤＣｓ在机体抗病毒 感染的免疫过程中起重要作用。融合蛋 白随血循环在肝脏代谢，滞留时间较长， 必定引起天然免疫细胞ＮＫ细胞在肝脏 聚集，所以ＮＫ细胞比外周 明显增加。 本研究表明免疫组外周血细胞 ＣＤ３一ＣＤ４９ｂ 分子表达水平于第２４小时 值，此后下降；ＣＤ８６ ＣＤ１１Ｃ 分子的表达 水平第２４小时达峰值此后下降。 讨论 ＤＥＮＶ一２ＮＳ１部分序列表达蛋白是 重要的非结构蛋白，高度保守。本研究利 用ＤＥＮＶ一２ＮＳ１基因部分序列重组表达 纯化蛋白，同时加弗氏佐剂增加其免疫原 性，肌肉注射 ，在实验不同阶段动态检 测小鼠外周ｍ细胞及肝脏淋巴细胞膜表 面分子的水平。登革热的发病机制还未 ｎｅｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ【Ｊ【．Ｊ Ｉｍ— ｍｕｎｏｌ，２００５，１７４（４）：２０３７—２０４５． ２ Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ ＡＢ，Ｋｈｕｏｎ ｇ ＢＮ，Ｇａｒｙ ＣＰ，ｅｔ ａ１． Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｅｆｅｎｓｅ：ｆｕｎｃｔｉｏｎ 完全明确，通过流式细胞仪检测这些细胞 表面分子从而分析在感染过程中这些细 胞的数量及功能变化，对于登革热的发病 机制的研究具有重要的意义。ＣＤ４９ｂ 是 ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｎａｔｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ Ｊ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３，１７：１８９—２２０． ３ Ｇｅｒｏｓａ Ｆ，Ｂａｌｄａｎｉ Ｇｕｅ￣ａ Ｂ，Ｎｉｓｉｉ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｒｅ— ｃｉｐ ｒｏｃａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｎａｔｕｒａｌ 小鼠ＮＫ细胞的表面标志。在机体早期 抗病毒感染的免疫过程中起重要作用。 ＤＣｓ是目前已知最强的专职抗原提呈细 胞，其功能状态决定了免疫反应的最终走 向，成熟的ＤＣｓ主要表达ＣＤ８６ ＣＤ１１ｃ 达最高值，７天至第二峰值之后逐渐下 降；免疫组外周血细胞ＣＤ８６ ＣＤ１１Ｃ 分 ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． 子的表达水平２４小时达峰值此后下降。 免疫组肝脏淋巴细胞ＣＤ３一ＣＤ４９ 分子 的表达水平在第２４小时呈现上升趋势， ２（１０２，１９５（３）：３２７—３３３． ４徐华，狄飚，车小燕，等．Ｉ型ＤＥＮＶ ＮＳ１基 因克隆及其表达产物的免疫原性研究［Ｊ］． 中国人兽共患病杂志，２００６，２２（１）：５４— ５７． 分子。肝脏是一个独特器官，天然免疫淋 巴细胞ＮＫ细胞、ＤＣｓ选择性地富集在肝 在第７２小时至峰值，此后下降；ＣＤ８６ ＣＤＩ １Ｃ 分子的表达水平第２４小时达峰 脏，有研究发现，肝脏ＮＫ细胞含量在机 值此后下降。免疫组外周血ＮＫ细胞和 中国社区医师・医学专业２０１２年第２６期（第１４卷总第３２３期）２７
