维普资讯 http://www.cqvip.com 第２９卷第３期 ２００７年５月 南京工业大学学报 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＮＡＮＪＩＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ Ｖｏ１．２９ Ｎｏ．３ Ｍａｙ ２００７ 甲磺隆人工抗原的合成及多克隆抗体的制备 戴 烨，李方实，孙 峰 （南京工业大学理学院，江苏南京２１０００９） 摘要：为了建立测定磺酰脲除草剂甲磺隆残留的酶联免疫吸附检测方法（ＥＬＩＳＡ），以邻甲酸甲酯苯磺酰胺与琥 珀酸酐反应合成半抗原１－Ｅ（２一甲酸甲酯）苯磺酰］单胺琥珀酸．用活性酯化法将半抗原分别与牛血清蛋白（ＢＳＡ） 和卵清蛋白（ＯＶＡ）偶联制备免疫抗原和包被抗原、通过免疫抗原免疫新西兰大白兔获得甲磺隆的多克隆抗体，抗 体效价达８００ ０００．以此抗体建立的间接竞争ＥＬＩＳＡ法，检测甲磺隆的线性范围在０．７～４０ ｍｇ／Ｌ，最低检测限为 ０、１６ｍｇ／Ｌ．与甲磺隆结构相似的磺酰脲类除草剂的交叉反应结果表明，氯嘧磺隆的交叉反应率为３８．２％，其他４ 种除草剂的交叉反应率都小于ｌ％． 关键词：甲磺隆；半抗原；人工抗原；多克隆抗体；酶联免疫吸附法 中图分类号：Ｘ１３２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７１—７６２７（２００７）０３—００３９—０５ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｒｔｉｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｆｏｒ ｍｅｔｓｕｌｆｕｒｏｎ－ｍｅｔｈｙｌ ａｎｄ ｆｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＤＡＩ Ｙｅ，ＬＩ Ｆａｎｇ—ｓｈｉ，ＳＵＮ Ｆｅｎｇ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００９，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ ｈｅｒ． ｂｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｏｆ ｍｅｔｓｕｌｆｕｒｏｎ—ｍｅｔｈｙｌ ｉｎ ｆｏｏｄ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ａ ｈａｐｔｅｎ，１－Ｅ（２－ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ）ｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆｏｎｙ１］ ｍｏｎｏａｍｉｄｏｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ．ｗａｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｕｓｉｎｇ ２．ｃａｒｂｏｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ ｗｉｔｈ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ．Ｔｈｅ ｈａｐｔｅｎ ｗａｓ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｔｏ ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＢＳＡ ａｎｄ ＯＶＡ ｂｙ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｅｓｔｅｒ ｍｅｔｈｏｄ．Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｍｅｔｓｕｌｆｕｒｏｎ—ｍｅｔｈｙｌ ｗａｓ ｒａｉｓｅｄ ｉｎ ｔｗｏ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｒａｂｂｉｔｓ．Ｔｈｅ ｔｉｔｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｒｅａｃｈｅｄ ８００ ０００．Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｈａｐｔｅｎ—ＯＶＡ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ａｓ ｔｈｅ ｃｏａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｔｈｅ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ ｗａｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ．Ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒａｎｇｅ ｆｏｒ ｍｅｔｓｕｌｆｕｒｏｎ—ｍｅｔｈｙｌ ｗａｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ０．７～４０ ｍｇ／Ｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃ— ｔｉｏｎ ｗａｓ ０．１６ ｍ Ｌ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｃｒｏｓｓ．ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｆｉｖｅ ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｃｈｌｏｒｉｍｕｒｏｎ．ｅｔｈｙｌ ｗａｓ ３８．２％， ａｎｄ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｆｏｕｒ ｗｅｒｅ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ １％．Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｓｅｔｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｅｔ— ｓｕｌｏｒｆｏｎ—ｍｅｔｈｙｌ ｒｅｓｉｄｕａ１． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｍｅｔｓｕｌｆｕｒｏｎ—ｍｅｔｈｙｌ；ｈａｐｔｅｎ；ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ；ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＥＬＩＳＡ 甲磺隆是一种高效磺酰脲类除草剂，广泛应用 于水稻、小麦等农作物…．但土壤环境中残留的甲 磺隆对微生物生态有破坏作用，乃至对土壤肥力及 农作物生长造成潜在危害 ．因此迫切需要方便实 用的甲磺隆残留检测方法．磺酰脲类除草剂的残留 分析方法主要有ＨＰＬＣ、ＧＣ、ＥＣ等化学分析法、酶联 免疫法和生物分析法等 －５］．甲磺隆的残留检测方 法如ＨＰＬＣ法 Ｉ７ 、ＧＣ法 和生物分析法 国内已 收稿日期：２００６－０１－２４ 基金项目：国家自然科学基金资助项目（２０４４７００３） 作者简介：戴烨（１９８３一），男，江苏靖江人，硕士生，主要研究方向为环境分析化学； 李方实（联系人），教授，Ｅ—ｍａｉｌ：ｆａｎｇｓｈｉ．１ｉ＠ｎｊｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎ． 维普资讯 http://www.cqvip.com 南京工业大学学报 第２９卷 有报道．但化学分析法预处理复杂、设备昂贵，同时 需要专业的仪器操作人员；生物测定法仅为半定量， 而且容易受其他除草剂的影响，对不同种类土壤和 植物要求的测定方法各异¨ ．甲磺隆的酶联免疫吸 附检测方法国外已有研究 卜Ｈｊ，但国内还没有相关 力加热搅拌器７９—１，常州国华电器有限公司；台式 离心机，上海安亭科学仪器厂． １．２实验方法 １．２．１半抗原的合成 甲磺隆为小分子物质（Ｍｗ＝３８１），本身并不具 有免疫原性，需要合成半抗原并偶联到大分子载体 蛋白形成人工完全抗原才能免疫动物¨ ．图１为甲 报道．本文详细研究了甲磺隆的人工抗原的合成和 抗甲磺隆多克隆抗体的制备，并建立了甲磺隆间接 竞争酶联免疫吸附检测方法． １材料与方法 １．１材料、试剂和仪器 １．１．１材料 透析袋（截流相对分子质量１４ ０００Ｄ，上海华美 生物工程公司）． １．１．２试剂 邻甲酸甲酯苯磺酰胺，质量分数不小于９９％， 金坛市华瑞化工厂；琥珀酸酐，质量分数不小于 ９９％，化学纯，国药集团化学试剂有限公司；双氧水， 质量分数为３０％，国药集团化学试剂有限公司； １，８一二氮杂环［５，４，０］十一烯一７，二氮杂二环 （ＤＢＵ），质量分数不小于９８％，温州市嘉力化工有 限公司；薄层层析硅胶（ＧＦ２５４），化学纯，青岛海洋 化工有限公司；甲磺隆、氯嘧磺隆、吡效隆、噻磺隆、 胺苯磺隆、氯磺隆，质量分数大于９５％，南京环境科 学研究所提供；弗氏完全佐剂（ＦＣＡ）、弗氏不完全佐 剂（ＦＩＣＡ）、Ｎ一羟基丁二酰亚胺（ＮＨＳ）、二环己基碳 二亚胺（ＤＣＣ）、Ⅳ，Ⅳ一二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）、牛血清 白蛋白（ＢＳＡ）、卵清蛋白（ＯＶＡ），Ｓｉｇｍａ；吐温一２０， 化学纯，中国医药（集团）上海化学试剂公司；柠檬 酸，中国上海试剂一厂；脱脂奶粉，黑龙江省光明松 鹤乳品有限公司；３，３ ，５，５Ｌ四甲基联苯胺 （ＴＭＢ），南京赛吉科技有限公司；羊抗兔一辣根过氧 化物酶（ＩｇＧ—ＨＲＰ），北京中杉金桥生物技术有限公 司；其他试剂均为分析纯． １．１．３实验动物 新西兰大白兔（雄性，１．５～２ ｋｇ，江苏省农业科 学院实验动物中心）． １．１．４仪器 ＤＧ５０３１型酶联免疫检测仪、ＤＧ３０８０型自动洗 板机，华东电子集团医药装备有限责任公司；酶标板 （９６孔，Ｃｏｓｔａｒ，ＵＳＡ）；ＨＨ一１数显恒温水浴锅，金坛 市荣华仪器制造有限公司；移液枪（Ｆｉｎｎｐｉｐｅｔｔｅ）；磁 磺隆半抗原的合成路线 ．从分子结构与偶联点和 间隔臂考虑¨ ，通过邻甲酸甲酯苯磺酰胺与琥珀酸 酐反应得到半抗原１一［（２一甲酸甲酯）苯磺酰］单 胺琥珀酸，在分子中引入羧基作为蛋白偶联活性 位点． ∞ ３∞ ３ 。 ＋ｓＯ２ＮＨ２ ｓＯ２Ｎ｝ｔ Ｏ Ｏ ＼０Ｈ 图１半抗原的合成设计 Ｆｉｇ．１ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈａｐｔｅｎ 将５．１６４ ３ ｇ（２４ ｍｍｏ｜）邻甲酸甲酯苯磺酰胺、 ２．４０５ ０ ｇ（２４ ｍｍｏ１）琥珀酸酐溶于５０ ｍＬ乙腈于 ２５０ ｍＬ圆底烧瓶中，室温搅拌．将７．３０７ ６ ｇ（４８ ｍｍｏ１）ＤＢＵ溶于２０ ｍＬ乙腈中，缓慢滴（０．５ ｈ）入 烧瓶中后再反应２．５ ｈ．加入２００ｍＬ蒸馏水，用３ ｘ ５０ ｍＬ乙酸乙酯萃取．水相中滴加６ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣ１，调 节至ｐＨ为２，再用３×５０ ｍＬ乙酸乙酯萃取，合并 有机相，用无水Ｎａ ＳＯ 干燥后减压蒸去有机溶 剂，得到粗产品．用乙酸乙酯重结晶，即得较纯 产物． １．２．２人工抗原的合成 免疫原（半抗原一ＢＳＡ）的合成见参考文献［１８］． 在１５ ｍＬ小烧杯中将半抗原（０．４ ｍｍｏｌ，０．１３２ ５ ｇ）、 ＮＨＳ（０．４ ｍｍｏｌ，０．０４７ ５ ｇ）和ＤＣＣ（０．４４ ｍｍｏｌ， ０．０９２ ｇ）溶解于２ ｍＬ无水的ＤＭＦ中，室温磁力搅 拌５ ｈ，得到活性酯．抽滤除去沉淀的二环己基脲．在 强烈搅拌下将２ ｍＬ活性酯缓慢（１ ｈ）加入ＢＳＡ蛋白 质溶液（１００ ｍｇ的蛋白质溶于１０ ｍＬ、０．０５ ｍｏｌ／Ｌ、 ｐＨ为８的硼酸缓冲溶液）中，室温反应２４ ｈ．用磷酸 盐缓冲溶液（ＰＢＳ，０．１５ ｍｏＬ／Ｌ，ｐＨ ７．４）透析．前２ ｄ 每天透析５次，后３ ｄ每天透析３次．所得免疫原定 容分装，并于一２０ ｃＣ下保存． 包被原（半抗原一ＯＶＡ）合成方法同免疫原的合 成方法，仅载体蛋白改变． 维普资讯 http://www.cqvip.com 第３期 戴烨等：甲磺隆人工抗原的合成及多克隆抗体的制备 ４１ １．２．３抗体的制备 选取２只健康的雄性新西兰大白兔（１．５～２．０ ２结果与讨论 ２．１半抗原的鉴定 ｋｇ），试验前采集阴性血清．每只兔子的具体免疫程 序如下：首次免疫用２ ｍｇ免疫原与等体积弗氏完全 合成所得半抗原熔点为１４３～１４６℃，ＴＣＬ （ＧＦ２５４硅胶，展开剂为 （甲醇）： （二氯甲烷）： （醋酸）＝１．０：９．０：０．１）的比移值Ｒ，＝０．６７． Ｈ ＮＭＲ（（ＣＤ，） ＳＯ参比）的解析结果为６：１２．１２６ （Ｓ，２Ｈ，ＣＯＯＨ，ＮＨ），７．６６６～８．０８１（ＩＴＩ，４Ｈ，Ａｒ＿－ 佐剂混合，乳化成油包水结构后进行背部皮下多点 注射（４０点左右）；４周后用同样剂量的免疫原与等 体积弗氏不完全佐剂进行注射免疫，此后每隔２周 注射免疫１次直至抗血清效价增长速度减缓；最后 一次用等体积的生理盐水稀释免疫原，直接耳缘静 脉注射．１ １ ｄ后心脏采血．血样在常温下静置凝结 ０．５ ｈ，并于４℃下过夜，取上层血清分装后于 一２０℃冻存． １．２．４抗体的鉴定 用间接非竞争ＥＬＩＳＡ法测定抗体效价，方阵滴 定法确定包被原及抗血清的工作浓度． 间接非竞争ＥＬＩＳＡ法具体步骤 如下：包被原 用碳酸盐缓冲溶液（ＣＢＳ，０．０５ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ９．６）倍比 稀释后加入９６孔酶标板中包被，每孔１００ ＩｘＬ，４ 冰箱过夜；甩于后在洗扳机上用洗涤液（ＰＢＳＴ，含 ０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０的ＰＢＳ）洗涤３次，甩于后每孔加 人２００ ３％的脱脂奶粉封闭，３７℃水浴孵育１ ｈ； 甩于后洗涤，加人用磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ，０．１５ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．４）稀释不同浓度的抗血清，每孔１００ Ｌ，３７℃水浴孵育２ ｈ，甩干后洗涤，每孔加人１００ Ｌ新鲜配制的二抗（ＩｇＧ—ＨＲＰ，１：１０ ０００），３７℃水 浴孵育１ ｈ；甩于后洗涤，每孔加入新配制的底物液 （５０ Ｌ ０．６５％Ｈ２０２，２００ Ｌ １０ ｍｇ／ｍＬ ＴＭＢ的ＤＭＦ 溶液，溶于１９．７５ ｍＬ柠檬酸盐缓冲液（ＣＰＢＳ， ｐＨ５．５）１００ Ｌ，３７℃水浴孵育１５ ｍｉｎ；每孔加人５０ Ｌ ２ ｍｏｌ／Ｌ Ｈ ＳＯ 溶液．用酶联免疫检测仪读取每 孔Ａ为４５０ ｎｍ下的吸光值（ＯＤ）． １．２．５标准抑制曲线的建立和交叉反应率 间接竞争ＥＬＩＳＡ是用５Ｏ ＩｘＬ ＰＢＳ倍比稀释的标 准溶液和５０ Ｌ抗血清代替间接非竞争ＥＬＩＳＡ法中 的１００ ＩｘＬ抗血清，其余步骤与间接非竞争ＥＬＩＳＡ法 相同．绘制甲磺隆的标准抑制曲线，并计算灵敏度 （，５。，抑制率为５０％时的浓度）及检出限（，１ｎ）．用与 甲磺隆结构相似的其他磺酰脲类除草剂氯嘧磺隆、 吡效隆、噻磺隆、胺苯磺隆和氯磺隆进行交叉反应， 按式（１） 来估测抗体对甲磺隆的特异性． ， 交叉反应率： ×１００％ （１） Ｈ），３．８６６（Ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），２．４９０～２．５１６（ｍ，２Ｈ， ＣＯＣＨ２ ＣＨ２ ＣＯＯＨ），２．３５３～２．６８０（ｍ，２Ｈ， ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ）． ２．２偶联物的鉴定 利用紫外吸收法对半抗原与载体蛋白的偶联结 果进行鉴定 ．紫外扫描可知，人工抗原紫外吸收 光谱兼具半抗原和载体蛋白的紫外吸收特征，表明 半抗原已与载体蛋白结合． ２．３方阵滴定和抗体效价的测定 加强免疫后定期采血测定血样中抗体的效价 （最佳抗体稀释倍数），如表１所示．８～１０周的抗血 清效价的增长明显减缓，再加强一次免疫，ｌｌ ｄ后采 全血． 表１免疫期间抗血清的效价 Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ ｄｕｒｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｓｉｎｇ 一 采血时间／周 效价 ６ １０ Ｏ００ ８ ２５ Ｏ００ １０ ３０ Ｏ００ 阴性血清的方阵滴定结果如图２所示．阴性血 清稀释倍数在１ ０００以下的吸光值比较大，主要是由 于血清中动物蛋白在酶标板上的非特异吸附，因此 抗血清在低于此浓度时检测的灵敏度会受到很大的 影响． 趔 阴血清稀释倍数 图２阴性血清的方阵滴定 Ｆｉｇ．２ Ｃｈｅｓｓｂｏａｒｄ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｒｕｍ 维普资讯 http://www.cqvip.com ４２ 南京工业大学学报 表２抗体的交叉反应率 Ｔａｂｌｅ ２ Ｃｒｏｓｓ—ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ 第２９卷 阳性血清的方阵滴定结果如图３所示．在包被 原质量浓度大于１００ ｎｇ／ｍＬ时，相对于抗血清而言 已经饱和，最佳包被原质量浓度即为１００ ｎｇ／ｍＬ，此 化合物 化学结构 交叉反应率／％ 浓度下抗血清的效价为８００ ０００． 迥 抗血清的稀释倍数 图３抗血清的方阵滴定 Ｆｉｇ．３ Ｃｈｅｓｓｂｏａｒｄ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ２．４标准抑制曲线 甲磺隆的标准抑制曲线如图４所示． 褂 磊 嚣 ｐ（甲磺隆）／（ｎｇ・ｍＬ ） 图４ 甲磺隆的标准抑制曲线 Ｆｉｇ．４ Ｓｔｎａｄａｒｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ＣＨＩ Ｖｅ ｏｆ ｍｅｔｓｕｌｆｕｒｏｎ—ｍｅｔｈｙｌ 甲磺隆的质量浓度为４．８ ｍｇ／Ｌ，测定甲磺隆的 线性范围为０．７—４０ ｍｇ／Ｌ，检测限为０．１６ ｍｇ／Ｌ． ２．５交叉反应率 抗体对其他５种与甲磺隆结构相似的磺酰脲 类除草剂的交叉反应率如表２所示．除氯嘧磺隆 的交叉反应率为３８．２％外，其余４种的交叉反应 率都小于１％，因此抗体对甲磺隆具有较高的特 异性． ２．６ 甲醇对间接竞争ＥＬＩＳＡ的影响 在对甲磺隆残留分析中，甲醇是常用的萃取溶 剂 ］．通过对不同甲醇浓度的间接竞争ＥＬＩＳＡ试 验，结果表明甲醇质量分数在２０％下对检测结果基 本没有干扰． 甲磺隆＼“ ＼。１００．０ ０ 血Ｎ Ｎ＇ｓ￣人＼ Ｎ Ｔ／氯嘧磺隆 ．２ 一 吡 隆ｃｃ 。 ＮＮ Ｎ贝Ｎ ＜ ・。０ ０ 噻磺隆 … ０ 。 Ｎ贝 ／ 氯磺隆 — ３ 结论 特异性抗体的制备是利用免疫学方法进行化学 农药残留分析的最关键因素，而农药多为小分子化 合物，抗体的制备往往很困难．本研究在甲磺隆苯环 上的磺酰胺处连接一个间隔臂，得到半抗原，再分别 与蛋白质ＢＳＡ和ＯＶＡ偶联合成了免疫原和包被 原，该法偶联效率高，对蛋白的变性作用较小；经免 疫兔子获得了高效价的抗甲磺隆的兔血清，且对氯 维普资讯 http://www.cqvip.com 第３期 戴烨等：甲磺隆人工抗原的合成及多克隆抗体的制备 ４３ 磺隆等磺酰脲的交叉反应率很小，不会影响甲磺隆 的测定． 该多克隆抗体的研制成功为发展甲磺隆免疫分 析法奠定了基础．免疫分析法具有前处理简单、无需 专业仪器、操作人员和分析成本低等优点，适合于大 批量进行的快速鉴定．但要使该方法标准化还需要 做大量试验研究． 致谢：吴春菊、夏金云和朱瑾娜参加了部分实验． 参考文献： ［１］ 冯维卓，吴建良．我国南方主要作物田的化学除草［Ｊ］．农药， ２０００，３９（１１）：１—７． 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ｗａｔｅｒ ｔｙｐｅｓ ［Ｊ］．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９，３３： ３５８—３６１． ［１３］ Ｌｅｅ ＪＫ，ＡｈｎＫ Ｃ，Ｐａｒｋ Ｏ Ｓ，ｅｔａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｉｍｍｕｎｏ— ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｂｅｎｓｕｌｆｕｒｏｎ—Ｍｅｔｈｙｌ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａ ｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，５０： １７９１—１８０３． ［１４］ Ｄｅｇｌｅｍａｎｎ Ｐ，Ｗｅｎｇｅｒ Ｊ，Ｎｉｅｓｓｎｅｒ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｌａｓｓ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ（Ｓｕｌｆｕｒｏｎ Ｓｃｒｅｅｎ）［Ｊ］．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，３８： ６７９５—６８０２． ［１５］ 郭剑平，吴启庆，高芬芳，等．免疫化学方法在检测农药小分 子中的应用［Ｊ］．毒理学杂志，２００６，２０（１）：５４—５６． ［１６］ Ｙａｚｙｎｉｎａ Ｅ Ｖ，Ｚｈｅｒｄｅｖ Ａ Ｖ，Ｅｒｅｍｉｎ Ｓ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐ— ｍｅｎｔ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙｒ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，３８（１）： ９—１４． ［１７］ 陈林，吴青，潘科，等．农药分子半抗原合成的研究进展［Ｊ］． 现代农药，２００５，４（３）：１０—１４． ［１８］ Ｃｒｏｗｔｈｅｒ Ｊ Ｒ．Ｔｈｅ ＥＬＩＳＡ ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ［Ｍ］．Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００２：８３—１１３． ［１９］ 刘媛，刘贤进，余向阳，等．Ｍｉｌｂｅｍｙｃｉｎ Ｏｘｉｍｅ半抗原设计及其 抗体制备［Ｊ］．农药学学报，２００５，７（３）：２８５—２８８． ［２０］ 刘海燕，黄超．甲磺隆、氯磺隆、噻吩磺隆混剂液相色谱分析 ［Ｊ］．农药科学与管理，２００５，２６（１２）：５—７．