硫酸软骨素提取工艺优化及抑菌活性研究

哈尔滨商业大学学报(自然科学版)Journal of Harbin University of Commerce (Natural Sciences Edition)2019 年 10 月

Vol. 35 No. 5Oct. 5019硫酸软骨素提取工艺优化及抑菌活性研究徐丽萍*，姜 1,姚鹏程，宋志鹏，王鑫(哈尔滨商业大学食品工程学院省高校食品科学与工程重点实验室，哈尔滨195076)摘要：实验以硫酸软骨素得率为指标选择超声波提取时间、碱质量浓度、碱性蛋白酶添加量和［蛋

白酶添加量4个因素结合响应曲面优化设计最佳提取方案，并选取大肠杆菌、枯草芽抱杆菌进行抑菌 实验，采用平板计数法，确定其抑菌效果以及最低抑菌浓度.研究结果显示，超声波辅助碱-双酶法提

取硫酸软骨素的最佳工艺条件为：料液比为1： 19(g/mL)，碱添加量为30 g/L,提取温度50 t，超声时间

为44.6 min、碱性蛋白酶添加量为3.01%。、［蛋白酶添加量为3.53%。,硫酸软骨素得率为9.88%.抑菌 实验表明硫酸软骨素对大肠杆菌、枯草芽抱杆菌有抑制作用，最低抑菌浓度均为200 m/mL.关键词：鸡软骨;硫酸软骨素;提取；响应曲面；抑菌性;超声波辅助中图分类号：TS251.5

文献标识码：B 文章编号：1976 -0944(2219)05 -0576 -08Optimization of entrnction prncess and antimicrnbial activity of chondrnitin sulfatuXU Li-ping* , JIANG Zhe, YAO Peng-cheng,SONG Zhi-peng , WANG Xin(Key Laboratory of FooO Science and Engineerin/ , School of FooO Engineerin/ ,Harbin University of Commerce , Harbin 155076 , Chinn)Abstrnct: The expecmenO used chongroitin sulfaOe yield ns tOe ingee, ang selecten tOe ultrc-

sonic exticctiog tirne, dd— cegcentytiog, alkalige pctnsu —ditiog amoogi ang trypsin at-

ditiog dmougt to cemOine the optimdt extoctiog scheme of osponsu surface optimiz—og de- siog,—g selecten escherichio cof ang Oacilluc suUtilic. Tlie Oacteriostasic experiment was

cerrien out Oy using te plate cognting meteog to detecnige iO Oacteriostatm enect ang tee

minimum inginitory cogcentotiog. The osuds sUowen tOat tOe optimum congitiogs foc tOe et- toctiog of chongoitin sulfate Oy ultrasomc-cssisten aiaali-Puai enzymdtic methog were as foi-

low: tOe ratio of materia- ti liquin was 1： 19 ( (/mL) , amongt of aiaatt Cde was 35 /L, ang tee extraction temperaturo was 55 °C. The time was 44. 6 min, tee amongt of aiaalige

— was 3.61 %。, tee dmongt of topsin — was 3.53 %。, ang tee yield of chon­

droitin suUdte was 19. 58%. Antinacterial experimentp sPow— tOat chongoitin suUdte ted escherichia colt ang Oacilluc suUtilio, ang tee minimum inhinitoo concentration wat 220

m/mL,Key wods : chichen certila/e - chondroitin sulfdte - extraction; response surface我国是农业和畜牧领域的大国,每年屠宰大量 的畜禽类，而后骨头被丢弃•软骨是动物骨骼中的

酸软骨素(Chondoitin Sulfate,简称CS,下文同)属

于硫酸化糖胺聚糖的一种,是广泛存在于高等动物

一部分，其中的蛋白、多糖具有广泛的生理功能•硫结缔组织中的酸性黏多糖，具有高度分散性口-3

收稿日期：2719 -72-ll•基金项目：黑龙江省教育厅项目(Nn 12541194)作者简介:徐丽萍(1973 -)，女，教授，硕士生导师，研究方向:农产品加工与贮藏工程-574 -哈尔滨商业大学学报（自然科学版）第35卷CS是以蛋白聚糖的形式存在的一种天然高分子生 后，加入少量同一质量浓度的NaOH溶液.50 C水 浴锅中浸提1 h,每22 min搅拌;之后按双酶法的 工艺流程进行操作[1]，并用硫酸-咔F法进行实

物化合物，具有抗血栓、抗凝血和防止血管硬化等 作用[4'5].随着CS生物活性的不断被揭示和其应

用领域的不断扩展，对其精细化程度的要求越来越

验，计算CS得率.平行实验3次.2） 质量浓

高•传统的提取方法主要有碱提取、酶提取、超 声提取及乙酸抽提法等，单一的提取方法主要存在 周期长、污染重、时间长等问题E9 ].素称取25 g原料平均分成5份，按料液比1： 15 （g/mL）分别加入质量浓度为10、20、30、40、50 g/L

本实验采用单因素试验、响应曲面优化实验, 的NaOH溶液，置于500 W,25 C条件下超声波提 取40 min.取出后，加入少量同一质量浓度的 以CS得率为考察指标、超声波辅助碱-双酶法提

取、响应曲面优化,选出适宜的鸡软骨中CS提取 方 ， 大 、 CS菌活性研究•为减少资源的浪费和提高畜禽软骨的

利用价值提供理论依据.1实验材料与方法1.1实验材料软骨，

.1.2主要试剂与仪器氯化钠（天津市北方天医化学试剂厂）;葡萄

糖（天津市天力化学试剂有限公司）；蛋白（、牛肉 膏、营养琼脂、胰蛋白酶、碱性蛋白酶（北京奥博星 生物技术有限责任公司）；大肠杆菌、枯草芽抱杆

菌（微生物实验室储备）；氢氧化钠（天津市大陆化

学试剂厂）；浓硫酸（西陇化工股份有限公司）;咔 F（上海源叶生物科技有限公司）；无醛乙醇（天津

市科密欧化学试剂有限公司）；数显恒温水浴锅 HH-4型（国华电器有限公司）；电子分析天平

ALC-1100.2型（北京赛多利斯仪器系统有限公 司）；立式压力蒸汽灭菌器LDZX-55KB型（上海

申安医疗器械厂）；恒温培养箱HG353 -4K型（北 京百万电子科技中心）；电热恒温鼓风干燥箱DHG -9103A型（上海恒一科学仪器有限公司）；双频

数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）.11实验方法1.1.1超声波辅助碱-双酶法提取工艺的单因素

试验以CS得率为指标选择超声波提取时间、碱质 量浓度、碱性蛋白酶添加量和胰蛋白酶添加量4个

影响提取效果的因素进行探究.1） 素称取25 g原料平均分成5份，按料液比1 ： 15 （g/mL）加入 35 g/L 的 NaOH 溶液，置于 500 W、25 °C条件下用超声波提分别取35,35、40、45、55 min

NaOH溶液.50 C水浴锅中浸提1h,每20 min搅

拌;操作同上.3） 碱性蛋白酶的添加量单因素实验称取25 g原料平均分成5份，按料液比1： 15 （g/mL）加入35 g/L 的 NaOH 溶液，置于500 W、25 C条件下超声波提取44 min.取出后，加入少量同

一质量浓 的 NaOH 15 C 水浴锅中 1

h,每20 min搅拌;调节pH至8,依次加入原料质 量2. 2%。、2. 5%。、3. 0%。、3. 5%。、4. 0%。的碱性蛋白

酶（即 6 000、7 500、9 000.W 500、12 000 U//） ,55 C水浴搅拌至软骨全溶.调节pH值至8. 5,加入原 料质量3.5%。的胰蛋白酶酶解.5。C水浴2 h后,

80 C恒温灭酶20 min.离心，取上清液,操作同上.4） 胰蛋白酶的添加量单因素实验称取25 /原料平均分成5份，按料液比1： 15 （//mL）加入质量浓度为35 //L的NaOH溶液，置 于5。0 W,25 C条件下超声波提取44 min.取出

后，加入少量同一质量浓度的NaOH溶液.50 C水

浴锅中浸提1h,每22 min搅拌;调节pH至8,加 入原料质量3.5%。的碱性蛋白酶,55 C水浴搅拌至

软骨全溶•调节pH值至8.5,加入原料质量2.

5%。、3. 0%。、3. 5%。、4. 0%。、4. 5%。的胰蛋白酶（即 184.5、225、262.5、300、334.5 U//）酶解.5。C 水

浴2 h后,80 C恒温灭酶22 min.离心，取上清液,

操作同上.1.1.2响应曲面法优化鸡软骨硫酸软骨素的提取

工艺根据单因素实验的结果，采用Design - Expert-

8-05b模型对超声波辅助碱-双酶法提取鸡软骨 CS的工艺条件进行响应曲面设计优化，以鸡软骨 CS得率为响应值，考察超声波提取时间、碱性蛋白

酶的添加量、胰蛋白酶添加量三个因素对CS得率 的影响陀-1].各因素的区间为：超声波时间35 ~

45 min,碱性蛋白酶添加量2.5 ~ 3. 5%。,胰蛋白酶

第5期徐丽萍，等:硫酸软骨素提取工艺优化及抑菌活性研究• 574 •添加量3.0%e〜4. 0%e,因子编码及水平见表1.失,因而得率降低•即最佳超声波时间为44 min.表1 Design - Expert实验设计因素水平及编码代码 编码水平因素 -------------------------------------编码 未编码下水平零水平 上水平超声波时间/min21354045碱性蛋白酶添加量/%。222.13.23.1胰蛋白酶添加量/%。23.23.14.2注:编码值与真实值之间的关系为:衍=（禺-40）/5,2 =（蜀

-3. 0）/0. 5,3 =（X3 -3. 5）/5. 5.1.3.3硫酸软骨素生物活性研究平板计数 究CS的 ，选取大肠2

种•活化后 浓度大约为106〜\"CFU/mL菌悬液何.同时将CS配50、100、150、200、250 m/mL 饱和

于试管中 其 1〜5,并取一管 0号口1 •灭菌后每 管中加入1 mL杆菌菌悬液和9 mL无菌LB液体培养基,37 C恒温培

养24 h.培养 后 1 mL移入无菌培养皿与肉汤蛋白（培养 合 ，待琼脂培养基凝固后,

34 C恒温培养箱中培养1〜24 h后计数5

下公式计算

数.5 浓数 数

的样品浓度.

（W + 0. ln2）d其中:N为样品中

数；Yc为平板（

旨范围菌落数的平板）菌落数总和;n为第一稀释度 （低稀释倍数）平板个数;n为第二稀释度（高稀释 数）平板个数； 子（第一 ）。2实验结果与讨论2.5超声波辅助碱-双酶法提取工艺单因素实验

结果分析2.1. 5超声波提取时间的影响将碱的质量浓度30 /L、碱性蛋白酶添加量3.。力。、胰蛋白酶添加量3.5%° 素，超声素,

素 CS的影响，其结果见图1.1

,

30〜50mi.CS的 力口 ，到44 min时达到大，最大

16. 25% .但44 min后，得龙能是由于 分子键生水

，使CS； 程中的有所损2.1.2碱质量浓度的影响超声波时间44 mi.碱性蛋白酶添加量3. 0%°、胰蛋白酶添加量3. 55 素，碱的添加量

素， 质量浓

硫酸软骨素的 影 ，其 25图2碱质量浓度对CS得率的影响2 ，碱的质量浓 10-55 //L，CS 加 ， 质量浓35 //L1 ，最大值为18. 66% .超过35 /L 后 ，

， 是 能 质 量浓影 的 程 5 质量浓 的CS,使有 分 ，从而低•艮卩最佳碱质量浓度为35 /L.2. 1.3碱性蛋白酶的添加量的影响40 mi.碱质量浓度30 /L、胰蛋

白酶添加量3. 55 素，碱性蛋白酶添加量素,

蛋白酶添加量对CS得率的影响，其结果见图3.20.0018.0016.0014.0012.0010.008.00 2.0------------- 2.5------------- 3.0------------- 3.5------------- 4.0碱性蛋白酶添加量/%图3碱性蛋白酶添加量对CS得率的影响-576 -哈尔滨商业大学学报（自然科学版）第33卷

由图3

0%°〜H%。的

, 蛋白酶添加量在2.加趋18.56% •当超试验号表2响应曲面实验设计与结果因素Xi超声波X碱性蛋白 X胰蛋白酶 CS得率，CS的

，在3.5%,

3. 5%°后，

，最大 呈现下降的

•分析可能1时间/min酶添加量/%。添加量/%。-1-1(3.00 )0(3.55)/%添加量 添加量过量时,，

，酶与底物不能充分，当酶0000(40)-1(2.50)15.02完全,，

•分析

，3.0%°

蛋白沉［佳231(3.50)0(3.00)15.4318.8612.18积残留的现象，影

蛋白酶添加量.45-1-11(4.00)2.1.4胰蛋白酶添加量的影响-1010.7844 min、碱质量浓度30 //L、

蛋白酶添加量3.4%o 素,胰蛋白酶添加量 素，考察胰蛋白酶添加量对CS得率的影响，其

4.图4胰蛋白酶添加量对CS得率的影响4可以看出，当胰蛋白酶添加量在2.5〜4.5%°（即186.5〜336. 5 U//）的范围内时,CS的

加 ，在 3.5%°（即 262.5 U//）时，最大

15.32%. 5

3.5%°后，提呈现下降的 •分析可能 添加量过，酶与底物不能充分 ，当酶添加量过量时,完全,

蛋白沉积残留的现象,影 •分析

，3.5 %。

胰蛋白酶添加量5素方差分析，碱添加量

程中CS得率影

显著，因此 、碱性蛋白酶添加量和胰蛋白酶添加量

化素52.2响应曲面法优化鸡软骨硫酸软骨素提取工艺

条件结果分析软骨经烘干处理的软骨粉 ，以CS,

方法, 方素 ，确

素水平，并进化，建立 与 之间的数学模型.经 Desi/n - Expert. 8. 05O 模型设计和实验结果见表2.6-10-113.066-1(35)1012.96801114.9640001852101(45)0113.621110018.33121-10135081300018.7614-10115.861510-111.1816000185461911016.522. 0. 5超声时间与碱性蛋白酶添加量的交互作用

的分析与优化从图5中可以看出，当碱质量浓 30 /L,胰蛋白酶添加量为3.5%°,这两个因素的父互

较显著水平 ,

和 蛋白酶添加量分

44〜42 min和3.。力。〜3. 2%°的， CS

大 52. 0. 2

与胰蛋白酶添加量的交互作用的分析与优化从图6中

，当碱质量浓

3。/L,碱性蛋白酶添加量为3%°时，这两个因素的交互作 显著水平 ,

和胰蛋白添加量分别在40〜42 min和3. 55〜3.6%°的范围， CS 大 52. 0. 3碱性蛋白酶与胰蛋白酶添加量的交互作用

的分析与优化从图6中可以看出，当超声时间为40 min时, 两个 素的 交互

显著5 水平 ，碱性蛋白酶和胰蛋白酶添加量分别在3. 0%°〜3.

2%°和3. 5%°〜3. 6%°的

，CS得率达到最大．第5期徐丽萍，等:硫酸软骨素提取工艺优化及抑菌活性研究含CS量19.00• 574 •3.503.2516.92喇 14.85s爼 12.7710.702.7535.0037.50

40.00 A:超声时间42.50 45.002 75E：碱性蛋白酶添加量•）37-5° A:超声时间图5超声时间、碱性蛋白酶添加量及其交互作用对CS得率影响的等高线图和响应图含CS量19.0017.0215.0513.0711.103.253.753.0035.00

37.50

40.00 A:超声时间42.50 45.00q 25C:胰蛋白酶添加量•A:超声时间图6超声时间、胰蛋白酶添加量及其交互作用对CS得率影响的等高线图和响应图含CS量19.003.75-17.27* 15.55后 13.823.25-3.002.502.75 3.00 3.25 B碱性蛋白酶添加量3.50C:胰蛋白酶添加量B碱性蛋白酶添加量图7碱性蛋白酶与胰蛋白酶添加量及其交互作用对CS得率影响的等高线图和响应图2.2.4方差分析及显著性检验软骨素的超声时间（I ）、碱性蛋白酶添加量 （乙）和胰蛋白酶添加量（禺）的二次多元回归方

程为：y 二 24. 63 -0. 37X] + 1. 12X2 -0. 57X3 +0. 15“2 + 0. 15X1X3 - 0. 85X2X3 - 2. 20X15 - 1. 5 7X22 -6. 67X32从 型的方差分析表3可见,此模型显著（P < 0. 0001）,模型的校正决定系数 疋d=°・933 8,说明该模型能 93.88% :值的变化，相关系数人二0.986 5,说明 型拟合程良好,误差小，可以用来分析硫酸软骨素的提取

[⑷.Desi/i Expert软件对数据进行多元回归

其中：丫为CS百分含T,%；X为超声时间，min；

拟合, - 硫酸X2为碱性蛋白酶添加量,％ ； X3为胰蛋白酶添

加量， %5-576 -哈尔滨商业大学学报(自然科学版)表3响应面模型方差分析表第33卷的一组具有代表性的结果如图8所示，图片顺序依

F值P值<0.0001变异源模型平方和175.184564自由度4均方和 19.46 15550〜6号样品的 数图•通过1〜5号样品28.29与0号样品 能 的生长有

数有明显，其差异，表明CS对大

失拟项3中200 m//mL| 明显，据平

产生［⑷.5

：验纯误差总和0.05180.00人=0.9865405043观察几乎没有 平 ：16R2 =0.9732数 5所示.RA =0.9388模型Moder衍表4回归方程系数显著性检验系数估计自由度标准差36502平方和从表4回归方程系数显著性检验数据可知，模

F值2852455006.06P值<050001型一次项X显著,二次项均显著.最佳工艺条件: 超声时间44. 6 min、碱性蛋白酶添加量3. 01%.(即

9 OSO U/g)、胰蛋白酶添加量 3.53%°(264.55 U/ /) ,cs得率的理论值为15. 66% 640.36052405240524054005400540175.18056611111111135445500050605久20.760554-2.62050304叼2.3121.73111.363.36315450.104 6050008证 化后的工艺条件超声时间44. 6 min、碱性蛋白酶添加量3. 00%.(即

9 000 U//)、胰蛋白酶添加量3. 53%°(即264. 66

2222122212.-5515162.5823.26<050001U//) ,CS得率为18. 88%，略低于理论值.2.3硫酸软骨素抑菌效果分析2. 3. 0硫酸软骨素对大肠杆菌抑菌作用结果分析

-1.9516.011.340500140.178 3-0562-051205040054105410541252405058050840.0460.780 6058353了不同质量浓度梯度的样品，采

取MPN计数法研究其对大 的2205032图8大肠杆菌样品结果图第5期徐丽萍，等:硫酸软骨素提取工艺优化及抑菌活性研究-579 -表5不同CS质量浓度样品中大肠杆菌菌落总数

CS对大 的生长有一定的 ，随(x 108cfu/mL • g_1)CS质量浓度(mg - mL-1 )CS质量浓度的 大,菌落数 ，表明随CS增加其

对照组强；CS质量浓度为数 ， 250m/LmL5016.566.091502002.7625。200m/LmL

3.782.695.31数与为200 m/mL相比有 加，但与 【组236.385.616.545. 565.665.712.662.864.9324.19相比仍显

的

浓

，则可初步推测CS对大肠质量浓

后可能对大

200 m/mL, CS质量2.532.529生根据表5中数据可以看出，在一定质量浓度范弱，这有待于 继续研究.图9枯草芽苞杆菌样品结果图2.3.2硫酸软骨素对枯早牙孑包杆圉抑圉作用结果 且与

CS 一

显 相差较大,这表明的生 有分析了不同质量浓度梯度的样品，采

平板计数法研究其

， 且质量浓 加其

20 m/mL丨 数

强， 于 CS，250 m/mL时菌落的的一组具有代

0〜6号样品

的 9,图片顺序依数与220 m/mL相比有 加，但与

仍能

相数图.1号样品即CS质量的生长状况与判

， 初步判 CS 于浓 50 m/mL 的

后 能 弱,有待于

质量浓

继续研究.2。0 m/mL, 生相比较并没有太大差异，则 质量的浓度的CS)

量浓 品

与对照组相

无 •其他质能明显，说数CS对枯且CS质量浓

有一

65200 m/mL ]

表6不同CS质量浓度样品中

(x 108cfu/mL • g_0)组数一菌菌落总数明在一定能质量浓

；

CS质量浓度/(m/ - mL ~1 )平

501001502002.962502.69对照组16.566.385.616.096.543.765.316可以看出，CS质量浓度为50 m/mL时

品 数与 水平相差不大，表明低质量浓的生长没有

；CS235.965.912.662.862.524.93的CS)

质量浓

5.562.554.19H'K,220,250 m/mL菌落数逐渐• 580 •哈尔滨商业大学学报(自然科学版)第35卷3 结语以鸡软骨为实验原料，采用响应曲面优化实验

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CS得率为18. 88% .同时对提取的CS进行的抑菌 实验结果表明对大肠杆菌、枯草芽抱杆菌有抑菌作 用,最低抑菌质量浓度为220 m/mL.[9]陈红丽，杨永铎，于建军•胃蛋白酶提取硫酸软骨素的研究

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