中国人兽共患病学报 ５８８ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ ２０１７。３３（７） ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ ｉｓｓｎ １００２—２６９４．２０１７．０７．００３ 肺炎支原体ＣＡＲＤＳ毒素蛋白多表位 拼接抗原的表达及鉴定 刘宝山 ，赵芝娜。，赵雨杰。，王桂珍。 摘 要：目的 探讨肺炎支原体ＣＡＲＤＳ毒素蛋白多表位拼接抗原的免疫反应活性。方法 对ＣＡＲＤＳ毒素蛋白的抗ｌｇ－ 表位进行分析，选取１０个重要的表位进行拼接，反向翻译后合成并克隆，插入ｐＥＴ２８ａ表达载体构建ｐＥＴ—ＣＡＲＤＳ表达质粒 并转入受体菌。经ＩＰＴＧ诱导表达的多表位拼接ＣＡＲＤＳ蛋白使用６×Ｈｉｓ单克隆抗体和人阳性血清进行了免疫印迹的检 测。结果 ＣＡＲＤＳ毒素蛋白的多表位拼接抗原表达载体构建成功，诱导后表达大小为３０ＫＤａ的重组蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ测定 其能与６×Ｈｉｓ单克隆抗体和人阳性血清发生反应。结论 本研究选取的ＣＡＲＤＳ毒素蛋白抗原表位具有较强的免疫活性， 可为Ｍｐ感染的诊断提供新的候选抗原。 关键词：肺炎支原体；ＣＡＲＤＳ毒素蛋白；多表位拼接抗原；表达；鉴定 中图分类号：Ｒ３７５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２—２６９４（２０１７）０７—０５８８—０４ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＣＡＲＤＳ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＬＩＵ Ｂａｏ—ｓｈａｎ 。ＺＨＡＯ Ｚｈｉ—ｎａ。，ＺＨＡＯ Ｙｕ—ｊｉｅ。，ＷＡＮＧ Ｇｕｉ—ｚｈｅｎ。 （１．ＳｈｅｎｙａｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０８６６，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１００１６，Ｃｈｉｎａ； ３．Ｃｈｉｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１００１３，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｍｕｌｔｉ—ｅｐｉｔｏｐｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＣＡＲＤＳ ｔｏｘｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（Ｍｐ）ｉｎ ｐｒｏ ｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｉｔｓ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．Ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｕｌｔｉ—ｅｐｉｔｏｐｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｇｅｎｅ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｅｎ ｃｒｉｔｉ— ｃａ１ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｗａｓ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ ｂｙ ｌｉｎｋｅｒ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＴ一２ ８ａ（＋），ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２ １（ＤＥ３）ｃｅ１１ｓ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＰＴＧ．Ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ６×Ｈｉｓ ｍｏｎｏｃｌｏｎａ１ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｒｕｍ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＴ—ＣＡＲＤＳ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ａｂｏｕｔ ３０ ｋＤａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｉｔ ｃａｎ ｒｅａｃｔ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｗｉｔｈ ６×Ｈｉｓ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｒｕｍ．Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＣＡＲＤＳ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈａｓ ａｎ ｏｂｖｉｏｕｓ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｏ ｂｅ ａ ｎｅｗ ａｎｔｉｇｅｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｍｐ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ；ＣＡＲＤＳ ｔｏｘｉｎ；ｃｈｉｍｅｒｉｃ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ（Ｎｏ．２０１２２２２５０１９） Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：Ｗａｎｇ Ｇｕｉ—ｚｈｅｎ，Ｅｍａｉｌ：ｇｚｗ００４＠１２６．ｃｏｒｎ 肺炎支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ，Ｍｐ）是 引起呼吸系统炎症，而且与哮喘的发病密切相关，并 可引起广泛多系统肺外并发症＿２。］。 社区获得性呼吸道感染的重要病原体，约占社区获 得性肺炎的１Ｏ％～４Ｏ ，并呈增加趋势 。其不但 辽宁省社会科学发展基金（Ｎｏ．２０１２２２２５０１９）项目资助 通讯作者：王桂珍，Ｅｍａｉｌ：ｇｚｗ００４＠１２６．ＣＯＮ 作者单位：１．沈阳农业大学，沈阳 １１０８６６； 近年来，一种被称为社区获得性呼吸窘迫综合 征（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎ— ｄｒｏｍｅ，ＣＡＲＤＳ）毒素的抗原在Ｍｐ感染中的作用引 起人们的关注。最新研究发现肺炎支原体毒力因子 ２．沈阳药科大学，沈阳 １１００１６； ３．中国医科大学，沈阳 １１００１３ 社区获得性呼吸窘迫综合征毒素（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ａｅ— ｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｔｏｘｉｎ，ＣＡＲＤＳ ７期 刘宝山等：肺炎支原体ＣＡＲＩ）Ｓ毒素蛋白多表位拼接抗原的表达及鉴定 ５８９ ＴＸ）足巾ＭＰＮ３７２ 冈编码的５９１个氨基酸的货 白质．主要分布丁胞膜和胞质，具有ｌ｜核酸腺｝１：核糖 迹．鉴定ＣＡＲＤＳ拼接蛋白的 达及免疫活性。 转移酶活性 ．依靠膜联蛋白Ａ２结合真核细胞 ． 参与侵犯呼吸道等病理生理过程 ， 而被认为是 Ｍｐ的一个重要毒力因子。 ２（）１ ５年司文等存使用重绀【、ＡＲＤｓ毒索货ｒ１ 诊断肺炎支原体感染的血清学Ｅｌ ＩＳＡ试验巾。发现 其敏感性高于重组Ｉ １篮白，可作为Ｍｐ感染诊断的 新抗原“，但比市售试剂盒的敏感性低。推测这可 能是 为其分子 大（约７０ ｋＩ））．包被时分子结合 数 少． 抗原表ｆ 町能会被阻挡．从而导致敏感 度下降。为了克服这个缺点，寻找更加有效的抗原 位点，提高检测的敏感性，本研究对其候选抗原表位 进行了拼接表达。为探讨其抗原活性打下基础。 １材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 试／ｆ０ ｐＥ Ｆ２８ａ（＋）表达裁体南本试验拳保 存；ｊ￡他试剂均为 产。 １．１．２ 临床标本来源 临床肺炎支原体感染患者 血清收集于中国医科大学附属第四医院，抗体效价 大于１：４０（富士瑞必欧株式会社生产的赛乐迪亚 麦可Ⅱ肺炎支原体抗体检测试剂盒）。 １．２ 办法 １．２．１ ＣＡＲＤＳ毒索蛋白基因的筛选 根据Ｇｅｎ— Ｂａｎｋ巾ＣＡＲＤＳ毒素蛋白（ＭＰＮＥ一０４３３）的轼【大ｊ序 列（（、Ｉ，Ｏ（）２０７７．１）．应Ｈ｛在线分析ｆ 具ＴＭＨＭＭ进 行分析，选取目标抗原表位进行连接，使用大肠杆菌 偏好密码子进行反向翻译后，交 【：生物］Ｉ程（卜 海）股份仃限公司合成并克隆。 １．２．２ ＣＡＲＤＳ霞组衷达载体的构建 提取克隆 重组质粒和ｐＥＴ表达载体质粒．分刖用ＢａｍＨ ｌ和 ＥｃｏＲ Ｉ舣晦切，［ｎ］收ＣＡＲＤＳ拼接基因片段和线性 ｐＥ＇ｌ、２８ａ载体，连接后转化Ｅ．ｃｏｄｉ Ｉ３Ｉ ２１（Ｉ）Ｅ３）菌株。 挑选克降蔺株进行培养，提取质粒进行酶切鉴定，筛 选得到ｐＥＴ—ＣＡＲＩ）Ｓ阳性菌株。 １．２．３ 重组ＣＡＲＩ）Ｓ毒素蛋白的诱导表达ｐＥＴ— ＣＡＲＤＳ阳性菌株培养至ＯＤ 为０．５时．加入 ＩＰＴＧ至１”ｇ／ｍＩ 绣导ｐＥＴ—ＣＡＲＩ）Ｓ阳性菌株表 达ＣＡＲＩ）Ｓ拼接蛋白．５ ｈ后菌液采样进行ＳＤＳ— Ｉ ＡＧＥ电泳鉴定。 １．２．４ 免疫印迹鉴定 诱导菌和未诱导菌进行 ＳＤＳ—ＰＡＧＥ，然后转印至纤维素膜，分别使用６ ×Ｈｉｓ单克隆抗体和人肺炎支原体阳性血清作为一 抗。使用ＨＲＰ标记的赁白Ｇ作为二抗进行免疫印 ２ 结 果 ２．１ （、ＡＲＤＳ毒索 白基ｌ大Ｊ的筛选 采川牛物学 软件ＤＮＡＭＡＮ分析得到ＣＡＲＩ）Ｓ毒素蛋白的抗原 表他（表１），选择具有亲水性的抗原表何（斜体加 粗）．使Ｊ｝Ｊ ｌｉｎｋｅｒ（厌色底纹）进行连接，得到拼接蛋 白序列： Ｉ ＭＳＷ ＬＲＥ ＹＶＰ Ｅ∞ＧＰＩ ＡＡＡ ＮＶＲ ＳＡＷ＇ＬＶＤ ＡＶＰ ＶＥＰ ＧＨＡ ＨＨＰ ＡＧＲ ４２ ４３ ＶＶＥ ＥＭＨ ＮＰＨ ＹＱＥ ＬＱＴ ＱＡＮ ＯＱＰ ＷＬＰ ＴＰＧ ＩＡＴ ＰＶＨ ＬＳＩ Ｐ０Ａ ＡＳＶ ８４ ８５ ＡＤＡ ＤＮＹ ＮＬＱ ＳＬＰ ＱＹＡ ＳＳＶ ＫＥＬ ＥＤＴ ＰＶＹ ＬＲＧ ＩＫＴ ＰＫＯ ＫＳＳ ＦＰｏ Ｉ ２６ ２７ ＦＩＦ ＦＷＤ ＶＶＱ ＲＩＣ ＬＫＤ ｒｒＱ ＹＡＧ ＱＬＫ ＶＨＬ ＳＶＳ ＡＶＮ ＡＧＷＹＷＲ ＧＹ５ Ｉ６８ ６９ＹＴＰ０ＬＳＧＹＦＳＲ ＤＬＴＩＰＳＶＥＧ ＬＮＦＲ Ｉ９３ 将拼接蛋 １和ＣＡＲＤＳ毒索蛋 经ＳＭＡＲＴ住 线分析，表明两个蛋白均含有Ｐｆａｍ：Ｐｅｒｌｕｓｓｉｓ ＳＩ 结构域，Ｅ Ｖａｌｕｅ分圳为４ｅ一３１和１．１ｔ ａ ａ ｃ ｇ Ｃ Ｃ ｇ ａ ｃ ａ Ｃ ｃ ｔ ｇ ｇ ｃ ｔ ｇ ｅ一１２６．具有高 度的相似性。 ａ ｇ ｇ ｃ ｇ ｔ ｔ ｇ ｔ ｇ ｔ Ｃ ｃ ｇ Ｃ ｇ ｔ ａ ｇ ｃ ｇ ｇ ｃ ｇ ｇ ｇ ｇ ｇ ｃ ｇ ａ ｇ ｇ ｇ ｔ ａ 然后采用大肠杆菌偏好密石Ｊｔ ｔ ａ ｃ ｇ ｇ ｇ ｔ ｇ ｇ ｔ Ｃ ａ ｇ ｇ ｔ ｇ ｔ Ｃ ｔ ａ ｇ Ｃ ｇ ａ ｇ ｃ ａ ｇ ｃ Ｃ ｇ ａ ｇ ａ ｇ Ｃ ｔ ａ ａ ｇ ｔ ｃ Ｃ ｔ ｇ ｔ ａ ａ ｃ Ｃ Ｃ Ｃ ｔ ９ ｇ ｔ ｔ ｇ ａ ａ ５子进行反向翻译，ｔ Ｃ ｃ ａ ｔ ｇ ａ ｃ Ｃ ｇ 组成５８８ ｂｐ大小的基凶序列： ｔ ｔ ａ ｇ Ｃ ｔ ｔ ｇ ａ Ｃ ｔ ａ Ｃ ｇ ａ ｔ ９ ｔ Ｃ ａ ｇ ｔ ｇ Ｃ ｇ ａ ｇ Ｃ ｇ Ｃ ｇ ｇ ａ ａ ｔ ａ ｇ ｔ ｔ ｔ ｔ ｇ ｔ ｇ Ｃ Ｃ ｔ ｔ ａ ａ ｔ Ｃ Ｃ ａ ｔ ｃ ａ ｇ ａ ａ ｃ ｇ Ｃ ｇ Ｃ ｔ ｇ ｇ ｇ ｔ ｃ ｇ ｇ ｇ ｃ ｃ ｇ Ｃ ａ ｃ ｇ ｔ ａ Ｃ ｇ ｇ ｔ ｇ Ｃ ｃ ｇ ｇ ａ Ｃ ｃ ｇ ｇ ｔ ａ ａ ａ ａ ｇ ｔ ｔ ｔ Ｃ Ｃ Ｃ ａ Ｃ ｇ ｔ ａ ｇ ｔ ｔ ｃ ａ ａ ａ ｇ ａ Ｃ ｇ ｇ Ｃ ｇ ａ ｃ ｇ ｔ ｃ ａ ｃ ａ ａ ｔ ｃ ａ Ｃ ｇ ｇ ａ ｇ ｇ ｔ ａ ｇ ａ ｃ ａ ｇ ｔ ｇ Ｃ ｃ ｔ ｇ ｇ Ｃ Ｃ ｔ ｔ Ｃ ｇ ｇ ｔ ａ Ｃ Ｃ ａ ｇ ｇ ａ Ｃ ｇ ａ ａ ｇ ｇ Ｃ ｇ ｇ ｇ ａ Ｃ Ｃ ａ Ｃ ａ ｔ ｇ ｔ Ｃ ｃ Ｃ ｔ Ｃ ｇ ｃ ｔ ｇ ｇ Ｃ Ｃ ｇ ｔ Ｃ Ｃ ｇ ａ Ｃ ａ ｇ ａ ｔ ｃ ａ ｇ ａ ａ ｇ Ｃ ｃ Ｃ Ｃ Ｃ ａ ｇ ａ ｔ ｔ Ｃ ｇ ａ ｇ Ｃ ｇ ａ ｔ ａ ｇ ｔ ｇ Ｃ ｇ ｔ ｇ Ｃ ｇ ｇ Ｃ ｃ Ｃ ｔ ａ ｇ ｔ ａ ａ ｇ ｇ ｔ ａ 将序列两端分别加上Ｂ（ｃ ｇ ｇ ａ ｔ Ｃ Ｃ ｇ ａ ｔ ｃ ｃ Ｃ ａ ｇ ｃ ｇ ａ ａ ｇ ａ １ｉ１，ｇ Ｃ ｃ １Ｈ【和Ｅ Ｒ Ｉ酶切 ｔ ｇ ｃ ｇ ａ ｇ ｇ ｇ ａ ｔ ｇ ａ 位点，送生工生物Ｔ程（ｔｇ ｔ Ｃ Ｃ Ｃ Ｃ Ｃ ｇ ａ ｇ Ｃ ａ ｇ －．海）股份有限公ｒａ ａ ｇ Ｃ ａ ａ Ｃ ｔ Ｃ ｇ ａ Ｃ ａ ａ 订合成并 ａ ｇ ａ ｇ Ｃ ｇ ａ ｔ ｔ 克隆。 ａ ｇ ｃ Ｃ ｇ ｃ ｃ ｔ ｔ Ｃ Ｃ ｇ ｇ ｔ ａ Ｃ ｇ Ｃ 七 ｇ ｇ ｇ ｔ ａ Ｃ ｇ ｇ ａ ｇ Ｃ ｃ ａ ｇ Ｃ ｇ Ｃ ｇ ｇ Ｃ ｇ ａ ｔ ｇ ｇ ａ Ｃ Ｃ ａ ａ ａ ｔ ｔ Ｃ ９ ｇ Ｃ ｇ ｇ ｇ ｔ ａ ｇ Ｃ 表１ ＣＡＲＩ）Ｓ毒素蛋白的抗原表位分析列表 （斜体加粗为选取的抗原表位） ｌ＇ａｂ．１ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｆ ＣＡＲＤＳ ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｉｔａｌｉｃｓ ｂｏｌｄ ｉｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ） ５［）（） 中国人兽共患病学报 续表 ２．２ ｐＥｑ、。ＣＡＲＤＳ表达载体的构建 构建的重组 表达质粒进行酶切鉴定．Ⅲ现６００ ｂｐ的条带，与预 期结果卡ｆ１符（图１），表明表达载体构建成功。 Ｉ Ｍ ２０００ Ｉ ５００ １（）００ ７５０ ５００ Ｍ：１）１—２０ｔ）（１ Ｍａｒｋｅｒ；１：ｒ（、ｓＩ ｒｉｏ１ｉｏｎ ｅｉ１ｚｙｎｌ（、ａＩ１ａＩ、ｒ ｉｓ 图１质粒酶切 Ｆｉｇ．１ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ２．３ ￣：ｆｉｔ ＣＡＲＤＳ毒素蛋白的诱导表达 重组阳 性菌株绛１１７＂Ｉ、Ｇ诱导后ｆ＿ｆ』现一条明显的３０ ｋＤ的蛋 白条带（ ２），与预期重组蛋 大小一敛，表明拼接 蛋 得到表达。 Ｍ ｌ ２ Ｍ：Ｉ ｒｏｔｔ、ｉｎ Ｍａｒｋｅ ｒ：１：Ｕｎｉｎｄｕｃｔ、（１ ｈａｃ ｒｉ；ｌ：！：ＩｎｄＩｌ ｃ（Ｉ ｈａｃｔｔ，ｒｉ Ｉ 图２ 蛋白的诱导表达 Ｆｉｇ．２ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ２．４ 表达蛋白的免疫印迹鉴定 Ｊｌ｝Ｊ ６×Ｈｉｓ单克隆 抗体进行免疫印迹分析，…观特件性的条带（ ３Ａ）。用人肺炎支原体阳性ｍ清作为一抗进行免嫂 分析．存３０ ｋＤ处也ｆｆＩ现特异性的条惜（图３Ｂ）。 ２ １ Ｍ Ｍ １ ２ ●一３５ ｋＩ）＿—◆ 一 瓣 ●一２５ ｋＩ）＿—◆ Ａ Ｂ Ａ：ＷＢ ｈ ’６ ＨＩＳ １１１０１１０ Ｉｏｎ ｌ１ ａｎｔｉｌＩｆ）ｌＩ ｘ；ｌ｛：Ｗｌ｛ｈ ＩＪ Ｊｎ １ Ｉ）【】 ｌｔｉｖｔ ｒＵ ｒｌｌ Ｍ：Ｐ Ｆｏ ｒｔ、ｉｎ ｍａｒｋｅｒ；１：［１ｎｉｔ１（ｈ 、（Ｉ ｈａ ｃ－ｔ‘、ｒｉ＃ｌ；２：ｈｉｄ＿】ｃ ｄ ｈａｃＩ Ⅲｉ ｌ 图３重组蛋白的免疫印迹 Ｆｉｇ．３ Ｗｅｓｔｅｒｎ——ｂｌｏｔ ｏｆ ｒＣＡＲＤＳ ３讨 论 Ｍｐ的ＣＡＲＤＳ毒素蛋 ｌｌｔ ５，９１个氨基酸构成。 其 一术端为ＡＤＰ核糖基化活化所必须． 术端和 完整的（＇ＡＲＤＳ毒素一样有诱导哺乳动物细胞窄泡 化（Ｖａｃｕｏｌｉｚａｔｉｏｎ）的作Ｈｊ ’。Ｉ大１此认为，ＣＡＲＤＳ 毒素蛋Ｆ｛可能为Ｍｐ的毒力因子，参‘ Ｍｐ的增殖、 接合・行与感染的持久化及呼｝ｌ技道炎症反应有关。 ２Ｏｌ１ Ｆ－Ｐｅｔｅｒｓ等在难治性哮喘忠并的血清标小捡 ７期 刘宝山等：肺炎支原体ＣＡＲＤＳ毒素蛋白多表位拼接抗原的表达及鉴定 ５９１ 测中发现，Ｍｐ阳性组、持续阳性组中ＣＡＲＤＳ毒素 和Ｐ１蛋白的ＩｇＭ抗体显著比Ｍｐ阴性组高，从而 表明它们具有较好的免疫性，有希望能用来发展一 种Ｍｐ的诊断方法＿９］。２０１３年Ｎｏｖｅｌｌａ等检测了相 关肺炎患者支气管灌洗液中的Ｍｐ ＣＡＲＤＳ毒素的 核酸、蛋白及血清中的抗体，结果显示，ＣＡＲＤＳ毒 素ＤＮＡ、蛋白及抗体的检出率均高于Ｐ１蛋白，约 ４Ｏ 的被检者ＣＡＲＤＳ毒素分析阳性＿】 。 Ｋａｎｎａｎ等在Ｍｐ感染的实验动物模型中，用重 组ＣＡＲＤＳ毒素蛋白和Ｐ１黏附蛋白检测感染小鼠 血清中的抗体，两种重组蛋白抗原检测的抗体效价 无明显差异＿２］。２０１５年司文等重组表达了ＣＡＲＤＳ 毒素蛋白，对肺炎支原体感染血清的ＥＬＩＳＡ试验， 发现其敏感性高于重组Ｐ１蛋白，但检测的敏感性 仍低于商品试剂＿８］。 为提高ＣＡＲＤＳ毒素蛋白作为包被抗原的敏感 性，本研究将其候选抗原表位进行了拼接，表达后可 以和肺炎患者的阳性血清发生反应，这提示其具有 较好的反应原性，可纯化后进行包被，比较敏感性的 高低。 至于拼接蛋白的反应原性是某个抗原表位的作 用，还是某些抗原表位的共同作用，以及哪个抗原表 位起主导作用，尚需要进行进一步的研究。 参考文献： Ｅｌｉ Ｌｉ ＺＷ，Ｘｉａｏ ＧＷ，Ｚｈａｎｇ ＧＸ，ｅｔ ａ１．Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｉｎ— ｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｉｎ Ｍｅｉｚｈｏｕ ａｒｅａ ｆｒｏｍ ２０１０ ｔｏ ２０１４ＥＪ］．Ｃｈｉｎ Ｊ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ，２０１６，３２（０３）：３０６—３１１．ＤＯＩ： １０．３９６９／Ｊ．ｉｓｓｎ．１００２—２６９４．２０１６．０３．０Ｉ９（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） 李舟文，肖光文，张国雄，等．梅州地区２Ｏ１０—２０１４年儿童肺炎 支原体感染及耐药情况分析［Ｊ］．中国人兽共患病学报，２０１６，３２ （０３）：３０６－３１ｌ＿ ［２］Ｋａｎｎａｎ ＴＲ，Ｋｒｉｓｈｎａｎ Ｍ，Ｒａｍａｓａｍｙ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍａｐ— ｐｉｎｇ ｏｆ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ—ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ （ＣＡＲＤＳ）ｔｏｘｉｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｄｅｆｉｎｅｓ ｒｅｇｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ＡＤＰ—ｒ｜ｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ｖａｃｕｏｌａｔｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ，２０１４，９３（３）：５６８—５８１．ＤＯＩ：１０． １１１１／ｍｍｉ．１２６８Ｏ Ｅ３］Ｗａｎｇ ＸＭ，Ｚｈｅｎｇ ＤＸ，Ｌｉａｎｇ ＳＹ，ｅｔ ａ１．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｓｓａｙｓ ｔｏ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ—ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｌｄｅｒｌｙ ｐａｔｉｅｎｔｓｒＪ］．Ｃｈｉｎ Ｊ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ，２０１５，３１（０２）：１８９—１９０． ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２—２６９４．２０１５．０２．０２１（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） 王希敏，郑东旭，梁双吟，等．老年获得性肺炎支原体感染的检 测与分析［Ｊ］．中国人兽共患病学报，２０１５，３１（０２）：１８９—１９０． Ｅ４］Ｂｅｃｋｅｒ Ａ，Ｋａｎｎａｎ ＴＲ，Ｔａｙｌｏｒ ＡＢ，ｅｔ ａ１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＣＡＲＤＳ ｔｏｘｉｎ，ａ ｕｎｉｑｕｅ ＡＤＰ—ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｎｇ ａｎｄ ｖａｃｕｏｌａｔｉｎｇ ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ ｆｒｏｍ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｆ－ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，２０１５， １１２（１６）：５１６５—５１７０．ＤＯＩ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１４２０３０８１１２ ［５］Ｓｏｍａｒａｊａｎ ＳＲ，Ａ１一Ａｓａｄｉ Ｆ，Ｒａｍａｓａｍｙ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ２ ｍｅ— ｄｉａｔｅｓ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ—ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｔｏｘｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＭＢｉｏ， ２０１４，５（４）：ｅ０１４９７－１４．ＤＯＩ：１０．１１２８／ｍ Ｂｉｏ．０１４９７—１４ ［６］ＴＲ Ｋａｎｎａｎ ＯＭ．Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ Ａｃ— ｑｕｉｒｅｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｉｓｔｒｅｓｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｔｏｘｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒｅｖｅａｌｓ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｍｉ— ｃｒｏｂｉｏｌ，２０１０，７６（５）：１１２７—１１４１．ＤＯＩ：１０．１１１１／ｊ．１３６５－２９５８． ２０１０．０７０９２．ｘ Ｅ７］Ｋａｎｎａｎ ＴＲ，Ｃｏａｌｓｏｎ ＪＪ，Ｃａｇｌｅ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕ— ｔｉｏｎ ｏｆ ＣＡＲＤＳ ｔｏｘｉｎ ｄｕｒｉｎｇ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ［Ｊ］．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２０ｌ１，２０４（１０）：１５９６—１６０４． Ｄ０Ｉ：１０．１Ｏ９３／ｉｎｆｄｉｓ／ｊｉｒ５５７ ［８］ｓｉ ｗ，Ｚｈｏｕ ＳＧ，Ｌｉｕ ＢＳ，ｅｔ ａ１．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＣＡＲＤＳ ｔｏｘｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：Ａ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ Ｊ Ｍｉ— ｃｒｏｂｉｏｌ，２０１５（１１）：１２６２—１２６５．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） 司文，周世冠，刘宝山，等．重组肺炎支原体ＣＡＲＤＳ毒素蛋白临 床检测应用的初步研究［Ｊ］．中国微生态学杂志，２０１５（１１）： １２６２—１２６５． ［９］Ｐｅｔｅｒｓ Ｊ，Ｓｉｎｇｈ Ｈ，Ｂｒｏｏｋｓ ＥＧ，ｅｔ ａ１．Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ— ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｔｏｘｉｎ—‘ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｍｙｃｏ—＿ ｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｉｎ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ａｓｔｈｍａ［Ｊ］．Ｃｈｅｓｔ，２０１１，１４０ （２）：４０１－４０７．ＤＯＩ：１０．１３７８／ｃｈｅｓｔ．１１－０２２１ ｒ１０］Ｎｏｖｅｌｌａ Ｌ，Ｓａｎｚ Ｆ，Ｆｅｒｎｄｎｄｅｚ—Ｆａｂｒｅｌｌａｓ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｉｌｄ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｄｕｅ ｔｏ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ—ａｃｑｕｉｒｅｄ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ａｄｍｉｔｔｅｄ ｔｏ ｉｃｕ［－Ｊ］．Ｃｈｅｓｔ，２０１４，１４５（３一ＭｅｅｔｉｎｇＡｂｓｔｒａｃｔｓ）：１７６Ａ．ＤＯＩ： １０．１３７８／ｃｈｅｓｔ．１７７５７７３ 收稿日期：２０１６—０６—２９编辑：张智芳
