红曲米中红曲霉的分纯及抗菌作用的研究

第３１卷第４期　广西大学学报（自然科学版）　Ｖｏ１．３１．Ｎｏ．４　２００６年１２月　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｕａｎｇｘｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ　Ｓｃｉ　Ｅｄ）　Ｄｅｃ．，２００６　文章编号：１００１—７４４５（２ＯＯ６）Ｏ４—０３１９－０３　红曲米中红曲霉的分纯及抗菌作用的研究　毛瑞丰，黄　丽，仁绍坤，王瑞恒　（广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁５３０００４）　摘要：对广西武宣一带的红曲米中的红曲霉进行分离纯化．得到了８个纯培养．初步鉴定分属３类：ＭＲ１，　ＭＲ２，ＭＲ５，ＭＲ６，ＭＲ８属于Ｍ．ｒｕｂｅｒ类（红色红曲菌）；ＭＲ３，ＭＲ７属于Ｍ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｒ类（紫色红曲菌）；ＭＲ４　属于Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ类（丛毛红曲菌）．以大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ），枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ），金黄色葡萄球菌　（Ｓｔａｐｈ３，ｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ），酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ），青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）为供试菌，运用滤纸片法对　红曲霉培养液的抗菌效果进行检测．结果表明：红曲霉的培养液对细菌的抗菌效果明显，尤其是对革兰氏阳性　菌一枯草芽孢杆菌抗菌能力较强；而对酵母和霉菌则无抗菌效果．获得了抗菌效果较好的３个红曲霉菌株　作用．　・　关键词：红曲霉；分离纯化；抗菌作用　中图分类号：ＴＳ２０１．３　文献标识码：Ａ　１９８１年，Ｈ．Ｃ．Ｗｏｎｇ等证实Ｍｏｎａｓｃｕｓ　ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ能产生具有抗菌作用的活性物质．１９９１年，董明盛　等用红曲霉培养物对１４种食品中易污染的微生物进行抗菌试验，发现其对蜡状芽孢杆菌，金黄色葡萄　球菌，萤光假单胞菌有较强的抗菌作用；对绿脓杆菌，鸡白痢杆菌，大肠杆菌有一定抗菌作用［１］．　王柏琴等利用红曲色素对肉制品中常见的肉毒梭状芽孢杆菌进行了抗菌试验，开始了在香肠制品　中应用红曲霉制品作为天然防腐剂的研究Ｌ２］．近年，日本开始在鱼、肉保鲜中大量应用红曲色素，并获得　了许多专利［３］．红曲中的生理活性物质的研究引人注目［４］．由中国食品发酵工业研究所承担的“九五”　国家重点科技攻关计划专题“红曲防腐剂的研制与生产”，已经选育了一支防腐效果好的生产菌株，完成　了发酵工艺优化，红曲防腐剂精制方法研究，并且进行了红曲防腐剂的应用研究［ｓ］，红曲具有抗菌能力　己经被大量研究所证实，但关于广西红曲［６］的抗菌作用，尚未发现详细报道．本文用纯化的红曲霉菌株　进行抗菌实验，从中选取抗菌能力较强的菌株，为广西红曲的研究提供一些相关的资料．　１　实验材料　（１）抗菌试验的供试菌．细菌：大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ），枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ），金黄色葡萄球　菌（Ｓｔａｐｈ）　ｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）．酵母：酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）．霉菌：青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）．以上　菌种均来自广西大学轻工与食品工程学院食品系微生物实验室．（２）红曲霉菌种．取广西武宣地区居民　制作红糟酸所用的发酵剂红曲米，经活化，富集，分纯获得的菌株．（３）培养基．富集活化液：１２。Ｂｘ米曲　汁９００　ｍＬ，乳酸７　ｍＬ，无水乙醇１００　ｍＬ，于１２１℃灭菌２０　ｍｉｎ，使用时以无菌操作加入３０　ｐｐｍ链霉素．　ＭＥＡ培养基：麦芽粉２０　ｇ，蛋白胨１　ｇ，葡萄糖２０　ｇ，琼脂１５　ｇ，蒸馏水１　０００　ｍＬ，１２１℃灭菌３０　ｍｉｎ．　２研究方法　（１）红曲霉分纯．取红曲米２５粒放入１００　ｍＬ富集活化液中，３０＂Ｃ培养５　ｄ．采用米曲汁琼脂培养基，　对数稀释倾注法分纯．挑取生长迅速，健壮的菌落，放到富集活化液中继续富集活化，待培养５　ｄ后重复　收稿日期：２００６—０８—１２；　修订日期：２００６—１０—１７　基金项目：广西大学科研基金（ｘＯ３２ＯＯ９）　作者简介：毛瑞丰（１９６３一），男，广西桂林人．广西大学轻工与食品学院讲师．　维普资讯 http://www.cqvip.com

３２０　广西大学学报（自然科学版）　第３１卷　上述操作．经过多次操作得到红曲霉纯培养．形态观察作属的鉴定．　（２）抗菌实验．供试菌包括了原核微生物，真核微生物．原核微生物中包括了革兰氏阳性，革兰氏阴　性，有芽孢，无芽孢细菌．大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，３５　Ｃ培　养２４　ｈ．酿酒酵母，青霉用ＰＤＡ一马铃薯蔗糖培养基，３０℃培养２４　ｈ．纯化的红曲霉菌株接种于米曲汁培　养基制成红曲霉培养液．采用滤纸片法进行抗菌实验Ｌ７］．　３结果与分析　（１）红曲霉的分离纯化．根据群体形态，个体形态观察结果，得到了８个红曲霉纯培养　］，分别编号　为：ＭＲ１，ＭＲ２，ＭＲ３，ＭＲ４，ＭＲ５，ＭＲ６，ＭＲ７，ＭＲ８．　根据１９９２年ＡＴＣＣ真菌目录，红曲霉菌主要可分为三大类．对所得的８个菌株进行分类［９］．分类的　结果见表１．　表１菌株分类的结果　类别　ＭＥＡ上的菌落直径（　）　色素颗粒　菌株编号　（２）红曲霉抗菌实验结果．利用滤纸片法对８个红曲霉的培养液进行抗菌实验．经过４个批次的实　验，发现在本实验条件下各红曲霉菌株的培养液对酵母和霉菌没有抗菌效果，而对细菌具有较强的抗菌　效果。为了验证红曲培养液中起抗菌作用的是红曲霉培养生成的成分，而不是培养液的作用．分别以无　水乙醇、米曲汁、蒸馏水对供试菌进行了空白实验．实验结果表明：３种溶液对各种供试菌均无抗菌作　用．这说明抗菌物质是与红曲培养相关的某种或某些成分，本实验中抗菌作用并非来自乙醇和米曲汁培　养液．　同时用卡尺测量抑菌圈的平均直径（外径）的大小，所得的结果如表２．表中“＋＋＋”——表示抗菌　效果强，“＋＋”——表示较强，“＋”——表示有一定的效果，“一”——表示无抗菌效果，下同。　表２各分纯红曲霉培养液对供试菌抑菌圈外直径平均值（ｄ）　从表２可以看出，ＭＲ１，ＭＲ２，ＭＲ３培养液的抗菌效果最好．所以选取这３个菌株进行进一步的研　究．把ＭＲ１，ＭＲ２，ＭＲ３分别用米曲汁培养基（不加入无水乙醇），３０　Ｃ培养５　ｄ，用细菌（大肠杆菌，枯草　芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌）为供试菌作抗菌实验，经过３个批次的实验，所得的结果如表３．　表３　ＭＲ１，ＭＲ２，ＭＲ３培养液对供试菌抑菌圈外直径平均值　对照表２，表３可看出，不加无水乙醇的培养液的抗菌效果没有加入了无水乙醇的培养液效果好．　４结论　（１）从广西武宣一带的红曲米中分离纯化得到了８个红曲霉菌株．ＭＲ１，ＭＲ２，ＭＲ５，ＭＲ６，ＭＲ８　维普资讯 http://www.cqvip.com

第４期　毛瑞丰等：红曲米中红曲霉的分纯及抗菌作用的研究　３２１　为Ｍ．ｔｕｂｅｒ类（红色红曲菌）；ＭＲ３，ＭＲ７为Ｍ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｒ类（紫色红曲菌）；ＭＲ４为Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ类（丛毛　红曲菌）．　（２）广西红曲菌具有一定的抗菌能力．分纯的红曲霉培养液对细菌的抗菌能力较强，对革兰氏阳性　菌一枯草芽孢杆菌的抗菌能力比对阴性菌一大肠杆菌强．而对酵母和青霉无抗菌效果．研究结果与董明　盛等［１们的研究结果一致．说明不同红曲霉菌株的抗菌谱存在相似性．　（３）乙醇对红曲霉培养液的抗菌作用有一定的影响．这些影响可能是：第一，乙醇使抗菌物质在红曲　霉细胞表面的通透性增加，增强了培养液的抗菌效果；第二，乙醇对红曲霉抗菌物质的产生有一定的诱　导作用；第三，乙醇增强了红曲霉产生的抗菌物质的抗菌能力．这些问题有待进一步的研究．　（４）在米曲汁中加入一定比例的乳酸和无水乙醇，可以有效抑制腐败菌的生长．加入链霉素，可以　抑制细菌、线菌的生长．有利于红曲米中红曲霉的富集纯化．　（５）本文仅对红曲霉培养液的抗菌作用进行了研究．关于抗菌物质的确定，其性质、提取和利用有　待进一步的研究．　参考文献：　［１］董明盛，沈昌，沈爱光．红曲抑菌作用的探讨［Ｊ］．中国调味品，１９９１，（１）：ｌｌ一１２．　克．红曲色素，乳酸链球菌素，山梨酸钾对肉毒梭状芽孢杆菌的抑菌研究［Ｊ］．食品与发酵工　［２］王柏琴，杨洁彬，刘［３］贾业，１９９５，（６）：２９—３２，２８．　波，周立平．红曲霉研究之现状及发展前景［Ｊ］．中国食品添加剂，２００２，（６）：３２—３５．　・　哲．红曲防腐剂的研究［Ｊ］．实用技术市场，２００１，（１）：２５—２６．　［４］董群义．红曲霉产生的生理活性物质研究进展［Ｊ］．食品科学，２００３，２４（１）：１６３—１６７．　［５］秦人伟，王异静，董［６］毛瑞丰．红曲米中红曲霉的分纯及红曲色素测定［Ｊ］．广西轻工业，２００３，（１）：２９—３０．　［７］张治锬．抗生素药品检验［Ｍ］．北京：人民卫生出版社，１９８７．　［８］　魏景超．真菌鉴定手册［Ｍ］．上海：上海科学技术出版社，１９７９．　［９］Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ　Ｄ　Ｌ，Ｐｉｔｔ　Ｊ　１．Ａ　ｎｅｗ　ｔａｘｏｎｏｍｙ　ｆｏｒ　ｍｏｎａｓｃｕｓ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｃｕｌｔｕｒｏｌ　ａｎｄ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ　［Ｊ］．Ａｕｓｔ　Ｊ　Ｂｏｔ，１９８３，３１：５１—６１．　［１Ｏ］董群义，高孔荣．红曲色素抑菌作用的研究［Ｊ］．食品工业科技，１９９７，（５）：５－６．　Ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｎａｓｃｕｓ　ｉｎ　ｒｅｄ——ｙｅａｓｔ－－ｒｉｃｅ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｎｔｉ—ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ＭＡＯ　Ｒｕｉ—ｆｅｎｇ，ＨＵＡＮＧ　Ｌｉ，ＲＥＮ　Ｓｈａｏ—ｋｕｎ，ＷＡＮＧ　Ｒｕｉ—ｈｅｎｇ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｇｈｔ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｆｏｏｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｇｕａｎｇｘｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｎｉｎｇ　５３０００４，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：８　ｐｕｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｒｅｄ—ｙｅａｓｔ—ｒｉｃｅ　ｆｒｏｍ　Ｇｕａｎｇｘｉ，　Ｗｕｘｕａｎ．Ｔｈｏｓｅ　ｂｅｌｏｎｇ　ｔｏ　３　ｋｉｎｄｓ　ａｆｔｅｒ　ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ　ａｒｅ　ＭＲ１，ＭＲ２，ＭＲ５，　ＭＲ６，ＭＲ８　ａｔｔｒｉｂｕｔｅ　ｔｏ　Ｍ．ｔｕｂｅ；ＭＲ３，ＭＲ７　ｔｏ　Ｍ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｒ；ＭＲ４　ｔｏ　Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ．Ｅ．ｃｏｌ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓ　ｂｔｉｌｉｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ａｓ　ｔｅｓｔ　ｍａｔｅｒｉａ１，ｔｈｅ　ａｎｔｉ—ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｉｎｏｃｕｌｕｍ　ｏｆ　ｍｏｎａｓｃｕｓ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｆｉｌｔｅｒ　ｐａｐｅｒ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｔ。ｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｉｎｏｃｕｌｕｍ　ｏｆ　ｍｏｎａｓｃｕｓ　ｈａｄ　ｓｔｒｏｎｇ　ａｎｔｉ—ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｉｎ　ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ　ｔｏ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｇｒａｍ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｓｔｒａｉｎｓ—　ｂａｃｉｌｌｕＳ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ．Ｂｕｔ　ｔｏ　ｙｅａｓｔ　ａｎｄ　ｍｏｌｄ　ｈａｄ　ｎｏ　ｒｅｓｉｓｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ１　ｅｆｆｅｃｔ．Ｔｈｅ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｐｒｏｖｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎ　ｈａｓ　ａｌｓｏ　ａｎｔｉ—ｂａｃｔｅｒｉａ１　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｆｔｅｒ　３　ａｎｔｉ—ｂａｃｔｅｒｉａ１　ｓｔｒａｉｎｓ　ｈａｄ　ｂｅｅｎ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｍｏｎａｓｃｕｓ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ａｎｔｉ—ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　（责任编辑唐汉民）