细菌内毒素检查法及其在药品检验中的应用进展

２００２年２月　中国宴验动物学杂志　ＣＨＩＮＥＳＥ　ＪＯＵＲＸＡ［　ＯＦ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＡＮＩＭＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥＳ　Ｆｅｂ…２００２　第１２卷第１期　Ｖｏｌ＿ｌ２　Ｎ０ｌ　Ｉ综述与专论；　，　、　细菌内毒素检查法及其在药品检验中的应用进展　黄清泉　李冠民　（中国药品生物制品检定所北京１０００５０）　【摘要】本文综述了鲎试验凝集反应机理、鲎试剂和内毒素标准品的研制及其在药品检验中的应用进展。　【关键词】　细菌内毒素；鲎试验　【中图分类号ｌ　３３７　【文献标识码ｌｅ　【文章编号１［００２～１４８５［２００２］０１—００５１—０３　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ　Ｔｅｓｔ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　ＨＵＡＮＧ　Ｑｉｎｇｑｕａｎ，ＬＩ　Ｇｕａｎｍｉｎ　（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　０ｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００５０，Ｃｈｉｎａ）　【Ａｂｓｔｒａｃｔｌ　Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ａｒｔｉｃ￣．ｔｈｅ　ａｕｔｈｏｒｓ　ｒｅｖｉｅｗ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｇｅｌ－ｃｌｏｔ　ｉｎ　ｌｉｍｕｌｕｓ　ｔｅｓｔ．Ｅｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｌｉｍｕ　ｈｓ　ａｎｌｅｂｏｃｙ￣　ａｔｅ　ａｎｄ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ｓｔａｎｄａｒｄ．ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ　ｔｅｓｌ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｐＭｒｍａｃｅｕｌｉｅａｌｓ．　【Ｋｅｙ　ｗ￣ｒｄｓ１　Ｂａｅｔｏｒｉｄ　ｅｎｄ￣ｔｏｘｉｎｓ；ｕｍｄ∞ｋ　细菌内毒素检查法（Ｂａｃｔｅｒｉｌａ　Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ　Ｔｅｓｔ，　ＢＥＴ）自１９６８年由美国学者Ｂａｎｇ和Ｌｅｖｉｎ正式建立　（该法又称作鲎试验．即Ｌｉｍｕｌｕｓ　ｌｅｓｔ）。ｌ　Ｊ至今，经过３０　多年的不断完善和发展，现巳在医药卫生、环境保护　Ｂ因子为活化的Ｂ因子，活化的Ｂ因子激活凝固酶　原为凝固酶，凝固酶激活凝固蛋白原为凝固蛋白。　１９８１年Ｍｏｒｉｔａ从鲎试剂中分离出Ｇ因子，同年Ｋａｋｉ—　ｎＵｎ＇ｌａ等证明一种抗肿瘤物质即１，３一Ｓ．Ｄ．ｇｌｕｃａｎ可以　激活Ｇ因子为活化的Ｇ因子，活化的Ｇ因子激活凝　等方面发挥着极其重要的作用，下面就细菌内毒素　检查法及其在药品检验中的某些进展综述如下一　１凝集反应机理的研究　固酶原为凝固酶，凝固酶激活凝固蛋白原为凝固蛋　白　，阐明了凝集反应的另一条途径，后经发展，成　为目前公认的反应机理。　２试剂的研制　２．１鲎试剂　１９６８年Ｌｅｖｉｎ和Ｂａｎｇ根据他们的实验结果认　为内毒素在Ｃａ“的作用下直接激活鲎试剂中的凝　固酶原为凝固酶，凝固酶激活凝固蛋白原为凝固蛋　白…。１９８０年，Ｍａｋｏｌｏ等报道鲎试验的基本原理为　内毒索和ｃａ　、Ｍ　同鲎试剂中的Ｂ因子、凝固酶　从鲎试剂与内毒素反应的机理可知，内毒素并　不是唯一能使鲎试剂产生凝集反应的物质，类似（１，　３）．Ｂ．Ｄ．ｇｌｕｃａｎ的物质也能使鲎试剂产生凝集反应，　原、凝固蛋白原等发生一系列酶催化的级联反应，即　内毒素在Ｃａ”、Ｍｇ２　的作用下首先激活鲎试剂中的　作者筒介：黄清泉．男（Ｉ９６６－）　丰管药师．从事药品细菌内毒素　检查　通常称为旁路反应。类似（１，３）　Ｄ—ｇｌｕｏａｎ的物质　广泛存在于担子菌、真菌、地衣类、酵母和藻类的菌　体成分中．其含量在１０　ｎｇ／ｍｌ时就可使普通鲎试剂　产生凝集反应　。　维普资讯 http://www.cqvip.com

５２　中国实验动物学杂忐２ｏ０２年２月第１２卷第１期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｌａｂ　Ａｎｉａｔ　Ｓｅｉ，Ｆｅｂｒａｍ．＇２００２，Ｖｏ］１２　Ｎｏ　目前，有两种鲎试剂供凝胶法使用，一种是特异　性鲎试剂（分两种：一种是不含Ｇ因子的，另一种是　Ｇ因子被封闭的）是一种只对内毒素起反应．而对类　似（１，３）一ｐ－Ｄ一对ｕｃａｎ的物质不起反应的鲎试剂。另　一种是普通鲎试剂又叫全成分鲎试剂，是一种既对　内毒素，又对类似（１，３１廿Ｄ—ｇ，ｌ￣ｏ．ｏ多糖的物质起反　应的鲎试剂：　最初的鲎试剂只有普通鲎试剂，即没有去除Ｇ　因子或阻断Ｇ因子的鲎试剂。后来经过深Ａ研究，　发现Ｇ因子的旁路反应而影响检测结果，为了消除　Ｇ因子的影响，人们研制了具有特异性的鲎试剂，分　为弃Ｇ因子鲎试剂和特异性鲎试剂。现在又有了　用于动态浊度法和显色基色法的鲎试剂。用于动态　浊度法的鲎试剂与用于凝胶法的鲎试剂在组成上略　有差异，而用于显色基质法的鲎试剂需加入鲎三肽。　近年来，国内研制出了能抗抑制作用或抗增强作用　的试剂　２．２标准物质——内毒素标准品　２　２．１标准内毒素的研制　美国于１９７６年用大肠埃希氏菌［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｏ１１３：Ｈ１０：Ｋ（。）ｖｅ　内毒素制成第一批参考标准内　毒素（ＲＳＥ，代号为ＥＣ。１）　ＥＣ。１是以重量单位表示　的，每瓶１，ｕｇ。１９８０年美国学者Ｈｏｃｈｓｔｅｉｎ　用Ｅｃ一２　完成了ＲＳＥ的单位由重量单位向效价单位（ＥＵ）的　转换。１９８２年ＵＳＰＣ修订ＵＳＰ　２０版时，正式引入内　毒素单位（Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　Ｕｎｉｔ，ＥＵ）。至今己过渡到ＥＣ一　６，其赋形剂为乳糖：聚乙二醇（１０：１），每瓶１０　０００　ＥＵ。　２．２．２国际内毒素标准品的建立　１９７８年ＷＨＯ生物标准化专家委员会建议由英　国国家生物标准检定所（ＮＩＢＳＣ）研制一批细菌内毒　素国际参考品。１９８０年底对其研制的候选品进行　国际协作标定，由ｌ６个国家４３个实验室参加，１９８１　年４月，ＮＩＢＳＣ将４０个实验室的结果进行统计分　析，由于结果分散、差异大而被陶汰。１９８５年ＮＩＢＳＣ　重新组织国际协作标定，用于标定的候选品是以美　国制备ＥＣ系列的内毒素为原料，加入海藻糖冻干，　熔封安瓶（编号８４１６５０），每瓶２，ｕｇ。８４／６５０经１２个　国家３７个实验室协作标定，于１９８６年底结束，协作　标定结果经ＷＨＯ生物标准化专家委员会审查后，　正式确定为第一批内毒素国际标准品（ＩＳ１，８４／６５０），　每瓶１４　０００ＩＵ，于１９８７年启用　：Ｉｓｌ与ＥＣ。５在效　价上存在一定差异，即０．７　Ｉｕ＝１．０　ＥＵ，仍然无法实　现国际间的统一。１９９５年ＮＩＢＳＣ再次组织国际协　作标定，这次标定以ＥＣ一５为基准，新制备的一批国　际标准品候选品在装量与赋形剂上与Ｅｃ一５完全一　致，包装改为西林瓶，经ｌ２个国家２６个实验室，以　凝胶法、显色基质法、动态浊度法标定，标定结果经　ＷＨＯ生物标准化专家委员会第４６次会议审定，确　定为第二批内毒素国际标准品（ＩＳ２，９４／５８０），每瓶效　价为１００００　ＩＵ，可用于内毒素的定性、定量测定，并　规定１　ＩＵ＝１　ＥＬ：从此内毒素测定在国际上有了一　个统一的标准品　。　２．２　３中国内毒素标准品的研制进展　１９７９年７月国家卫生部科技局、药政局将制备　内毒素标准品的任务下达给卫生部上海生物制品研　究所：１９８１年中国药品生物制品检定所（下称中检　所）与该所完成会同检定，报卫生部批准后，建立了　中国第一批内毒素标准品，批号定为７９。５，规格为每　瓶２５０　。此批标准品未加Ａ赋形剂。　１９８６年以ＥＣ一５为基准标定了由中检所制备的　一批候选品，经卫生部审查后发放，批号为８６３，每　瓶１０　０００　ＥＵ。这是我国第一次引入内毒素单位，随　后又以Ｉｓ为基准，在国内组织协作标定，先后发放　了第三至第六批细菌内毒素标准品。第三批赋形剂　为人血白蛋白，以ＩＳ１（８４１６５０）为基准，采用凝胶法　经国内协作标定，其效价确定为每安瓿２０　０００　ＥＵ，　批号为８９６。第四、五两批赋形剂为人血白蛋白，以　ＩＳ１（８４１６５０）为基准，采用凝胶法经国内掷作标定，其　效价分别为每安瓿１２　０００　ＥＵ（批号为９２４）、７　２００　ＥＵ　（批号为９６２）。第六批赋形剂同ＩＳ２（９４１５８０），以ＩＳ２　（９４１５８０）为基准，经过国内１１个实验室采用凝胶　法、显色基质法、动态浊度法等三种方法进行协作标　定，确定代号为Ｂ的候选品为第六批细菌内毒素标　准品，批号为９８１，效价为每支９　０００　ＥＬＩ。９８１是我国　可供定量测定的第一批内毒素标准品。　３方法学研究　３．１方法多样化　１９８０年美国药典最先收载了凝胶法，此法操作　简单，为目前最经典且最普及的方法。美国药典、欧　洲药典、日本药典、中国药典均规定凝胶法为仲裁方　法。在美国，巳得到ＦＤＡ批准使用的方法还有动态　浊度法、显色基质法、终点浊度法　，这些方法都是　目前应用发展最快的方法，其主要优点是能定量，干　扰少，速度快。此外，近年来报道较新的方法有火箭　维普资讯 http://www.cqvip.com

中国实验动物学杂志２００２年２月第１２卷第１期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｌａｂ　ＡｎＪｍ　Ｓｅｉ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ　２００２．ＶＯｆ　１２．Ｎｏ　５３　电泳免疫法（测残余蛋白），酶联免疫吸附法（测残余　酶）．细胞因子法。　３．２方法自动化　为了适应仪器自动操作及数据处理．近年来动　态显色基质法、动态浊度法巳实现仪器自动化检测：　这两种方法都需要特殊的仪器，如美国ＬＡＩＡ０００、美　国Ｌ￣ＬＳＯ００、美国Ｌ￣Ｌ５４０００Ｅ、日本的Ｔｏｘｉｎｏｍｅ—　ｔｅｒ２０１、中国的ＢＥＴ－３２型细菌内毒素测定仪　。　３．３方法微量化　检查所需的试剂量和样品量越来越少。如酶联　免疫吸附法，所需鲎试剂的量只相当于凝胶法的ｌ／　１００，而且灵敏度越来越高．抗干扰能力强。　４应用进展　细菌内毒素检查法在药品检验中的应用是从放　射性药品和注射用水开始的。这是由于放射性药品　家兔热原检查中，３　ｈ的试验周期、试验的大剂量引　起的辐射生物效应和对操作人员的辐射、放射性污　染和废物处理等问题首先提出采用这一新方法　的　，而注射用水对该法不存在干扰　１９８３年　ＵＳＰ２０版第四增补本首次规定５种水和４０种放射　性药品采用细菌内毒素检查法代替热原检查法，中　国药典１９９０年也首次规定了两种放射性药品进行　内毒素检查　。随着扩大应用的不断深人，这一方　法逐渐应用于抗生素　生化药品、化学药品、血液制　品、基因工程药物等的细菌内毒素检查。此外，还应　用于医疗器械（如一次性输液器、输血器、注射器．人　工晶体等）、临床（各种体液如血浆、脑脊液、尿液、关　节液、泪液）、环境保护（如各种水源）、食品卫生（如　奶制品）。近年来，在我国细菌内毒素检查法还用于　中药注射制剂的质量控制中　。　细菌内毒素检查除用于药品终产品的质量控制　外，而且常用于药品生产过程中作为质量监控的手　段。鲎试剂应用于中间产品的检测可及早发现不合　格的中间产品，并确定污染生产的具体环节和原因，　以便及时纠正，避免成品报废，减少损失。　下面介绍一下美国药典和中国药典收载细菌内　毒素检查的品种情况　１９８０年ＵＳＰ２０版首次收载细菌内毒素检查　法　，１９８３年ＵＳＰ２０版第四增补本规定５种水和４０　种放射性药品采用细菌内毒素检查法代替热原检查　法。１９９１年，ＵＳＰ２２版第五增补本又规定１８５种药　品采用细菌内毒素检查法代替热原检查法。１９９５　年，ＵＳＰ２３规定４７１种药品进行细菌内毒素检查．保　留热原检查的品种不足４０种　。美国药典２４版共　收载５７９种药品进行细菌内毒素检查。　中国药典１９９０年版首次规定了两种放射性药　品进行内毒素检查　，１９９３年中国药典１９９０年版　第二增补本开始收载细菌内毒素检查法　。１９９５　年，中国药典１９９５年版规定１３个品种进行细菌内　毒素检查。中国药典２０００年版共收载６９种药品进　行细菌内毒素检查。　此外，英国、意大利、德国药典，欧洲药典以及日　本药局方都巳收载细菌内毒素检查法，但规定的品　种各有不同。一个共同的特点是注射用水是最先收　载的品种。　参　考　文　献　ｌ　１　Ｊ　Ｌｅｖｌｎ　Ｊ．Ｂａｎｇ　ＦＢ　Ｃｌｏｔ／ａｂｌｅ　ｐｍｌｅｉｎ　ｉｎ］ｉｅａｕｌｕｓ：ｉｔｓ　ｌ０ｃ　ｉｚ　ｉ０ｎ　ａｎｄ　ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｉｔｓ　ｃ￣ｇｕｌａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　１ｌｈＴＤｍｂ０ｓ　Ｄｉａｔｈｅｓ　Ｈａｅｍｏｒｒｈ　１９６８　１９：１８６—９７　【２　Ｊ　Ｋａｋｉｎ￣Ａ，Ａ　ｓⅡｌ１１）Ｉ．Ｔ　Ｔｏｆｉｉ　Ｈ．ｅｔ　ａｌ　Ｇｅｌａｌｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｍｕｌｕｓ　ａｍ　ｂ０一　ｃ，ａｅ　ｌｙｓａｔｅ　ｂｙ　ｎ　ａＩｌ　ＴｆＨ｝Ｉ（１—３）－０－Ｄ－ｇｌｅａｎ　Ｂｉｏｃｈ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈ　Ｒ　Ｃ０…１９８Ｉ　１０１　１４３４—４３９　３］　黄清泉特异性鲎试剂和普通鲎试剂测定自来水　蒸馏木和Ｉ＾　菌注射用水中细菌内毒素的对｝匕中国海洋药暂　１９９９，１８：２５　［４］　夏振民内毒寨标准品期源．第一届全国细菌内毒素柱查法研　究与应用学术会议论文厦摘要汇编．宁披．１９９７，ｌ４４　【５　Ｈａｃｈｓｔｅｉｎ　ＨＤ　Ｔｈｅ　ＬＡＬ　ｔｅｓｔ　Ｙｅ￣ｕｓ　ｔｈｅ　ｒａｂｂｉｔ　ｐｗｏｇｅｎ　ｔｅ　ｆｏｒ印ｄ０　ｔｏｘｉｎ　ｄ帅ｔＬｌⅢＰｈ盯ｍ　１　ｈ．１９８１．５　１３７　．６　Ｊ　Ｐ　ｅ　Ｓ，Ｍｕｓｍｔｔ　ＭＶ．Ｔｈｅ　ｈｌｅｍａｌｌ￣ａｌ　Ｓ￣ｄａｒｄ　ｆｏｒ　Ｅｎｄｍｏｘｉｎ：　－　ｕａｆｉ０Ⅱｉｎ明ｉｎｔｅｍａｆｔｏｎａｌ￣ｌ　Ｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　ｓｔｄｎｖ　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｓｔｍ］ｄ　１９８９　Ｉ７：　１６１　７１　［１］‰ｌｅ　ｓ　Ｄ…Ｐ，Ｃ．ｓｇ￣ｓ　Ｄ∞Ｒ　Ｅ　Ｓｅ￣ｎｄｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｓｔ￣ｄａｒｄ　ｆｏｒ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ：ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ　ｉｎ帅ｉｎｔｅｎ］ａｌｉ￣ａｌ￣ｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　ｓｔｕｄｙ　Ｊ　ＥｎｄｏｔｏｘＪｎ　Ｒｅｓ￣ｈ　１９９７．４：２２１　ｌ　８　Ｊ　Ｕ　Ｓ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　ｈ　…　．Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｈｈ　Ｓｅｒ－　ｃｅ．Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ　ｌⅢｔｈｅ　ｖａ［ｉｄａｔｉｏｎ　ｔｈｅ　ＬＡＬ　ｅｎｄ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ｎ　ｆｏｒ　ｈｍｎ阴ａｎｄ　ａｎｉｍａｌ　ｐ￣ｎｔｅｒ・　ａｌ　ｄｒｕｇｓ．ｂ［ｏｌ　０ｇｉｅｅｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ａｎｄ　ｍｅｄｉｃａｌ　ｄｅｖｉｃｅｓ一１９８７　［９］黄清泉，王思理浅诚药品细菌内毒素的定量测定中国药　房　１９９８，９：４０　［１０］　黄清泉　夏振民我国放射性药品细菌内毒素检查法的近况　中国药学杂志，１９９４，２９：５９４　：ｌ１］中国药典１９９Ｏ年版二部１９９０，５８７—５９１　［１２］　王晓蕾，吕晓川清开是注射液细菌内毒素检查的研究药物　分析杂志　１９９９．Ｉ８（增刊）：５０　Ｌ　Ｉ３　Ｂ￣ｔｅｒｌａｌ　Ｅｎｄｏｔｏｓｇｎｓ　Ｔｂｔ　ＵＳＰ　２０＆ＮＦ１５　１９∞，８８８　Ｌ　ｌ４　Ｊ　Ｂｅｅｔｅｒｉａｌ　Ｅｎｄｃ４ｏｘｉｎｓ　Ｔ　ＬＩＳｐ　２３＆ＮＦ　Ｉ８　１９９５．１４９６　［１５］细菌内毒素检查法中国药典１９９０年版第二增补本１９９３．５７　［收稿日期】：２００１—０２—２０