RT-PCR全过程步骤

RT—PCR全过程步骤

一．试剂材料准备

1、塑料制品：(包括头、EP管、匀浆管等）

先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将头等放入吸头台，再高压一次（EP管)

2、玻璃制品:泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）(洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）

3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC)

三、试剂配制：

1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水,放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。

2、75%乙醇：用无水乙醇 DEPC水配，然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压）

3、异丙醇：放入棕色瓶中

4、氯仿：放入棕色瓶中

5、琼脂糖

二．总RNA提取

1. 取100mg组织，放到1。5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。

（1)液氮研磨，组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按 50—100mg 组织/ml Trizol 加入 Trizol，转入离心管进行第 2 步操作。

(2） 匀浆：组织样品按 50—100mg/mlTrizol 加入 Trizol。另外,组织体积不能超过 Trizol 体积的 10％，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需 1—2 分钟.

2. 震荡30s，室温放置 5min，使其充解。12，000rpm 离心 5min，弃沉淀。

3. 加0.2ml氯仿，摇动30s,室温5-10min。注：禁用漩涡振荡器,以免基因组 DNA 断裂。

4。 12000×g，4℃离心,15min。

5. 吸上层无色水相,移入另一EP管中（约0.5ml）。

6. 加等体积异丙醇，室温放置 5—10min。

7。 12000×g,4℃离心,10min。在管底部可见微量RNA沉淀

8. 弃上清，加冰预冷75%乙醇1ml，温和振荡，悬浮沉淀。

9. 8000×g,4℃离心，10min。

10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体,室温干燥5—10min。

11. 沉淀溶于20μlDEPC水（可用20ul H2O,TE buffer或 0。5%SDS溶解RNA样品，55-60℃,5—10min。注：H2O、TE或 0.5%SDS均须用DEPC处理并高压.),取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD280

12. 计算浓度与纯度，—70℃保存。

三、逆转录合成cDNA第一链

反应体系如下

总体系20μl

约3μgRNA量+1μl Oligo dT+water=12μl

5*RTbuffer 4μl

dNTP 2μl

RNase inhibitor 1μl

AMV Reverse Transpase 1μl

温度42℃ 1小时

冰上配制混匀快速离心一次

反应条件如下

-20℃ 冰箱冻存

四、PCR反应

混匀快速离心一次

反应条件如下

PCR产物—20℃冰箱保存

取PCR产物8μl 加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V。

100mA 30min 溴化乙锭染色,凝胶成象仪成象并保存结果。