秋水仙碱处理大葱愈伤组织诱导多倍体的研究

秋水仙碱处理大葱愈伤组织诱导多倍体的研究

作者：高莉敏 宗 红 陈运起 高秀云 董 飞 来源：《山东农业科学》2010年第12期

摘要：试验采用秋水仙碱加入培养基和秋水仙碱溶液浸泡处理大蒜愈伤组织，经染色体数目鉴定表明，这两种方法都能有效地诱导四倍体细胞。加入培养基法在诱导率和操作上都优于液体浸泡法。其中以在培养基中加入0.08％秋水仙碱，处理4 d的诱导效果较好，加倍率达26.0％。

关键词：秋水仙碱；大葱；愈伤组织；多倍体

中图分类号：S633.1；S335.3 文献标识号：A 文章编号：1001—4942(2010)12—0015—03

秋水仙碱是一种化学诱变剂，它与离体培养相结合能够加大多倍体的变异频率。张兴平等(1994)在西瓜幼胚子叶不定芽再生的前7d，在再生培养基中添加0.05％的秋水仙碱，大大提高了组织培养再生四倍体的频率和效率。郭启高等(2000)用秋水仙碱溶液处理培养材料并在西瓜芽再生培养基中添加6-BA，即可产生高频率的四倍体变异。本研究利用离体培养与秋水仙碱相结合获得了大葱多倍体细胞，为大葱多倍体育种奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

组织培养的外植体材料为章丘大葱的成熟种子；离体诱导多倍体的材料为章丘大葱成熟胚培养继代一次的愈伤组织；细胞学观察取培养中旺盛的愈伤组织。

1.2 试验方法

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1.2.1 无菌外植体的获得 先将种子用自来水冲洗10min，在无菌室超净工作台上用75％酒精漂洗30～60s，转至0.1％升汞中消毒8～10min，最后用无菌水冲洗3～4次，在无菌状态下催芽，至芽长1cm左右时待用。

1.2.2 培养条件 以MS培养基为基本培养基，另外分别添加2，4-D、KT、6-BA、NAA，蔗糖3％，琼脂0.9％，pH5.9～6.0，于高压自动灭菌锅中消毒20min。培养温度为(25±1)℃，除愈伤组织诱导在黑暗条件下外，光照均为3000lx，每天光照12h。 诱导培养基：MS+2.0mg／L 2，4-D+1.0mg／L 6-BA 分化培养基：MS+1.5mg／L6-BA

1.2.3 处理方法 秋水仙碱处理按陈伯君等(2000)采用的两种处理方法：

(1)秋水仙碱加入培养基法：从继代培养中选择浅黄色的愈伤组织切成约0.2m3左右的小块，转入含有秋水仙碱浓度分别为0.04％、0.06％、0.08％、0.10％、0.12％的愈伤组织诱导培养基中，处理时间分别为2、4、6d，共15个组合。处理完毕后，转入不含秋水仙碱的分化培养基中继续培养。

(2)秋水仙碱溶液浸泡法：将秋水仙碱配制成浓度分别为0.02％、0.04％、0.06％、0.08％的溶液，并进行消毒灭菌，将愈伤组织切成0.2 em3的小块，在上述溶液中分别浸泡4、8、12h后取出，无菌水冲洗3～4次后，转入分化培养基中培养。

1.2.4 愈伤组织染色体鉴定 所有处理后的愈伤组织在不含秋水仙碱的愈伤组织分化培养基中培养5d后，在无菌条件下取部分愈伤组织进行染色体鉴定。用显微镜随机观察200个相细胞，统计多倍体细胞数，计算加倍率。

2 结果与分析

2.1 秋水仙碱加入培养基法对愈伤组织多倍体的诱导

由表1可以看出，秋水仙碱处理后，不同处理均得到了四倍体细胞，其中以0.08％的秋水仙碱处理4d效果最好，加倍率达26.0％。秋水仙碱浓度过高过低均不利于提高愈伤组织细胞的加倍率。但也看出，秋水仙碱处理浓度低、时间长或浓度高、时间短时，也有利于提高愈伤组织细胞的加倍率。

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2.2 秋水仙碱溶液浸泡处理对愈伤组织多倍体的诱导

由表2可以看出，秋水仙碱溶液浸泡处理法对愈伤组织染色体加倍的诱导率稍低于秋水仙碱加入培养基法，但变化规律基本一致。秋水仙碱的处理浓度以0.06％为佳。浸泡时间以8h为好。用0.06％的秋水仙碱浸泡愈伤组织8h的多倍体诱变率最高，达到22.5％，继续升高浓度或延长时间，加倍效果呈下降趋势。

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3 讨论与结论

3.1 秋水仙碱处理愈伤组织的方法

本试验采用了秋水仙碱加入培养基法和浸泡法处理愈伤组织，二者均获得了一定频率的多倍体细胞。经过比较，发现秋水仙碱溶液浸泡法处理的死亡率较高，可能因浸泡法药液较容易渗入愈伤组织细胞中，从而抑制纺锤丝的形成，并且处理中浸泡在药液中易造成缺氧而死亡，再加上秋水仙碱的毒害性，造成死亡率较高。另外，浸泡法在愈伤组织转移过程中需要经过多次冲洗，增加了受污染的几率。秋水仙碱加入培养基法无论在诱导率还是在存活率上都优于浸泡法，这与王鸿鹤等(1999)的观点一致。但是，也有人认为浸泡法效果更佳，还有的认为将愈伤组织先浸泡，然后接种于含一定浓度的秋水仙碱的培养基中效果更好，这可能与不同试验材料有关。

3.2 秋水仙碱最佳处理浓度与时间组合的选择