发育生物学

发育生物学定义：研究生物体从精子和卵子的发生、受精、发育、生长至衰老、死亡的生命过程中的变化机理的学科。

第一节 发育生物学的发展与其他学科的关系

研究历史很长，1950年左右才形成一门学科，在胚胎学、细胞生物学、遗传学、生物化学、分子生物学的基础上建立的一门新兴学科。其发展过程：形态描述，机理探讨，从器官→组织→细胞水平→分子水平。

一．胚胎学与发育学

胚胎学是发育学发展的基础学科之一。其发展简史省略（动物胚胎学中细述）描述胚胎学→比较胚胎学→细胞胚胎学→实验胚胎学→分子胚胎学 二. 遗传学与发育生物学

两者密切相关，遗传学的发展促进了发育生物学的研究。自遗传学家提出“遗传的染色体学说”（Chromosome theory of inheritance）以来，细胞核在发育中的作用受到重视。 Morgan是遗传学家，也为胚胎学家，与他的合作者提出（1926年）“基因理论”（the theory of the gene）

1972年，Moore把Morgan遗传概念归纳为12点： 1. 遗传是由基因从父代传递到子代。 2. 基因位于染色体上。

3. 每个基因在染色体上占着一个特定的位置。

4. 在每个染色体上有很多基因，它们直线排列在染色体上。 5. 双倍体生物的体细胞中，每一种染色体有两条（同源染色体），因此每个基因位点（gene

locus）有两个。

6. 在有丝周期，每一基因也被复制。

7. 基因能够以数种不同状态而存在（等位基因），基因从一种状态变为另一种状态就是

一个突变。

8. 基因在减数时，通过染色体交换能够从一条染色体转移到另一条同源染色体上。 9. 每个配子获得每对同源染色体的一条，每条染色体是随机分配到配子中的。 10. 每对同源染色体中的一条分配到配子中，不影响其它各对染色体的分配。 11. 在受精时，雌雄配子随机结合。合子从两亲本接受每一对同源染色体中的一条染色体。 12. 在一个有机体细胞中包含着两种不同等位基因时，显性基因比隐性基因有较强的表型

（phenotype）。（见发育P6－P7）。

基因与个体发育有复杂的关系，基因通过控制生化过程而调节个体发育和分化。

30年始，Beedle等人利用果蝇棕色眼睛的突变种，找到了产生棕色素的突变基因，并证明由于一种酶的作用而产生的这种色素。如切断此酶的作用途径就不能产生棕眼。因此提出了“一种基因一种酶”（one gene one enzyme）的假设。

为了证明此假设，Beedle等人从反面着手，即先认识生化反应，再去找基因。他们选用了红色链孢霉（Neurospora crassa），因这种霉在其生活史主要是单倍体，每种突变基因都能表现出来，而不受显性等位基因的掩盖。他们使用两种培养基：“基本培养基”（minimal medium）（水、盐。蔗糖和生物素biotin，在上面能生长）和完全培养基（complete medium含20种全部氨基酸和重要有机化合物）。

据上述实验，遗传学家又提出了“一个基因一种蛋白”（one gene one protein）的假说。把概念扩大了，随着对蛋白质认识的不断深入（蛋白由多肽组成等），将此假说改为“一个基因一个多肽”（one gene one polypetide）的假说，从此大量地解了发育中生化过程的遗

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传控制。

三.分子生物学与发育生物学

在发现了基因和了解基因的功能后，人们试图搞清基因的本质、组成、分子结构等问题，更想了解遗传信息是怎样通过发育被利用的? 也就是说试图搞清发育的遗传。

50年代初：认识到DNA为遗传的物质基础，1953年Wastson、 Crick提出DNA双螺旋结构，60年代发现碱基顺序和氨基酸密码，1961年建立“操纵子学说”，同年又发现遗传密码中信使RNA（mRNA）的作用。1966年证明了三联体密码对合成蛋白的准确性。 1984年Browder把这些分子生物学的成就归纳为9点。 1． 在DNA中具有遗传信息的“密码”，DNA为反向平行螺旋的多核苷酸链，即

Watson-Crick的双螺旋结构。

2． 遗传信息贮藏于直线序列的嘌呤和嘧啶碱基中。遗传密码有4个字（碱基），即A、T、

G、C。

3． 在DNA复制时，每条链作为模板制造互补链，模板上每一碱基代表一个核苷酸与另

一核苷酸配对，即A-T, G-C或相反。

4． 染色体上的遗传信息可由DNA上序列的碱基转录为RNA上的碱基。在转录时，每个

DNA模板上的碱基被转录为互补RNA的碱基，即A-U, T-A, G-C, C-G（U为尿嘧啶）。 5． 合成一个特殊蛋白质的遗传信息就是一个结构基因（structural gene）。结构基因转录为

mRNA后，被输送到胞质中，在那里翻译为蛋白质。 6． 蛋白质由直线序列的氨基酸所组成。一个氨基酸的位置可由一个mRNA三联体碱基所

指定，称之为密码子（codon）。 7． 遗传密码有普遍性（线粒体除外），除某些病毒外，是不重叠的。它还包含停止蛋白

质合成的密码子。

8． 蛋白质合成是在核糖体上进行的，核糖体含有蛋白质和核糖体RNA。遗传密码是由

tRNA所“解读”。这些分子认识一个特殊密码子和其相应的氨基酸，并通过肽键排列成氨基酸顺序。

9． 根据近年来的探讨，发现DNA存在一些核苷酸序列，它们的功能为调整结构基因的

转录，这些调整结构基因的核苷酸序列可能自己不转录。（于见P8）。 由于遗传学和分子生物学的重大成就促进了发育生物学的发展，使发育生物学进入到分子水平的研究境地。从此，特别是近10年间，发育生物学取得较大进步，主要在两个方面：1、同源异型基因的研究（homeotic gene）（也译为壕门基因）2、胚胎发育初期中胚层诱导形成机制方面的研究。（下面详细讲述）

第二节 研究发育生物学新技术

学科的发展与新技术和新方法的利用是分不开的，现介绍一下在发育生物学研究中广泛地被利用的实验方法和技术：（见P9＋新内容）

1． 发育过程的试管中分析，将卵移入试管，受精，早期发育，实验观察。 此技术应用：胚胎移植，试管胎儿等。 2． 超微结构分析技术 3． 示踪放射性同位素技术 4． 显微操作方法（核移植）

5． 细胞杂交，即细胞融合，分析细胞特性核遗传信息的表达 6． 外源DNA导入受体细胞，分析外源基因功能。

7． DNA重新组合技术，将有意义的DNA片段转移到受体细胞 8． 逆转录酶合成cDNA，PCR方法等

9． 离子选择电极追踪在发育过程中极微量离子的运动。

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10. 免疫化学的应用，认识细胞中特殊分子及其含量的一种方法。 11. 转基因小鼠的特殊用途，转基因动物技术。 12. 基因打靶技术：如RNAi技术。 13. 酵母双杂交系统技术。

14. 动物克隆技术。

第三节 发育生物学在生产实践中的应用

一.在医学中的应用:

1.肿瘤的产生为不正常发育,特性改变→肿瘤细胞。 2.试管胎儿已应用。

3.掌握排卵和受精机理(如激素的利用)开发避孕方法。

4.将某种基因(生长素基因)注射到鼠类的卵子,发育成成体后,生产所需物质(称为动物工厂,比

发酵工程价廉),转基因动物生产工厂.(激素的制备)

二.在畜牧养殖业上的应用:

1. 鱼类、两栖类、哺乳类等的育种、养殖。人工受精和种苗（如鱼苗等）繁殖。（朱洗先生

作了很大贡献）。

2. 畜牧业方面：精液和卵子保存、人工授精，受精卵移植被用于育种和推广良畜品种。 3. 用胚胎嵌合技术，得到嵌合体动物，如我国山羊－绵羊嵌合体具两种羊的特征。

4. 转基因技术的成功将优良性状的基因集中于一只动物中，使其传代，为一种最快速的育种

方法。

三．转基因小鼠的用途

1． 用于免疫学研究的转基因小鼠。

2． 用于肿瘤学研究的转基因小鼠（培养细胞不适于癌基因转移的研究，将癌基

因或原癌基因注射到胚胎中

c－myc 基因注射到卵，产生肿瘤

（最大贡献：癌基因致癌是多步骤）假说的支持

3．转基因小鼠作为人类疾病的动物模型（研究新药物、新疗法提供方便）

4．转基因小鼠作为基因治疗的模型（基因→转基因动物→减轻病症） 5．转基因小鼠在发育遗传学上的应用（了解父母本基因在发育过程中的作用等）

第二章 生殖细胞成熟

第一节 两栖类卵母细胞成熟

一．前言（用图说明精卵成熟中的结构变化）

绝大多数高等动物通过精子（sperm）和卵子（egg）的结合开始个体发育。精子和卵细胞的特点不同：

结构和物质成分 大小

卵子

比较复杂

大（人的大8万倍

海胆大1万倍 蛙的大10万倍）

有大量供早胚发育的营养和调节物质

成熟卵物质代谢受调节物质

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精子 相对简单 小

调节

不能单独进行发育，若将精子放入去核卵中才能发育，称之为雄核发育（androgenesis）

的强烈抑制

通常情况下：受精→解除卵细胞代谢的抑制→卵活化进入活跃代谢状态→新生命开始，若不经受精→代谢抑制不解除，卵消亡。

人工诱导卵活化→早胚发育→成为无父个体， 称之为人工孤雌生殖。

由此可见：卵细胞在动物个体发育中起不可代替的重要作用，因而对卵细胞发生、分化、基因表达等的研究已成为发育生物学的重要研究领域。

下面以两栖类为例，了解一下卵母细胞成熟过程，不同生物在卵母细胞成熟、卵裂及一般细胞有丝方面具有一些共性，可相互参考。 二．两栖类卵母细胞成熟 1． 卵母细胞成熟的激素调节

孕酮等→卵母细胞→生发泡破裂→成熟卵子

第一次成熟前期→第二次成熟中期为成熟过程。

在此过程中，有生发泡破裂、核膜物质以小膜泡的形式进入胞质、核纤层（lamina）解体。染色质凝集为染色体等等一系列变化，最后停留在第二次成熟中期，即为成熟的卵细胞，等待受精。那么这一系列过程与什么因素有关呢？实验证明：此过程与一些激素的调节有关：如绒毛膜促性腺激素，孕酮等。

＋

体外证明：从卵巢中分离出的初级卵母细胞内发生一系列变化，主要有：[Ca2]升高。[cAMP]下降，蛋白合成上升等。

2． 成熟促进因子（maturation promoting factor，MPF）的作用 （1） MPF的发现

1971年MasuiY和SmithLD两组研究人员分别报道，

蛙卵母细胞→成熟卵子→取细胞质→注射入蛙卵母细胞→成熟卵细胞

因此Masui Y等人将成熟蛙卵中能促使卵母细胞成熟的成分称为成熟促进因子（MPF）。后来的大量实验证明：a. MPF存在于成熟的处于期的卵细胞质中. b. 促熟效力与MPF量成正比。c. 从酵母到人体细胞所有有核细胞期细胞（包括生殖细胞）中都有，在进化上有高度保守性；人或酵母的MPF注入非洲爪蟾卵母细胞，同样可促进卵母细胞的成熟。d. MPF活性在细胞周期内上下波动，G2出现活性，M期活性最高，G1早期活性消失，因此认为MPF为真核细胞M期的一个基本的调节物质。 （2） MPF的生化本质

MPF的广泛存在使人们对它的研究更有兴趣；由于提供非常困难；阻碍着人们对它的深入研究和对其生化本质的认识。1983年起由于建立了来自成熟蛙卵的两个非细胞体系，以此在体外模拟细胞周期由G2期，经过M期再向G1期转化的整个变化过程。推动了对MPF的生物活性、生化、生理机能及其调节的研究。到1988经多种提取步骤终于得到了非洲爪蟾期卵的MPF纯品。证明MPF主含两种蛋白成分：45kD和32kD蛋白。两者联合作用可使MPF达到最高活性，MPF能催化内源的45kD蛋白、核H1组蛋白磷酸化，说明MPF具蛋白激酶活性，后来以海星为材料也得同样结果。

后来人们经大量实验证明MPF的45kD蛋白与细胞周期蛋白（Cyclin 45kD左右），MPF的32kD蛋白与酵母的蛋白质激酶P34cdc2为等效物。P34cdc2和Cyclin的复合物执行MPF的功能。 总之：MPF的功能：通过催化蛋白磷酸化调节卵细胞成熟（由G2期向M期转化）。 A：其过程为：

MPF中的P34cdc2为催化亚单位（也称为P34cdc2激酶）；本身为磷酸蛋白，入M期之前去磷酸化→活化→重新被磷酸化后失活→卵细胞进入卵裂（细胞由M期进入G1期），MPF中的Cyclin

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为调节亚单位，执行激活MPF（P34cdc2）激酶和选择激酶底物的功能。间期中合成→G2期最大量→激活P34cdc2→使细胞进入M期→M中期后降解MPF失活，使细胞由M向G1转化。在整个细胞周期中：P34cdc2只出现去磷酸化和磷酸化，表现出激酶活性变化;Cyclin则进行周期性合成和降解，调节P34cdc2的去磷酸化和磷酸化。 MPF的催化作用及其效应：

A：MPF催化组蛋白H1磷酸化，在G2/M转化时，H1组蛋白为MPF的一个催化底物; B:MPF催化Lamin(核纤层蛋白)磷酸化,使Lamina结构解体.

M期的Lamin高度磷酸化;从Lamina中解离出来,M期结束时Lamina去磷酸化.重新构成Lamina结构.

实验: 鸡胚胎细胞核

↓

非细胞体系→诱导细胞核的Lamina解体;同时Lamina磷酸化.

↑

MPF

多次类似实验证明:MPF催化Lamina磷酸化,并为促使Lamina解体的直接原因.

C: MPF作用于微管蛋白,控制着微管的动力学变化.

细胞周期的不同时期,微管有着不同的存在形式,如形成纺锤体微管等以推动细胞时染色体的运动;有实验说明MPF与微管蛋白的动态变化有关,但作用机制和方式还不清楚.

D: MPF能使一些原癌基因发生磷酸化,产生一系列与细胞有关的生物学效应.如使P60src蛋白磷酸化,参与细胞骨架重排等.现知可使7种原癌基因产物磷酸化. 3. 细胞生长抑制因子(Cytostatic factor,CSF)的作用. (1) CSF的早期发现:

成熟的蛙卵细胞一般都处于的中期,如不受精则不会.如将成熟而未受精的蛙卵细胞的胞质显微注射到2细胞期的一个卵裂球中,发现注有细胞质的卵裂球被抑制在中期,而另一个未被注射的卵裂球则可以继续。因此推测,成熟蛙卵的胞质中必然存在一种物质,能够将细胞抑制在期,并将这种物质称为细胞生长抑制因子(CSF). 这种因子对Ca2+敏感,其活性随卵细胞受精而消失.那么它的化学本质和可能的功能是什么呢? (2) CSF的化学本质及功能

前述过Cyclin和P34cdc2共同构成MPF, MPF促卵母细胞成熟和体细胞由G2向M转化.而c-mos基因(原癌基因)P39mos则为一种CSF; P39mos是一种Ser/Thr蛋白质激酶。其功能是对MPF活性起稳定作用,其活性在卵母细胞成熟过程中与MPF活性相伴随(见P11的图2)。但详细的作用机制还不清楚.

三 卵母细胞成熟综合 1. 卵母细胞成熟的综合

(1) 实质: 在此过程中,两个最为显著的生化活动:MPF和CSF活性的充分表达。MPF直接使细

胞有关蛋白磷酸化,促使细胞由间期向M期转化。CSF则促进和维持MPF的活性的充分表现,使细胞维持在M期状态。由此可见,MPF是卵母细胞成熟的中心物质,而CSF则是MPF的活性调节因素。卵母细胞成熟的正常实质上就是促使MPF活性的充分表达。MPF通过磷酸化多种物质而诱导细胞进入期状态。

(2) MPF活化条件:首先需a.Cycli B与P34cdc2结合;b.还必须使P34cdc2的Thr-161位点的苏氨酸

保持在磷酸化状态,c.同时还需P34cdc2的Thr-14和tyr-15两个位点(已磷酸化)去磷酸化。d.正常情况下,MPF的活化还必须要求DNA复制已完成. (3) 卵母细胞成熟过程的启动:

如何启动的呢?此启动与激素调节有关。

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孕酮诱导卵母细胞成熟过程的启动主要是通过直接调节c-mos基因的mRNA表达来实现的。已讲过c-mos基因产物P39mos是一种CSF。它是一种Thr/ser蛋白激酶,特异性催化Cyclin B磷酸化, 保持Cyclin B稳定而不被破坏, Cyclin B的量逐步积累,使MPF活性表现并得以继续保持。

2. 受精或人工激活使卵细胞由M期向G1期转化：受精或人工激活卵细胞的过程,从细胞角度

讲,就是诱导卵细胞由M期向间期方向转化的过程。此过程需MPF失活。MPF失活的必须条件a.Cyclin B与P34cdc2分离并迅速解体; b.P34cdc2 ,Tyr-15和Thr-14氨基酸处于磷酸化状态。c.CSF降解(即P39mos解降)。d.Cyclin B降解.

3. 受精时卵子内Ca2+浓度的增加对MPF和CSF的活性影响.

受精时,卵细胞内Ca2+升高;用Ca2+离子载体处理未受精的卵细胞,能使其活化,并由M期转向间期。实验证明,Ca2+升高,激活一种Ca2+依赖性的蛋白激酶,此激酶特异性地催化c-mos基因产物(P39mos)分解,结果导到Cyclin B降解,MPF失活,细胞由M期向间期转化。目前,用Ca2+离子载体处理卵细胞已成为人工诱导卵细胞活化的常规手段。可见Ca2+浓度变化在M期向间期转化中起重要调节作用. 4. 卵裂综合（以后叙述） 见P13的9.3

卵裂的启动过程实质上是由卵母细胞成熟过程向有丝转化的过程(成熟→有丝),其过程:受精→Ca2+升高→CSF失活→Cyclin B降解→MPF失活 →去磷酸化加强→受精egg由M→G1转化→随后,Cyclin B又升高,与P34cdc2结合,MPF活性出现→始升的一轮细胞有关的磷酸化→细胞再次进入M期(第二次卵裂)→如此反复(图3) 四.小结 见P13-P14

1. 控制卵母细胞成熟和卵裂过程的核心物质为MPF 2. 在卵母细胞时期促成熟;在受精卵中则表现为促卵裂. 3. 其活性的周期性调节变化推动着细胞周期的进行. 第二节 精子膜上凝集素受体及其功能 一. 前言

在精子成熟,获能,精子与卵子的识别,黏附,结合及在整个受精过程,胚泡着床及胚胎分化过程中精子和卵子膜上的凝集素受体具有重要作用.

凝集素:是一类具有糖专一性,可促使细胞凝集的蛋白质或糖蛋白. (通用lectin或agglutinin两个名词)

细胞膜上即有凝集素又有凝集素受体(lectin receptor)

凝集素受体:分布于细胞表面的糖蛋白(glycoprotein),糖脂(glycolipid)或者说是糖复合物(glycoconjugates)

二. 精子膜表面凝集素受体

1. 凝集素受体与凝集素结合的分子基础：

受体中糖分子主要由一些单糖或寡糖组成,如半乳糖,甘露糖等等.这些分子以糖苷键同膜蛋白或膜脂相连,这些呈分枝状的糖分子可与凝集素发生专一性的结合.这种专一性结合的分子基础主要有两方面.

(1) 糖分子结构的专一性

各类糖分子的分子结构不同,各种凝集素能特异地识别它们所专一性结合的糖分子结构.（如P26的表1和P24图1.）

(2) 糖结合位点影响凝集素与糖分子结合

凝集素的糖结合位点大小,形状,糖决定簇在糖链中的位置,配体糖的构象等,都影响着凝集素与糖分子的结合.大多数凝集素是与单个糖基结合,有些凝集素与二糖或寡糖结合.(见P26表1)

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一般与寡糖作用的lectin,其糖结合位点较大,结合强度较大. 2006.2.24

2. 精子表面凝集素受体及其在精子发生、成熟过程中的变化.

用同位素,荧光素或酶标记的lectin作为分子探针,可研究精子表面与lectin专一结合的糖蛋白或糖脂(即lectin receptor),在膜表面的分布变化等.已对10多种lectin receptor有详细了解(见P26表1)

精子发生过程中(精原细胞 初级精母细胞 次精母细胞 精子细胞 变态形成特化的精子);在此过程中不仅形态变化,生化方面有深刻的变化,膜凝集素受体(糖蛋白)的合成,修饰及分布都发生很大的变化,[精子的发生、成熟过程的部位:睾丸的曲细精管中 和附睾中] (1) 糖复合物的出现：

睾丸内的精子发生阶段已出现糖复合物.如猪睾丸中,从精子细胞阶段开始出现糖蛋白,集中分布于高尔基体顶体区.豚鼠,小鼠等动物的精子在睾丸内发生中就出现了7种lectin receptor,并随着胚胎发育的进行，其量、结构和功能都发生变化.如12－14天的雄性小鼠胚胎睾丸原基中的生发细胞表面分布有RCA（蓖麻凝集素）受体（β－D半乳糖）和BPA（羊蹄甲凝集素）受体（N－乙酰－D－氨基半乳糖），发育到16天。两种受体消失。说明：小鼠胚胎发生第14－16天时，生发细胞内含D－半乳糖和N－乙酰－D－氨基半乳糖残基的糖复合物在结构和功能上发生了变化。 (2) 糖蛋白的合成,修饰及分布的变化:

在附睾管内,精子表面有些糖蛋白丢失,而附睾管分泌物中的一些糖蛋白被整合到精子表面特异的区域上,成为精子膜的一部分.一般认为:精子必须经过附睾进行膜上糖蛋白修饰,才能获得受精能力.

(3) 精子膜表面凝集素受体变化的可能机制:

a. 由酶水解使糖蛋白降解.

b. 受体分子立体构型变化,使糖基被掩蔽或被暴露.c.由于糖基转移酶的作用使lectin的结合位

点发生转移,从而影响lectin凝集素识别特异的糖基.

(4) 总之,lectin receptor分布不均一,在精子发生,发育和成熟中,膜糖蛋白合成,修饰及分布的变化，其

功能是为精卵识别,结合和融合等步骤做相应的准备.

第二节 卵子和精子发生中基因表达

一. 卵子发生中基因表达:(主要来自两栖类研究结果)

卵子发生过程获得双重后果: (1)成为高度复杂的特化细胞;(2) 产生受精后胚胎发育期所需的物质, 与此过程中基因的表达有密切关系. 1. 灯刷状染色体的作用

在卵母细胞长大时,核也增大,内含有大量核液,称此核为发生泡.生发泡内的DNA分两部分:一部分染色较深象帽子,这部分将形成核仁.另一部分染色较浅,为成对排列的染色体,到了卵黄发生期,每条同源粗线期染色体为双条染色单体(称为双线期).这时染色体伸长(DNA量不增多).同源染色体交叉(chiasmata),具有侧环,形状象灯刷,因此称为灯刷状染色体(lampbrush chromosomes).整个卵母细胞核约有20000个侧环(初级卵母细胞为四倍体).据测量,蝾螈大的染色体的侧环长度为50-100µm,含有10万核苷酸分子,全部侧环含5%基因组DNA,其余的DNA主要在染色粒中,侧环有RNA聚合酶,能够产生mRNA.灯刷染色体的形状是基因转录活性的形态.如果把每一转录单位连接起来,约等于5千万核苷酸分子;因此有足够的信息密码去翻译25000-50000种多肽链(一个mRNA分子<1000个核苷酸分子)

灯刷染色体在卵黄发生期保持很久,爪蟾3个月, 有尾两栖类为7个月.在卵子发生将结束时,灯刷状染色体逐渐凝缩,然后排列在生发泡的,同时RNA合成活性也降低了. 2. mRNA的合成和累积

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在卵子成熟中,一个独特的现象就是产生mRNA,为早期发育做准备.( 结果主要来自对爪蟾卵母细胞的研究)

成熟的爪蟾卵母细胞内含一定量的多聚腺苷RNA,至少代表一部分mRNA,可在试管内翻译,此时不制造蛋白,而是贮存于胞质的RNP颗粒中. mRNA的合成在整个卵子发生期都在进行.通过分解过多的mRNA保持其含量和复杂顺序不发生太大变化.

在卵母细胞,5%的mRNA在核糖体中,95%的mRNA贮存于胞质中的核糖核蛋白颗粒中, 受精之后用.

3. 核糖体成分的合成

卵子发生的主要功能是产生和积累核糖体;为受精后的合子能快速合成蛋白和胚胎早期发育的蛋白合成创造条件.核糖体成分包括5 S, 18S , 28S RNA和核糖体蛋白.

① 5S RNA: 5S RNA占卵母细胞全部RNA的45%, 最先开始合成,以后与核蛋白结合. 5S RNA基因的增加导致5SRNA的大量产生.爪蟾单倍染色体基因组有20000 5SRNA基因,初级卵母细胞有80000个5SRNA基因(为4倍)

② 核糖体RNA(rRNA),即18S和28SRNA

rRNA的基因位于核仁组织区(具有核仁的染色体上)(nucleolar organizer).是转录核糖体RNA的模板,也称rDNA.

卵母细胞生长期:核仁体积变大,代谢活跃,在核中十分明显.

海绵等动物只有一个核仁,两栖类早期卵母细胞内只有两个核仁.初级卵母细胞本来只有4个核仁,却产生了很多小核仁,称为核仁扩增(nucleolar amplification)

用3H-胸苷标记法证明有大量的rDNA复制, 因此导致rRNA的大量增加.为大量产生18s和28s rRNA提供了条件,称此过程为基因扩增(gene amplification).如无此扩增,约需400年才能产生成熟卵母细胞中所含的rRNA; 经过rDNA基因扩增,只需3-6个月. 核中产生rRNA转到胞质,其中很多贮存于胞质,供胚胎发育用. ③ 核糖核蛋白(ribosomal protein)

卵黄发生期,卵母细胞质中出现核糖体蛋白.总蛋白量的20%-30%为核糖体蛋白.这说明在卵子发生期就需要产生大量的核糖体蛋白的mRNA. ④ 转移RNA(tRNA)的合成:

与5sRNA相平行;卵黄发生前期合成大量的tRNA和5sRNA一起贮存于RNP颗粒中;在RNP颗粒中,3个tRNA分子配一个5sRNA分子.(见P99 图3-31)

总之,卵子发生中,需合成大量RNA;刷状染色体对形成mRNA起重要作用;核仁产生rRNA;都是将来合成蛋白不可缺少的.同时还合成了tRNA、组蛋白等,由核转到胞质贮存起来供发育用.高等哺乳动物的卵子很小,在子宫内发育,条件好,不需此方式获营养.

4.两栖类以外动物的基因表达. ① 具滋养细胞的昆虫卵

无灯刷染色体:不是卵母细胞核而是滋养细胞核在合成卵母细胞质RNA中起重要作用.合成的RNA通过细胞间桥进入卵母细胞质.昆虫卵子发生速度非常快,如果蝇只需8天,蟋蟀卵(有刷状染色体)则需100天.15个滋养细胞/卵母细胞,相当于几千个染色体的功能组,因此短期内可积累所需RNA,但卵母细胞质中蛋白合成并不活跃,卵母细胞发生期的蛋白质积累主要依靠外来输入.卵黄蛋白也是通过循环系统和滤泡细胞运到卵母细胞中的.

5.小结：(卵子发生中基因组信息的利用)

(1) 卵发生中,基因组利用有差异性,即基因表达有当时的和长远的,一部分转录的信息指导卵母细胞

合成蛋白,其余大部分则贮存起来供受精后用.由于这种双重性,可以把成熟的卵母细胞看作是复

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杂分化过程的结果。

(2) 卵母细胞的独特之处是RNA和蛋白有内源性合成和外源性合成. 二 精子发生的基因表达 1.精子发生中的基因表达

①精子发生由特定的基因组来控制：

如人的精子发生中发现一种突变,即尾部的轴丝发育不全,组成轴丝的外周9组二联体微管上缺乏含有动力蛋白的内臂(P59 图2-17).这种基因的突变使精子不能运动,产生不育精子.说明精子发生受动力蛋白基因控制.

②小鼠精子发生中，发现控制精子形态发生的一种基因位点(P locus).与精子头部形成有关. ③果蝇: 精子细胞的常染色体和性染色体(sex chromosomes)上都有影响精子形成基因组. 在分析形成精子核特有形状的机理时（已知精子核的形态形成是由于围绕核周围微管的作用和核内染色质的浓缩），有一种果蝇突变体,称为ms(3)10R,在精子形成时,细胞核不能伸长,电镜观察表明:这种精子细胞缺乏象正常果蝇那样围绕在核周的微管,因此,其核的染色质虽然也能浓缩,但不能进行高度有序地组装,故核不能伸长.

果蝇的性染色体—Y染色体具一些”可育因子”(fertility factors)位点,这些位点基因组得到表达时,形成正常精子。Y染色体由异染色质(heterochromatin)构成的,在体细胞中无活性。

研究证明:初级精母细胞时期,在Y染色体上形成少数环 (loops).这些 环是可育因子的位点.大多数果蝇的初级精母细胞Y染色体上都有此环 .有一种果蝇(Drosophile hydei)的环 特粗大. 3H-尿苷 放射自显影证明:初精母的Y染色体上形成6个巨形的环 (P61 图2-19) 具转录活性, 缺失任何一个,发育为不能受精的精子.这说明:Y染色体上至少有6个基因对正常精子的形成是必须的.Y染色体的环与卵母细胞的灯刷染色体上的侧环类似,是可育因子的转录活动必需的结构基础,都转录合成mRNA.

此处合成的mRNA的重要意义是: 它能为分化成雄性特异性蛋白质的合成编码,而且这些蛋白对成熟精子的分化是必须的.此种mRNA存在于精子细胞中直到精子形成前才翻译→合成特异蛋白→成熟精子的分化。总之，精子发生成熟中，转录精子运动和精卵结合时必需的蛋白质的mRNA. 2. 基因表达的调节

①转录时间:转录必须在精子形成开始之前完成(因染色质浓缩时,不能转录)主要在精原细胞和初级精母细胞中完成

②RNA合成能力丧失时期: 因动物而异: 如果蝇初级精母细胞时期,RN A合成就终止.小鼠持续到两次成熟以后一点,rRNA,tRNA两者均能在精子细胞中被合成,核开始浓缩伸长时合成停止.

③RNA合成停止后的情况: 此时精子形成所必须的物质由贮存mRNA的翻译特异蛋白来完成. 早合成的稳定的RNA可用于翻译，可延缓基因的最终表达,延缓到贮备转录的mRNA进行翻译的时候为止.

（自学用的例子：④真鳟鱼精蛋白的基因表达(P62)： 最清楚的是真鳟精子发生中鱼精蛋白代替组蛋白。

精子细胞的胞质中合成→运入核中(此时核中已失去原有的组蛋白)为鱼精蛋白所代替. 已分离出鱼精蛋白的mRNA

↓ 逆转录酶

cDNA

↓同位素标记

cDNA分子探针

↓

9

从细胞分离出的RNA杂交(Northern bloting) 可检测精子发生中什么时期出现鱼精蛋白的RNA

用此方法证明:①初级精母细胞阶段鱼精蛋白的基因便开始有转录活性,(但此时无鱼精蛋白的同步合成). ②鱼精蛋白的RNA有四种:核中的三种为非多腺苷酸RNA(无polyA):16S, 11S, 7.5S ,第四种为多腺苷酸化的RNA,即mRNA,大小为6-6.5S,存在于胞质中,并且与蛋白质结合形成16-18S的信使RNP复合物(messenger RNP complexes) 但不与多核糖体(polysomes)相联.这种RNP颗粒一直贮存到精子细胞期.③精子细胞期mRNA与多核糖体结合,进行翻译.④总之,在动物界,绝大多数物种的精子发生时,都利用这种贮备的长寿命的mRNA(即鱼精蛋白mRNA)进行翻译活动.）

第三章 受精

第一节 人和哺乳类精子获能与顶体反应 一 前言

在高等动物中，精子与卵子结合－受精－开始新的生命个体。因此，受精机理的研究成为成为生命科学中的重大课题。

1951年，张明觉和Austin分别发现：哺乳类精子需在雌性生殖道停留一段时间，否则，不能与卵受精，这表明受精前精子必须先完成一个“获得受精能力”的准备过程。1952年，Austin创用“获能”（capacitation）这一新概念，开辟了新的研究领域，因此，体外受精研究获得突破，并导致以“试管婴儿和试管动物”为标志的生殖工程学的诞生。获能的发现在生殖生物学史上具有里程碑式的意义。

近50多年来的概念上的变化：获能是指精子离开雄性生殖道在受精前一个过程中的一切变化，是一个综合的过程，为广义的概念。50年代末发现“去获能”（decapacitation,DC）现象，将获能过的精子送回精浆环境中，受精能力再度失去，说明获能是可逆的。60年代末，发现这一综合过程的最后阶段精子发生了“顶体反应”（acrosome reaction,AR）,故目前将获能分为AR和AR前的“获能”两个阶段。实际上，两者无法截然分开，为必要准备和自然结果的关系，为连续的一个整体过程，现在两种概念往往交叉运用。（图在ppt中） 二.获能过程中精子的结构和机能变化

1. 精子获能和顶体反应过程中凝集素受体的变化。

获能:指精子在雌性生殖道所提供的适宜的环境和必须的营养中,发生生理,生化的变化而获得受精能力的过程,为哺乳动物精子特有的一种现象.

精子获得时，在分子水平上，细胞膜发生变化：膜发生重新构筑,表面蛋白质又进行修饰,重新分布或丢失。在获得前后，精子顶体区膜表面凝集素受体发生了明显变化，说明lectin receptor是参与获得的重要因素。

具体变化是：(1)仓鼠精子获能时,随获能时间推移，ConA的受体的变化是少→多→少→多的波浪起伏过程，而PNA受体和WGA受体是逐渐减少的变化。人的精子表面的143kD糖蛋白，在新射出的精子中只含50%，经获能液培养后，可增到98%。还有，精子获能前在顶体区没有SBA（大豆凝集素）受体，获能后出现SBA受体。(2)分布和结合位点变化: 如大鼠精子在附睾内成熟过程中，附睾管上皮细胞分泌的一种37kD的糖蛋白结合于精子表面，主要分布于顶体的前部背侧。精子获能后，37kD蛋白由顶体前部逐渐向赤道板和顶体后区迁移。此分布变化的原因：a.获能中精子膜流动性升高，使糖蛋白位移。b.糖蛋白立体构型的变化导致与lectin的结合位点变化。c.获能精子表面的相关酶类对糖蛋白或糖脂修饰，使受体与lectin的结合特性变化。

精子获得所经历的第一件事: 摆脱精浆的影响. 精浆对精子有抑制作用, 解除此抑制后，精子被激活→代谢的激活→结构机能变化→获得受精能力.

10

2．代谢活化

① 糖和能量利用升高以适应精子运动的提高

② 膜脂代谢升高以适应膜系统构建和理化特性的改变 ③ 离子交换升高导致膜电位改变, 质膜稳定性下降

④ 多种酶系活化, 导致一系列生理变化; 酶系变化倍受关注

a. 腺苷酸环化酶激活(AC)，导致cAMP升高 , 使蛋白磷酸化, 蛋白磷酸化在精子运动、获能

和AR促发中具重要作用。 体外获能液中加入cAMP, 可促进获能和AR.

b. 磷酸酯酶激活，产生大量溶血磷脂，膜可融合性升高，产生DG(DAG,diacylglycerol)(二脂

酰甘油); 激活PKC, 促进获能和诱导AR

c. 与氧化作用有关的酶活化，如过氧化氢酶和过氧化物歧化酶。产生许多活性氧(如过氧化阴

离子); 这些阴离子在促进获能和诱导A R中发挥某种作用.

d. 顶体内水解酶如顶体素(acrosin,Acr)激活: Acr为酶原(也称前顶体素 proacrosin PA). PA激

活 Acr 水解ZP， 使精子穿越ZP与卵结合.

3. 超激活 （hyperactivation,HA）

①特征: 精子在获能过程中,运动能力增强和运动方式的变化称超激活

临近A R时,精子开始出现一种猛烈的运动方式,尾部呈现强烈的“鞭打样”摆动, 头部呈现不规则”8”字形运行轨迹. 超激活(HA)是获能过程中的正常生理现象, 与AR一样普遍存在于各物种中(人的HA没有动物的HA明显). HA的突出特征是运行轨迹显著偏离直线.

(2) 超激活的作用: 提供一种动力学的优势；使精子更易通过输卵管中的粘稠介质，并有利于对卵丘颗粒细胞的粘弹性间质的穿越. 现已证明: 只有采取HA运动方式的精子才能摆脱输卵管上皮而在管腔中向前运行. 即HA在精子跨越输卵管峡部，游向受精地点的活动中起重要作用. （3） HA发生的场所: 精子在子宫中运行需要较好的直线性,而HA则是进入输卵管后才发生的. 思考题: 如何证明此结论.(P42)

④ 异常的HA的发生导致不育. 并非所有的HA都有利，有些原发性不育患者，其新鲜精液中有很高的HA发生率，说明：HA只有在合适时机发生才有意义. 4.精子质膜的变化意义： ①具体变化:

a. 去除源于雄性生殖道的某些附着成分; b. 膜脂的组成与糖基的修饰;(凝集素受体) c. 膜流动性增强,导致蛋白位移; d. 膜镶嵌酶的激活 ②此变化的意义:

a. 去除表面遮盖物以暴露与卵子识别的特殊装置; b. 改变膜通透性以活化代谢增强运动; c. 降低膜稳定性以利于AR和精卵膜融合. 5.顶体反应的总结

所有哺乳动物精子在获能的最后阶段均产生AR. AR发生时:

① 顶体外膜与其表面的质膜发生多点融合; 融合处最终破裂，使顶体内容物释放, 暴露出顶

体内膜.

② 释放出的顶体酶起消化颗粒细胞间质或透明带的作用，使精子穿越放射冠与透明带，进入

卵周隙，与卵细胞发生受精.

③ 最近发现AR时, 顶体后区质膜下胞质中细胞骨架, 特别是其中的肌动蛋白发挥着重要作

用.

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三、 研究 获能与顶体反应的实验模型 1 在体模型，即体内实验（in vivo）

主要方法：在动物交配后的不同时间，从雌性生殖道的不同阶段回，收精子进行观察。 常用动物及特点： 豚鼠、金黄地鼠（顶体较大，光镜下可见，应用广）、兔、小鼠、大鼠 在体模型的长处：所观察的是自然获能过程，便于了解生殖道因素的作用。 2 体外受精与透明带结合试验（in vitro）

体外受精技术（in vitro furtilization, IVF） 1957年张明觉先生完成世界首例试管动物（兔）以来，多种动物以及人的IVF系统逐步建立完善。 主要方法：

分两个培养阶段：①精子单独培养，称“体外获能”，精子完成获能过程，并有一部分产生自发AR；②精卵混合培养，称“授精”（insemination），其成功结果即“受精”（fertilization）,成功受精是成功获能与AR的最可靠的证明。

此方法的优点：①研究获能的良好模型，体外受精中，卵可贮存，卵的ZP可长期保持活性（人的ZP十分难得到，故贮存重要，其方法有两个：a 高渗缓冲盐溶液法，40C可保存90天而活性不变； b 超低温冻贮法，可保存12个月活性不变，回收率优于高渗盐溶液法）②考察受精全过程：获能，AR，精子－ZP识别与结合，精子穿越ZP，精子－卵膜融合 3 金黄地鼠卵穿透试验（见福建医学院学报，1991，25（2）：297－300， 可自修） 4 体外顶体反应的诱导

＋＋

① 离子载体A23187：Ca2载体，可诱导胞吐和AR 机制：促Ca2大量流入胞内，启动细胞骨架

作用而促进胞吐，A23187为脂溶性分子，常用最终含量为5－10μmol/L的获能培养液，培养获能精子30－60分钟可诱导AR，是最常用的AP诱导模型。

② ZP及其相关分子：化学方法溶解ZP的溶液，或提纯的ZP3分子和获能精子培养，均可诱导

AR，接近自然AR，一般用同种ZP，现已有mZP3的基因工程产物。 ③ 卵泡液（follicular fluid, FF） 促AR

（4）孕酮（pregestoron, P）的作用机制与A23187相似。 四 获能与顶体反应的检测技术

获能的结果是AR，故可通过检测AR来判断获能状况，较成熟技术是：超激活技术（判定获能的不同阶段或获能程度）、CTC技术（金霉素染色荧光显微术，chlaritetracycline） 1 超激活及其电子计算机分析技术 超激活技术（hyperactivation,HA）：精子运动能力的增加和运动方式的变化用于判断获能状况，预测受精能力。

方法的基本原理：用电脑图像分析技术，对多项参数做快速定量。包括：曲线运动速度（VCL）、直线运动速度（VSL）、线性（Lin）（VSL/VCL）、精子头的侧摆幅度（ALH）。对这些值加以界定，构成HA的标准，然后根据HA标准判断获能状况和受精能力，已证明此技术具有应用价值。 2 金霉素染色荧光显微术

＋

方法的基本原理：（可能的机制：非极性条件下，CTC与双价阳离子，如Ca2结合，这可能是反应精子获能的原理。），精子与CTC结合发出较强荧光，获能过程中精子表面特性发生改变，使CTC结合方式随之改变，因此出现不同的荧光图形。 3 顶体反应的检测（AR反映已完成的获能）

（1）电子显微术 为经典方法，超薄切片后观察AR超微结构的变化，观察表面时用扫描电镜，特点是贵而复杂，只用于建新方法时的标准对照。

② 普通光镜技术：染色技术，但随不同物种、个体和染料，操作上必须加以调整，实用性不高。 ③凝集素亲和荧光技术

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精子顶体含有大量糖蛋白，可与植物凝集素特异性结合，AR后顶体内容物丢失，其结合活性降低或消失，故荧光素标记的凝集素可检测AR。可被利用的凝集素有多种，但最为常用的有两种：PSA（豌豆凝集素）和ConA（刀豆球蛋白）。主要方法：精子涂片－甲醇固定和助渗－用FITC-PSA标记精子。结果：未发生AR的完整顶体被PSA结合发生荧光，而AR后的顶体则无荧光。此技术稳定可靠，因此一直被应用。经多次试验，总结如下规律：凡AR精子其PSA标记均呈两型：①顶体区无荧光（A）表示全顶体破裂，是早已完成AR的精子，A型代表自发性的AR. ②顶体后段和赤道段有荧光(B), 表示刚发生AR不久，顶体内容物尚未完全丢失，只有B型精子的百分率，才能可靠地反映诱导AR的效果。 快速AR计量公式(fast AR measurement, FARM)

FARM=B/(B+I)×100%(I为顶体完整精子)。另外一种是: FITC-ConA可结合于AR后暴露的人精子顶体的内膜(IAM)（内表面）；故凡顶体区发荧光者为AR精子。已被证明此法可靠。 （4） 抗精子抗体免疫荧光技术

分离精子顶体区域的抗原， 制备其单抗(第一抗体) 检测AR

结果十分可靠(据标记物不同, 可选电镜, 荧光显微镜, 普通光镜观察)

四.获能与顶体反应的动力学

1.定义：精子在获能过程中的动态变化和对获能因素的反应特征称为顶体反应动力学(kinetic of acrosome reaction)

因AR是获能的结果, 所以AR所反映的也是获能的动力学. 2.顶体反应的类型(据AR启动的刺激因素分类型)

自发性AR 诱导的AR

(spontaneous AR, SAR) (Induced AR, IAR)

指精子在体内获能时,未经与卵颗粒 多指在体外获能时，引入某种诱导剂

细胞复合体接触便发生的AR; 或指 (孕酮、卵泡液、A23187、 ZP或ZP3等)所 在体外获能时, 不加特别诱导剂，仅 促发的AR; 或指体内获能精子与卵相互 由于获能影响而产生的AR 作用时受ZP诱导而产生的AR

（现认为这种概念区分是模糊的, 因体内, 体外获能条件不同）.

现已证明: 体内受精, SAR和IAR都是受精所必须的. 对体外受精而言, 人精子体外SAR不能预测IVF（体外受精）结果, 也与精子穿透分析(sperm penetration assay, SPA)率无关. 然而, 卵泡液(FF)或A23187诱导的IAR却与IVF结果显著相关.

据实验结果可总结出如下规律: 低SAR和高IAR的精子受精能力较高; IAR与SAR的差值能反映精子受精能力.

3.精子分组(据动力学特点)

用人输卵管液使精子获能, FITC-ConA检测AR, 按IVF结果将人精子分3组: ①正常反应型：2小时AR<10%, 4小时增加>5%(IVF 75%); ②快速反应型; 2小时AR>10%(IVF 22%); ③低反应型, 各不同时间内AR均<5%(IVF 15%)。

4.获能与顶体反应的动力学在不育症诊断中的临床意义:

实验证明：AR发生过快或过慢或SAR过多，均反映精子受精能力异常(P46表1)。 畸形精子症和精子过多症病人精子的获能反应缓慢, 而且用A23187不能诱导其AR. 一般认为，用卵泡液和A23187诱导的IAR率可诊断不明原因的不育症. 5.影响精子获能和AR的动力学特征的因素:

13

a.个体间差异. b.动情周期的时相. 刚排卵后的雌性生殖道的环境能加速精子的获能进程。 2006.3 10

五、.获能与顶体反应的影响因素和调节机制

1.精浆因素

① 小鼠附睾精子表面的一种40kD蛋白的作用. (来源于附睾的40kD蛋白)离心洗涤可使该蛋白从

精子表面脱落，从而使精子很快获得受精能力. 已获能精子悬液中引入该蛋白, 精子的CTC荧光标记类型立即改变为非获能型, 并阻止AR发生; 再去除该蛋白又转为获能类型. 说明此蛋白(来源于附睾的这种糖蛋白)具有“去获能”(decapacitation)作用.

② 牛、小鼠、大鼠等动物的精囊腺中的一类小分子碱性蛋白，叫caltrin，可抑制附睾精子的离子

通道, 防碍精子对Ca2+的摄取, 从而抑制获能。 ③ 精浆中多胺类, 如精胺，具显著的去获能效应

已证明: 精胺对人和多种动物的IVF或SPA（精子穿透分析）, AR, HA均有抑制作用。 并为可逆性的抑制作用, 并可被咖啡因和双丁酰cAMP所拮抗。 获能前精子的精胺高达7.05µg/107个细胞, 获能后可全部脱离精子, 雌性生殖道内的肝素可加速精胺从精子表面消除。这可能是肝素诱导AR的原因。

以上三种为”去获能因子”(decapacitation factor, DF)；一般认为，精浆对精子获能有抑制作用。最近发现精浆中也有有利于精子获能的因素。 ④ 精子表面的肝素结合蛋白:

这类特异性的肝素结合蛋白是附睾后的生殖道所分泌的, 即精子在通过生殖道时，结合到精子

表面上的蛋白. 只有吸附了肝素结合蛋白的精子才能被ZP诱导产生AR, 从精浆附着到精子表面的肝素结合蛋白对牛精子获能具有正向调节作用。

（5）中文大学 破 解 精 子 成 熟 之 謎

中 文 大 學 成 功 破 解 男 子 精子 成 熟 之 謎 ， 可 望 為 不 育 男 性 作 出 針 對 性 治 療 ， 讓 他 們 重 新 肩 負 傳 宗 接 代 的 責 任 。 中 大 上 皮細 胞 生 物 學 研 究 中 心 發 現 ， 男 性 生 殖 器 官 其 中 一 部 份 所 分 泌 的 基 因 「 」 ， 可 令 本 來 幾 乎 完 全 沒 有 活 動 能 力 的 精 子 獲 得 運 動 能 力 ， 是 啟 動 精 子 活 動 機 制 的 必要 元 素 。 中 大 研 究 人 員 期 望 在 此 基 礎 上 研 製 針 對 男 性 不 育 的 藥 物 ， 為 不 育 男 士 帶 來 福 音 。

中 大 上 皮 細 胞 生 物 學 研 究 中 心 主 任 陳 小 章 介 紹 此 最 新 發 現 時 解 釋 ， 男 子 精 子 由 睪 丸 製造 ， 但 在 睪 丸 內 的 精 子 仍 未 成 熟 ， 不 具 活 動 及 授 精 能 力 。 直 至 精 子 到 達 連 接 睪 丸 的 附 睪 （ 位於 睪 丸 旁 的 男 性 生 殖 道 附 屬 性 器 官 ） 時 ， 精 子 才 會 成 熟 。 但 全 球 科 學 家 一 直 不 了 解 為 何 精 子到 達 附 睪 後 即 會 成 熟 起 來 ， 該 研 究 中 心 最 近 成 功 成 為 全 球 首 個 破 解 此 謎 的 醫 學 機 構 。

陳 小 章 說 ， 研 究 人 員 從 老 鼠 實 驗 中 發 現 ， 附 睪 頭 部 的 上 皮 細 胞 會 分 泌出 一 種 同 樣 存 在 於 人 體 內 的 基 因 「 」 。 「 」 會 黏 附 在 精 子 的 頭 部 ， 令 精 子 的 活動 能 力 由 原 來 的 極 微 量 提 升 至 三 成 ， 顯 示 「 」 啟 動 了 精 子 的 活 動 機 制 ， 變 得 成 熟 起 來。 當 精 子 由 附 睪 頭 部 游 到 中 間 的 體 部 、 甚 至 尾 部 時 ， 令 精 子 的 活 動 能 力 加 強 ， 向 前 游 的 距 離也 大 大 增 加 。 有 關 研 究 已 在 最 新 一 期 國 際 科 學 期 刊 《 自 然 -- 細 胞 生 物 學 》 發 表 。

Although the role of the epididymis, a male accessory sex organ, in sperm

14

maturation has been established for nearly four decades, the maturation

process itself has not been linked to a specific molecule of epididymal origin. Here we show that Bin1b, a rat epididymis-specific β-defensin with

antimicrobial activity, can bind to the sperm head in different regions of the epididymis with varied binding patterns. In addition, Bin1bexpressing cells, either of epididymal origin or from a Bin1b transfected cell line, can induce progressive sperm motility in immotile immature sperm. This induction of motility is mediated by the Bin1b-induced uptake of Ca2+, a mechanism that has a less prominent role in maintaining motility in mature sperm. In vivo antisense experiments show that suppressed expression of Bin1b results in reduced binding of Bin1b to caput sperm and in considerable attenuation of sperm motility and progressive movement. Thus, β-defensin （Bin1b ）is

important for the acquisition of sperm motility and the initiation of sperm maturation. （NATURE CELL BIOLOGY VOLUME 6 | NUMBER 5 | MAY

2004）

2. 雌性生殖道生物因素的作用

雌性生殖道是精子体内获能的场所, 不同部位的微环境及某些特定因素不同, 故对精子的作用各异.

① 宫颈黏液(cervical mucus, CM) 促使获能, 但不诱导AR。

② 输卵管液和卵泡液(oviduct fluid, ODF; follicular fluid, FF)： 50年代就发现，只有在输卵管

液, 卵泡液或血清存在时, 精子才能完成体外获能. 为什么呢? 牛精子的体外获能实验中; 同种的ODF和FF均可促使精子获能，并维持其活力. 此作用与浓度和生殖周期有关; 用ZP诱导AR模型证明: 20%浓度可在4小时内完成获能, 提到60%, 可提前2小时发生. 此外, 40%以上浓度的FF可直接诱导AR, ODF却不能, 说明两者的调节机制不同.

人FF促获能作用的机制, 主要与其内含物有关: 如FF含高浓度的溶血卵磷脂,为一种促AR

的脂类. FF中的孕酮含量与AR率之间呈高度正相关(r=0.72, p<0.005). 用碳-葡聚糖吸附法预先除去FF中孕酮(P), 则该FF完全失去诱发AR作用, 将P补还至该FF中, 则88%的FF标本恢复了诱发AR活性. ODF促获能作用机制不太清楚. ③ 输卵管上皮细胞:

精子在输卵管内运行时, 总是不断地贴附到管壁粘膜上, 这种精子-上皮接触究竟有什么意义

呢? 最近报道表明,上皮接触对精子活力保存可能有重要意义，实验结果表明: 对排卵前5-6.5小时交配的金黄地鼠进行解剖，交配后2小时观察, 发现进入输卵管的精子分别分布于管腔或贴附到粘膜表面或埋藏于粘膜隐窝中, 管腔中大部分为不活动的精子, 而贴附于粘膜表面或埋藏于隐窝中的精子则可见鞭毛摆动. 活体染色表明, 管腔中大部分为死精子, 而隐窝中精子活力最高(51-69%), 可见输卵管上皮细胞对精子功能有一定影响, 但其分子机制还不明确。 ④ 卵丘颗粒细胞和透明带

已明确，卵丘颗粒细胞(cumulus oophorus, CO)对受精有利, 但是否诱导AR还不明确.

已证明: 多种动物的ZP均有诱导AR的作用. 对小鼠的ZP研究较详细, 前述过的ZP1, ZP2和

ZP3均为小鼠透明带成分, 其中ZP3能识别小鼠精子头部质膜的特异分子，并与之结合, 因此启动AR.

15

最近证明人ZP也能诱导AR(因人ZP分析提纯较难,一直进展慢)，并且证明这种作用是通过甘

露糖-甘露糖受体调节系统来完成. 3.离子作用

精子的运动, 获能, AR均与细胞内外离子活动有密切关系. 做了大量实验, 积累了很多有价值资料. 精子质膜上有多种离子通道或离子泵获能前被掩盖, 获能时去除掩盖, 离子通道或泵启动, 离子交换加强:

膜电位变化 →

细胞内pH变化 → 代谢激活 细胞内信号传递 → ①Ca2+

已证明维持细胞内较高的游离Ca2+浓度是获能和AR的必要条件。 用Ca2+载体(A23187)使Ca2+大量流入细胞，已经成为诱导AR的常规手段, 近年来注意到了Ca2+作用的动力学、 进入细胞的方式、在细胞生物学过程中的作用机制.

a. 许多对获能与AR有促进或诱导作用的生物素是通过Ca2+来实现其作用的. 例如肝素. 肝素是

牛雌性生殖道中的一种天然氨基多糖, 是牛精子获能与AR的诱导剂. 肝素通过Ca2+, 然后Ca2+又通过钙调蛋白来完成它的诱导获能和AR的作用. b. Ca2+作用的动力学特点

首先明确的是Ca2+过早内流对体内获能不利.

在AR发生过程中, 精子细胞内Ca2+浓度产生动态变化, 用荧光Ca2+指示剂fluo-3标记试验表明:

小鼠精子的获能和AR分别需要不同的环境：获能只需要µmol/L级的Ca2+浓度,而AR则需要mmol/L级Ca2+浓度.

另外, 在获能和AR的不同时相中, 可能Ca2+的来源和动用的Ca2+通道不同. 例如，电压依赖性Ca2+通道只有对AR才是重要的, 是ZP诱导哺乳类精子AR的必要条件. c. Ca2+在细胞内信号转导中的作用与在体细胞内一样, 起信使作用。 对于获能和AR有关的生化过程起调节作用.

d.Ca2+可直接作用于膜; Ca2+与胆固醇的相互作用可导致膜的融合与破裂.

② K+

在获能和AR中发挥作用, 但有种属差异性. 多种哺乳类动物AR依赖于K+存在;但豚鼠精子获能与AR却不需要K+的参与, 高K+浓度反而对其获能和顶体反应不利. ③ Na+

在获能与AR中不可缺少的离子,主要与其它离子协同作用. 比如与K+协同作用等. Na+-K+ ATP酶在小鼠精子获能中起一定作用, 抑制ATP酶, 可促使精子更快转入获能状态.

－

④ HCO3

－

对阴离子探讨较少, HCO3不仅调节胞内pH, 还刺激AC（腺苷酸环化酶）， 使cAMP升高促进获能.

4、激素与某些生物活性因子

孕酮和血小板激活因子有较强的促获能与AR的作用。 ①孕酮（P），促使Ca2+快速流入精入，促进获能与触发AR，孕酮可在10分钟之内迅速引起精子产生HA；还可通过改变膜系的理化状态，降低膜稳定性而达到促获能作用。 ②血小板激活因子（platelet activating factor，PAF）

19年首先发现它有促精子运动的能力。后来发现它对（人、小鼠、兔等）精子获能，AR和

16

IVF均有促进作用。

PAF的代谢产物—溶血PAF（lysoPAF，LPAF）及其类似物溶血卵磷脂（lysophosphatidycholine, LPC）有和PAF一样的促精子运动作用。

PAF的来源：精子获能期间能产生PAF，而且精子内有PAF乙酰水解酶活性；因此推断：外源性或精子自产的PAF是通过代谢产物LPAF而起着和LPC一样的作用。

（LPAF：1—烷基—2—乙酰基甘油磷酸胆碱；是一种很强的炎性介质）。 ③胸腺素与催乳激素

合成的胸腺素（thymosin,T），促进人精子获能和AR，

小鼠催乳激素（PRL）可提高精子的IVF率，但人的则不能，有待于进一步探讨。 5、细胞内信号转导系统的调节

G蛋白，磷酸脂酶（PLC｛PC—PLC， DAG， PLA2｝

PI—PLC， DAG, IP3

DAG—PKC，AC—cAMP，都与Ca2+ 有关，协同起来调节获能与AR。 (除此以外，白蛋白的转脂蛋白对获能和AR有一定调节作用)。

6、精子抗原和抗精子抗体

即精子表面的凝集素和凝集素受体，前已述。 特别要讲的：人精子抗原SP—10蛋白，曾被世界卫生组织（WHO），避孕疫苗特别工作组（Taskforce on Contraceptive Vaccines）定为“一号种子疫苗”（primary vaccine candidate）。

SP—10最早出现于圆形精子细胞→成熟精子分布于顶体膜的内表面（的内侧面和顶体内膜的外侧面）。用SP—10的抗体处理后，可抑制精卵相互作用，阻止受精，因此可以认为人精子AR的意义之一，就在于使SP—10暴露，而SP—10是精子识别卵的特异分子。

第二节 配子间质膜相互作用（精卵间质膜相互作用相关分子的例子：fertilin和cyritestin（哺乳类

动物精子质膜上）；以及integrin(卵质膜上)）

(自修，张红卫老师的书)

第三节 卵子透明带上的凝集素受体变化、皮层反应和原核变化 一． 卵子透明带上的凝集素受体(也称精子受体: sperm receptor)

精子头部表面和卵子透明带表面的糖基互补和匹配是构成同种精卵特异性结合的分子基础，卵子透明带上存在有对应于精子的糖蛋白的受体.

1. 小鼠卵透明带上有三类糖蛋白作为精子受体,分别称为mZP-1, mZP-2和mZP-3. 分子量分别为200kD, 120kD和83kD.

小鼠卵透明带上的mZP-3为第一精子受体(Primary sperm receptor) 2. 猪卵透明带的55kD糖蛋白相对于小鼠的mZP-3. 3. 仓鼠卵透明带的糖蛋白分别称为hzp-1,hzp-2,hzp-3

4. 卵子透明带上凝集素受体的分布(1) 硬骨鱼：有ConA和WGA(2),大鼠有WGA, SBA, BPA和PNA(3),小鼠有RCA, WGA, DBA和SBA，并包含于mZP-1, mZP-2和 mZP-3之中. 卵透明带上3种糖蛋白在精卵结合中的不同作用与其所含有的特异糖残基有关. 二、皮层反应

精子一旦与卵子质膜相接触，卵子就开始发生一系列的变化，即卵的激活（activation），其中最明显的变化是皮层反应。

1、定义：当精子与卵质膜相接触时，首先在该处的皮层颗粒与质膜发生融合，导致皮层颗粒发生胞吐作用，然后以辐射状向卵的四周波及，这种反应叫皮层反应。

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2、发生的时间

（以紫球海胆为例），皮层反应开始于受精后的20—25s，终于受精后40—50s，整个反应过程是20—25s。

3、Ca2+的参与

皮层反应必须有Ca2+的参与，所需的Ca2+来自卵内，而不需要卵外的Ca2+。如将从海胆卵分离出来的皮层颗粒，放入大于0.2mmol/L的Ca2+的溶液中，可使皮层颗粒破裂。 4、皮层颗粒中的酶的作用。（海胆） 三种酶：（1）卵黄膜分层酶（Vitelline delaminase）：使卵黄膜与质膜分开；（2）精子受体水解酶：破坏卵黄膜上的精子受体，使精子无法识别；（3）卵过氧化物酶（ovoperoxidase）：使受精膜（卵的质膜、皮层颗粒膜、精子顶体膜，即质膜的嵌合膜）由“软”变硬，防止受精膜变性和被蛋白水解酶水解。这样形成一个完善的阻止多精受精的结构。（海胆的皮层颗粒中还放出一种透明素hyalin，在受精卵质膜外形成透明层，其作用：保护卵裂球和阻止精子入卵。哺乳类动物皮层反应时酶作用了解不多。）

三、原核变化：当雌雄两原核相遇，并相互融合或联合，建立合子染色体组，受精过程告终。精子进入卵内后，精子核核膜消失，染色质去致密和新的核膜形成。并随原核发育开始合成DNA，然后两原核移向卵的，染色体混合在一起形成一个合子核，准备进行第一次卵裂。

第四节 受精Ca2+波动信号与卵的激活（细胞生物学杂志1999） 一．前言

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迄今为止研究的所有动物卵子在受精时都有一个共同的现象，即胞质游离ca2浓度升高，从静息状态的40—100nm／L升高至600一1000nm／L水平，并以波的形式从精卵结合点向卵子的其

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他部位扩展。在哺乳类受精诱导的Ca2浓度变化表现为有规律的跃升，即Ca2波动或振荡。受精

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诱导的Ca2波动可持续达数小时之久，直至原核形成时才消失。小鼠卵受精诱导Ca2波动的特点是；第l峰高而宽，峰值达617．7土143．5nmol／L，峰宽220．1土43．3sec。将第1峰放大后

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可观察到许多锯齿状小峰(图1)。第1蜂之后Ca2波动的峰高和峰宽均低于第1越而且各峰较为一

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致，峰高和峰宽分别为360．7土21．5nm／L和96．6土16．1sec。研究表明，Ca2波动作为受精的信号，诱导休止于第二次成熟中期(MⅡ)的卵母细胞恢复，并启动胚胎早期发育。目

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前已知许多种类的细胞包括非兴奋细胞，如内分泌细胞、肝细胞、神经细胞、卵细胞等均有Ca2

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波动现象，并证明这类Ca2波动的发生依赖于细胞膜与G蛋白耦联的受体的激活。由于受精的特

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殊性和复杂性，关于受精诱导卵子Ca2波动的发生机制一直是科学家们期待解决的问题。本文就

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该领域目前的进展，结合作者的研究结果对受精Ca2信号的发生机制、生物学作用作一概述。

二、受精Ca2信号的发生机制

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1．膜受体－G蛋白—磷酸肌醇信号传导途径（G蛋白介导受精Ca2信号）

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许多人认为受精诱导卵子Ca2波动的发生机制与体细胞相同，遵循经典的信号跨膜传导途径，即精子与卵子受精时首先激活与G蛋白耦联的细胞膜受体，尔后沿G蛋白信号传导途径激活磷脂酶C(PLC)，使二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水解形成三磷酸肌醇(IP3)，作为第二信使IP3与细胞内钙库

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受体结合诱导Ca2释放，即“IP3诱导的Ca2释放(IP3一induced Ca2release，IICR)”，Ca2自身又

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可作用于ryanodine受体，进一步诱导Ca2释放即“Ca2诱导的Ca2释放(Ca2一induced Ca2

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release，CICR)”(图2)。支持G蛋白介导受精Ca2信号的实验证据有以下几点：1.GTP—γ—S可

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以诱导与受精类似的Ca2升高，GDP—β—S则可抑制Ca2升高。2．将编码(与G蛋白耦联的)5—羟色胺(5—HT)受体的mRNA注入爪蟾卵子后，用5—HT处理在质膜表达5—HT受体的卵子可

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诱导与受精相似的Ca2反应。与此相同的乙酰胆碱实验亦得到相似的结果。3．卵内注射IP3可诱

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导与受精类似的Ca2反应。4．用IP3受体抗体(mAB)18A10不仅抑制了仓鼠卵受精诱导的Ca2波

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动而且阻断了Ca2波在胞质的传递以及卵激活的一系列反应。这些实验有力地证明了激活G蛋白

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—磷脂酰肌醇信号转导途径能够诱导与受精类似的Ca2反应，仿佛受精诱导的Ca2波动即 是激活该信号转导途径的结果。但是正常受精过程的生理反应是否真正如此尚不能下定论。“膜受体—G蛋白—磷脂酰肌醇信号学说”的最大不足是迄今尚没有在卵子质膜上找到相应的精子受体。

＋＋

而且在海胆的实验表明，IP3受体拮抗剂—肝素并不能阻止受精引起的Ca2波动以及Ca2波的传递。

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肝素也不能完全抑制小鼠卵受精诱导的Ca2波动。因此认为精子象激素一样充当配体通过激活膜

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受体—G蛋白—IP3途径诱导卵子产生Ca2波动的理论受到下面学说的有力挑战。

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2．精子蛋白因子诱导Ca2波动学说

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早在80年代初就有人提出，受精时可能是精子带入的某种胞质因子，诱导卵子Ca2升高。1985年Dale等首先发现，将海胆精子抽提物直接注入海胆卵子能够诱导与受精反应相似的皮质颗粒释放，尔后Swann和stice等进一步发现，将仓鼠和兔精子可溶性蛋白抽提物，注入卵子胞质能够诱

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导受精样Ca2波动。这些实验表明，精子蛋白可以越过卵子质膜受体—G蛋白的经典信号转导途

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径，而直接作用于卵子胞质，诱导Ca2波动。这一学说认为在精子中存在某种蛋白质因子，受精

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时由于精卵质膜融合而被“注入”卵子，并直接作用于钙库，诱导Ca2释放而导致Ca2波动(图3)。

＋＋

为了证实诱导Ca2波动的因子是蛋白质，而不是由精子带入的Ca2、IP3、cGMP、cADPr等其他

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能够诱导Ca2释放的因子，科学家曾做了大量的实验和论证。可以肯定的是，在精子中的确存在

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某种蛋白因子能够诱导卵子Ca2波动。但是这种蛋白因子究竞是什么?从精子中分离纯化这种因子

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的工作十分艰难。国外最近报道从仓鼠精子中分离出一种能诱导卵子Ca2波动的蛋白组分——P33(分子量33Kd)，被命名为“波动蛋白(oscillin)”，并克隆了波动蛋白的基因。波动蛋白存在于精

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子赤道部位，精卵质膜融合时被带入卵子。但是精子波动蛋白是否是导致受精Ca2波动的唯一因子尚不能肯定。“精子蛋白学说”目前还缺少两个有力的证据，即1：波动蛋白基因表达的产物要

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能够模拟受精诱导的Ca2波动反应。2：波动蛋白的枯抗剂如单克隆抗体应能够功能性阻断受精诱

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导Ca2波动。只有满足了上述两个条件，“精子蛋白学说”才真正成为完善的理论。目前这一工作

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正在进行之中。遗憾的是最近的实验结果表明，波动蛋白——P33并不能诱导卵子Ca2波动(私人通讯)。看来，寻觅精于波动蛋白的工作仍然任重道远。

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由上可见，上述两个学说均有各自的实验依据和不足之处，试图全盘肯定一个而否定另 一个学说是十分困难的。有人将这两个学说形象地比喻为人进门的方式。彬彬有礼的进门方 式是先敲门或揪门铃，等待主人来开门或允许后再进门；较为鲁莽的进门方式是未征得主人 许可便“破门而入”。无论哪种方式最终都达到了进门的目的。目前的困难是从精卵结合、质膜融

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合到出现Ca2波动的时间非常短，很难将精子与膜表面受体结合与质膜融合这两个事件截然分开。正常受精时，精于和卵子在质膜水平的相互作用包括多级反应，即精卵相互识别(初级结合)、精子激活(顶体反应)、精子表面抗原的暴露及其与卵子的二级结合以及结合蛋白、fertilin和integrin等介导的质膜融合，精子内部抗原的进一步暴露及其与卵子的相互作用等。现在的问题是上述生理反

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应在诱导受精Ca2波动及卵子激活中究竟起什么作用?这些生理反应仅仅是将精子“波动蛋白”送

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入卵细胞?抑或受精Ca2波动是精卵质膜相互作用和精子“波动蛋白”的协同作用?最近有人报道，仅将精子核注入卵子即可激活卵子。这表明激活卵子的信号分子可能不仅存在于精子胞质，而且也存在于核。最近还有人报道，在精子中段和原生质残滴(cytoplasmic residue droplet)中存在一种称之为“Tr—Kit”的蛋白，将Tr—Kit蛋白或其mRNA注射到卵子，均可以诱导卵子激活的一系列反应，如皮质颗粒释放、第二极体排出、原核形成及卵裂发育等。但遗憾的是上述作者均没有测定卵

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子的Ca2变化。因此目前尚不知道Tr—Kit和精子核是否象正常受精那样通过诱导胞质Ca2波动来激活卵子。

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三、卵子Ca2波动的Ca2来源及Ca2波动的维持：

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早期的研究已表明，受精诱导Ca2波动的Ca2来源主要为胞内钙库Ca2释放，但胞外Ca2对于＋＋＋

Ca2波动的维持至关至要。在无胞外Ca2条件下，受精仍可诱导卵子Ca2波动数次，但很快停止，

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恢复胞外Ca2浓度后卵子可恢复Ca2被动。有实验表明，升高胞外Ca2浓度可使Ca2波动频率加

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快；而降低胞外Ca2浓度则降低Ca2波动频率。钙库敏感性的变化和其对自身Ca2浓度的反馈性

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调节对于Ca2波动的形成起重要作用。如前所述，受精首先引起IP3升高诱导IP3敏感钙库Ca2释

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放，局部释放的Ca2又作用于附近的Ryanodine敏感钙库引起Ca2释放(即CICR)，并沿钙库排列

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方向向胞质其他部位传递，形成所谓的Ca2波。钙库排空后对IP3和Ryanodine的敏感性立即降低，使排空的钙库对外来的连续刺激产生一个不应期。与此同时钙库排空后会使细胞产生一种信号分

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子，开启质膜上的Ca2通道使胞外Ca2内流。这种信号分子被称之为“Ca2内流因子”(Calcium influx

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factor，CIF)。胞外Ca2内流后使排空的钙库再次充盈并恢复对IP3和Ryanodine的敏感性，从而引

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起第二次Ca2释放。这种周而复始的过程导致胞质Ca2浓度有规律地波动。需要指出的是对于胞质Ca”波动的机制，目前仍处于假说阶段，有许多问题还没有解决。

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四、受精诱导卵子Ca2波动的生物学意义

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1．Ca2升高与卵子激活

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尽管对于受精诱导卵子ca2波动的发生机制目前尚不十分清楚，但对于受精过程中Ca2升高

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在卵激活中的作用已经明确。大量的实验表明：胞质游离Ca2升高可介导卵子皮层颗粒释放。卵

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子皮层颗粒释放后，对卵膜(透明带)进行修饰，使之硬化(Hardening)，这对于防止多精入卵有重要

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意义。Ca2升高的另一个作用是通过降低促成熟因子(Maturation Promoting Factor，MPF)水平，启动细胞周期，使休止于第二次成熟中期(MⅡ)的卵母细胞恢复，并启动胚胎早期发育程序。

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但是研究发现，胞质Ca2仅升高1次即足以诱导皮质颗粒释放并激活卵子。如通常使用乙醇、钙

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离子载体(ionoPhore)及电刺激等，处理卵子均可诱导卵子孤雌激活(这些刺激一股仅诱导胞质Ca2

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升高1次)。令人费解的是既然胞质Ca2升高1次即可激活卵子。那么受精诱导的长达数小时之久

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的Ca2波动的生物学意义究竟何在?

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2． Ca2波动对胚胎早期发育的影响

仔细分析会发现，孤雌激活的效果取决于卵龄。卵龄越大越容易激活。上述诱导卵子孤雌激活

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的理化刺激对于刚排出不久的卵子(正常受精卵龄)往往无效。有人用多次电刺激诱导卵子Ca2多次

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升高，模拟受精诱导的Ca2波动型式发现，多次Ca2升高诱导的卵子激活率及激活后发育至囊胚

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的比例，远远高于1次Ca2升高。这提示：Ca2波动可能对胚胎发育有重要意义。另外有实验表

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明胞质Ca2多次升高对充分降解MPF有积极作用。年轻卵子之所以不易被1次Ca2升高激活，是

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由于1次Ca2升高只能降解胞质中已存在的MPF，不能阻止卵子新产生的MPF。由于老化卵子合

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成新MPF的能力降低，人工诱导1次Ca2升高即可激活卵子。由此可见，受精诱导的Ca2波动对充分激活卵子，保证激活后胚胎早期发育有重要意义。有众多类型的细胞在生理过程中出现胞质＋＋

Ca2波动的现象，表明：胞质游离Ca2波动可能是细胞内信号传导和功能调节的一种普遍方式。 五．小结：

1、受精Ca2+信号的发生机制。（1）膜受体－G蛋白一磷酸肌醇信号转导途径；（2）精子蛋白因子诱导Ca2+波动学说：认为在精子中存在某种蛋白质因子，受精时由于精卵质膜融合而被“注入”卵子，并直接作用于Ca2+库诱导Ca2+放出而导致Ca2+波动，这种蛋白因子是什么样的蛋白还未定论。 2、卵子Ca2+波动的Ca2+来源及Ca2+波动的维持 3、受精诱导卵子Ca2+波动的生物学意义

（1） Ca2+与卵子激活：a 介导皮层颗粒释放；b 降低MPF水平，启动细胞周期。（2）Ca2+波动

对胚胎早期发育的影响：Ca2+多次升高能充分降解MPF，有利于早期胚胎发育。

第四章 早期胚胎发育的分子机制

第一节 卵裂 (见ppt)

第二节 中胚层分化的诱导 一、前言

动物胚胎早期发育过程中，形态上发生着它一生中最剧烈的变化：从一个细胞的受精卵→卵裂→细胞数量上升→囊胚腔的出现→内卷或外包等方式形成原肠胚→3个胚层，并决定胚胎的轴向（器官的原基已决定）；这一系列变化相继发生，似乎是那么顺理成章。

此过程非常严密；温度一定时，同种动物的不同个体达到每个阶段的时间相差很小。那么，动物的胚胎是怎样计算时间并按部就班地有秩序地完成它的早期发育过程的呢？本章就了解这方面的内容。重点是从时间和空间的角度，了解动物胚胎早期发育现象及分子机理。

有关中胚胎层诱导研究几乎全部集中在两栖动物，所以本章主要以两栖类动物为例讲述。 二、两栖类动物的胚胎发育过程和Spemann组织者

1、两栖类动物的胚胎发育过程 简述爪蟾胚胎发育过程:

受精卵—卵裂（16－个细胞称桑椹胚）—囊胚(128个细胞—)—原肠初期—原肠后期—神经胚—

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尾芽胚—蝌蚪

2、Spemann组织者

1924年德国动物学家用两种不同颜色的蝾螈卵（浅色的Triton cristatus）和深色的(T.Tacniatus)做过种间移植实验：

实验内容：将浅色的蝾螈早期原肠胚原口背唇上缘的一片组织移植到深色蝾螈同龄胚胎的腹侧（预定外胚层），结果：在宿主原来的神经板对应的腹侧又形成一个神经板（进展P71的图2示）；并发育成一个次极胚胎。说明：原口的背唇不仅具有诱导神经板形成的功能；而且还能使宿主的部分细胞组织形成完整胚胎的功能。因此，Spemann把原口背唇部称为组织者（organizer），即所谓的Spemann组织者。

三、形态变化中的分子机制（进展P87名词复印） 1、 细胞分化的概念

早期胚胎发育中形态变化非常显著，形态变化的一个基础是细胞分化。细胞分化方向是由该细胞所接受的位置信息（positional information）所决定的。细胞据所获的位置信息和自身基因组所处状态来表达适当的基因，其结果就表现为细胞的分化。

细胞分化总是伴随着某种新蛋白的合成。例如，爪蟾中胚层的细胞有α－肌动蛋白（α－actin），而其它胚层的细胞中则不出现α－肌动蛋白。此蛋白为中胚层分化标记物，它的出现标志着中胚层细胞的分化。在研究细胞分化时，找出这种特异标志物是必不可少的。（总之：细胞分化—细胞的后代在结构和机能上获得并保持特化的过程）。此过程有两个步骤：细胞的决定（gene有关）；细胞的分化（代谢、形态特征）。

2、中胚层分化的诱导实验（研究）及其三信号模型

早期发育的过程是细胞增殖的速度和细胞分化的协调过程，细胞在增殖的同时获得位置信息来决定分化途径。 诱导实验：（进展P71的图3）

进一步的实验：植物极的腹部和侧部细胞只能从相应的动物极细胞中诱导出腹部中胚层，而只有植物极的背部细胞才能诱导向像背索和肌肉这样的背部中胚层细胞类型。

据以上实验结果产生了“中胚层形成的三信号模型”（P72图4） 其内容：（1）爪蟾的卵子受精后由于胞质的运动，把植物极（Vg）半球又分成背植物极（DV）区和腹植物极（DV）极。

（2）在桑椹期，DV区能释放出诱导组织者（O）的信息，同时VV区释放出诱导腹部中胚层（M）的信号。

（3）在原肠形成过程中组织者产生第3种信号，由于这种信号的浓度梯度作用使得中胚层被分成了形成体节（M1）的区域，形成侧板中胚层（M2）的区域和形成血岛（M3）的区域。

很显然，爪蟾胚胎中中胚层的形成是一个诱导过程，这种诱导是动物胚胎发育中最早的诱导现象。中胚层出现之后才有的神经的诱导。中胚层对体轴的建立和身体的整体规划都起着决定性的作用。那么这些诱导信号到底是什么呢？下述：

3、 中胚层诱导因子（MIF）(Mesoderm Inducing Factor) {和相关的修饰因子（离体条件）}

（1） MIF的种类。

研究诱导信号的方法除上述的接触培养以外，更常用的是：动物极帽生物分析法（animal cap bioassay）（进展P73图5），可定性定量。

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用此方法调查了很多可能产生诱导作用的物质：胰岛素、白介素、上皮生长因子、变态（转化）生长因子（TGF－β），干扰素，FGF等等。通过调查发现bFGF和活性素（activin）。具有很强的中胚层诱导活性。所以目前已知的中胚层诱导因子主要就是bFGF和activin 2种。最近研究较多的是BMP4等等。

（2）MIF浓度的诱导效应

在一个胚胎中，由于细胞各自所处的位置不同，因而获得位置信息也不同，这种位置信息上的差异可能是由诱导物的浓度表现出来的。因为细胞与诱导源（MIF等）之间距离上的不同，就使它们所接触到的物质的浓度也不同。那么诱导物的浓度对中胚层的诱导结果会有什么影响呢？可由实验结果来说明。

A、activin （利用动物极帽分析法）

（1）4—20pmol/L，膨胀；可见到体腔上皮，间充质和血细胞样细胞分化（腹侧中胚层被诱导）。

（2） 40pmol/L，伸长，有肌肉，间充质，脊索，神经组织分化（诱导腹背层之间的大部分

中胚层）。

（3）100pmol/L—2nmol/L，无表皮分化，外层细胞散落在外，内部生成了脊索和前脊索板中胚层（诱导背部中胚层的分化）。

Aactivin的诱导效应不仅与浓度有关，与处理时间也有关系。4—20pmol/L短时间（10分钟）处理分化为腹侧中胚层，长时间（3天）处理则分化为背侧中胚层。

B、bFGF

同法证明：bFGF可诱导Xhox3和X1hbox6等基因的表达，它们是神经胚的后、侧中胚层中表达的基因，然后α－actin表达。

但bFGF与activin不同，不随浓度增加而发生类似activin那么明显的变化。bFGF只能诱导腹部组织，但bFGF可以与activin协同作用。

据以上结果推断：activin在三信号模型中相当于胚胎的背部植物极球所产生的信号（教科书的Nieuwkoop中心），而bFGF则代表由腹部和侧腹部植物极细胞所发出的诱导信号。 （3）中胚层诱导修饰因子的作用

中胚层成型（patterning）中，仅靠activin和FGF还不够；而且FGF和activin以及它们的受体在卵和发育初期胚胎中空间分布的局部性并不强。 有一实验：

说明：囊胚的动物极半球在对诱导信号的反应能力上存在有区域性差异。是什么原因造成这种区域性差异呢？推断还有其它因子的存在。证明推断的实验。

此外还有noggin，视黄酸，骨发生蛋白4（BMP-4）等可修饰activin的作用。

通常，这些修饰因子本身不具有中胚层诱导能力，但是具有修饰其它诱导因子诱导效果的能力。因此，在早胚发育中非常重要。

4、胚胎内在的MIF（和相关的修饰因子）

前述的MIF（和相关修饰因子）基本上在离体条件下用诱导动物极帽细胞分析方法鉴别出的，这些因子是否也存在于早期的爪蟾胚胎中，如果存在，分布情况又如何呢？ （1）bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）

bFGF（146个aa），爪蟾卵形成中，bFGF的mRNA已开始转录和翻译，其蛋白浓度在17—200ng/ml之间（足够诱导中胚层形成），免疫组织化学染色法证明从卵形成到囊胚期为止都有bFGF存在（aFGF也存在）。

分布：卵裂到囊胚期时主要分布于预定中胚层区域；染色程度（量的多少）是动物极较弱，赤道区

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最强，越向植物极越弱，背腹轴上分布均匀。

虽然离体条件下bFGF具有很强的中胚层诱导活性，因bFGF或aFGF都不具信号序列，不能有效地从细胞中分泌出来，因此在胚胎中的中胚层诱导作用不清。 1992年有人分离出FGF家庭的另一成员，叫胚胎FGF（eFGF），具信号序列，受精卵中就有它的转录产物，囊胚后期开始表达。因此，eFGF可能是真正的内源性的中胚层诱导因子。 （2）活性素（activin）：是TGF-β(transforming growth factors转化生长因子) 大家族中的一员（有A、AB、B 3种类型），在中胚层诱导研究中使用的一般是ActivinA。

爪蟾的未受精卵和囊胚中都具有很强的中胚层诱导活性的类activin（因未定性，故称类活性素），其含量为0.5ng/ml（未受精卵到囊胚中） （3）中胚层中的修饰因子

体内情况下，修饰因子有：Xwnt -8, noggin, Raf-1, Vg1蛋白，只知与中胚层诱导有关，具体情况还不清楚。

5、中胚层诱导过程中的基因表达 （1）同源异型基因在组织者中的表达

A: 同源异型基因简介：是一类身体规划（body plan）的基因。一个此类gene突变可使某个完整体节或体节上的某个完整结构发生整体变化（如昆虫触角→肢足）。其表达顺序性很强；而且表达顺序与身体的前后轴位置有关；表达早的在前（头）部表达；表达晚的在身体的后（尾）部表达。而且它们之间存在一种承前启后的顺序关系。

B: 在组织者中的表达：把爪蟾早期原肠胚的原口背唇部（即组织者）收集起来，建立cDNA库，从中筛选出了4个含homeobox（同源异型盒）的基因；即goosecoid, Xcad1, Xcad2, X1ab四个基因 ，它们都在原口背唇部表达，在其它部位表达很少。其中表达量最大的是goosecoid产物。用原位杂交的实验证明，goosecoid基因仅在组织者中表达。如果把同源异型盒（homeobox）转录的mRNA微注射到32细胞期的腹侧球中，就可以形成具有很大脊索和神经组织的次极胚轴。这说明：组织者发挥功能时，其中的同源异型基因起着决定性的作用。 （2）MIF对基因表达的诱导（mesoderm inducing factor）

切下预定外胚层的胚片，在中胚层诱导因子的作用下，可以诱导出中胚层；说明中胚层诱导因子可诱导预定外胚层的细胞中的某些基因的表达。

activin处理预定外胚层的胚片30分钟，goosecoid基因开始表达，而bFGF则不能诱导该基因表达。用bFGF处理预定外胚层的细胞，Xhox3（同源异型基因之一）大量表达，但用activin处理则表达很弱。说明bFGF和activin在中胚层诱导过程中有不同作用。即：前方表达的同源异型基因（goosecoid基因等）由activin诱导，后方表达的该类基因则由bFGF所诱导。

第二节 发育时序的分子机制

1、说明发育时序重要性的实验（果蝇早期发育）：独特的果蝇卵裂（表面卵裂－教科书p55），细胞核12次，胞质不，开始，核在卵→向卵表皮移动→第13次结束后，才开始形成完整的细胞（细胞化）→形成细胞性囊胚。细胞化最早发生于卵的后部，这些位于囊胚后部的细胞称为极细胞，以后成为原生殖细胞。

有一种果蝇突变体{gs(1)N26}，它产的卵，受精后，在发育中，细胞核的移动时间晚于细胞化的时间，即细胞化发生时核还没有移动到后部，结果都发育成不育个体。

此实验说明，果蝇早期发育中，细胞核移动和细胞形成的过程仅仅在时间上的微小差异就能造成不育。说明发育时序的重要性。 2、发育定时钟

为了说明方便，可人为地想象在胚胎发育过程中有一些计时装置存在于细胞内部，这些计时装置称

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为发育定时钟（developmental timer. DT）DT，它不同于生物钟，与受精后多长时间开始卵裂，囊胚形成，原肠胚形成等（这些时间的长短都是相对的，而且受温度影响很大）关系不大。DT则是一种更注重于阶段上相对性的计时装置，它不以物理上的时间进行计算。

例如，上述的果蝇的卵裂时，在完成第13次后才开始由多核体进行细胞化，这与它从受精后发育的时间长短关系并不密切。时间长短受环境因子影响，但到达细胞化时的次数是稳定的。 另外，不同动物卵裂速度非常不同，如蛙的受精卵15℃，43h时可到囊胚早期（细胞数可达33000个，兔的受精37℃，43h时只到32个细胞，小鼠37℃，43h仅达8个细胞；但它们的发育阶段基本都是一样的，即受精卵→囊胚→原肠胚→神经胚→尾芽胚→成熟生物体。那么决定这一系列发育事件出现的DT的机制是什么呢？即DT是在什么物质基础上来控制这一系列发育事件发生的呢？）

3、决定发育定时钟作用的因素 （1）细胞质 卵裂初期，细胞核与细胞质具有相对的性，即除去细胞核的受精卵仍可进行，说明卵裂过程主要是由细胞质驱动的。 实验例据：

海星未成熟的卵切成2份

1份无核 加诱导剂使卵成熟

能，但是，中无细胞周期性

另1份有核

加诱导剂使卵成熟 也能

中有周期性 但是还有一实验：

处于不同时相的2个无核卵—分别注入精子核—精子核发生与宿主卵时相对应的变化。说明卵裂开始的DT因子存在于细胞质内。

后来用实验证明，爪蟾的受精卵中，控制细胞周期性的活性因子分布于偏向动物极一侧的细胞质内（如何证明，设计实验）

这类因子的作用和性质：控制卵裂速度，即卵裂周期的长度。如：18℃下一种蝾螈卵从受精到第一次卵裂需要约380分钟，而爪蟾卵只需要大约150分钟。（见ppt）

这种细胞质活性称为卵裂周期决定系统；用120000g离心爪蟾卵1h可从上清中得到这类因子，并确定是蛋白质性质的因子。以上实验结果说明卵子在之前就为形态形成和细胞分化事先做好准备，卵子细胞质内可能已贮存了早期胚胎发育过程中所需要的主要信息。 2006-3-31 （2）细胞核

细胞核的有两个过程：A: DNA复制。B:细胞核到新核形成。用秋水仙素抑制马蛔虫早期胚胎的细胞核，分化特征仍能表现，说明核不影响DT的启动。那么DNA复制如何呢？

如抑制DNA的复制（如何抑制？），就会抑制胚胎发育过程，说明DNA复制在胚胎发育中对某些基因表达的开始具有决定性意义。

实验例据：在海鞘肌细胞中有一种特异性表达的酶（乙酰胆碱酯酶，Ache），正常情况下，该蛋白的基因（gene）在原肠期活化，最早在神经胚期可测出该酶活性。

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细胞松驰素B处理抑制细胞质的，虽卵裂被抑制，但Ache表达不被抑制。若抑制胞质同时，也抑制最初的7次以内的DNA复制，Ache表达也被抑制。若从第8次开始DNA复制被抑制时，胚胎中则有Ache表达。说明某些与细胞分化有关的gene的表达，是由DNA复制次数控制的。故可以说，胚胎发育到一定阶段，DT的作用与DNA的复制密切相关。

（DNA复制对DT作用启动的控制机制有3种方式：有待于进一步证实，进展P80） （3）细胞核质之比

A：卵裂与体细胞的不同之处：卵裂：每次后子代细胞的体积不再恢复到母细胞原有的体积；体细胞：每次后子代细胞的体积都恢复到母细胞原有的体积。因此随卵裂的进行，核与质的比例逐渐增大（此为卵裂期的第一特点）。例如：海胆受精卵的核质比是1：500，到卵裂结束时为1:6。

B： 卵裂期的另一特点：同步向不同步转移。两栖类的受精卵一般经12次连续同步→进入非同步。由于非同步的出现，使得本来只有M期和S期的细胞周期中出现了G1和G2期细胞。同时，胚胎自身的基因开始发挥作用；细胞开始运动；有了形态形成开始的动向；此转移期在发育早期非常重要，故称之为中期囊胚转移期（MBT，Midblastula Transition）. C：核质比决定中期囊胚转移期（MBT） 实验证据：

蝾螈受精未卵切成1/2和1/4两种切法，结果发现，切成1/2的卵在第12次；而切成1/4的切割卵是在第11次开始非同步，而对照组（完整的卵）在第13次才开始非同步。用爪蟾作类似实验，发现经切开的卵达MBT的次数是11次，而正常胚胎为12次。实验组都比对照组少一个周期，但是最后核质比相同。因此可以说，MBT的开始时间是由细胞的核质之比决定的。 自然界，一只雌性动物产的卵中常常有大有小，但它到达MBT开始的时间好象并无明显差异；卵子大小主要由营养物质所决定，而与发育有关物质量（浓度）并不随卵子大小而发生变化。 4、发育基因表达的时序性

在发育初期，囊胚的形成是由母体基因（即母体信息）所决定的。预定中胚层在囊胚中期之前就已经被决定，此后的信号只不过是对已经决定了的形式（pattern）的加工。（中胚层诱导修饰因子在囊胚中期之后仍起作用）。

在进入原肠期之前，合子核的基因开始表达。这时除必要的看家基因表达外，与发育有关的其它基因也开始表达。如goosecoid基因等，都属于同源异型基因，这些基因是成簇排列在染色体上，在表达时间上与染色体上的排列顺序一致，这样来保证发育时序上的正确性。 5、总结 1）、卵子的细胞质决定了动物早期胚胎发育的形态变化特性和时序上的特性。 2）、卵子形成过程中的基因表达比个体发育过程中的基因表达更为重要。因为卵胞质内贮存的物质都是在卵子形成过程中合成（前已述）。例如：马蛔虫的受精卵在卵裂过程中，分化为体细胞的细胞核中有30%DNA量有选择地减少。而原生殖细胞中则不发生这种消减。这说明这一部分消减的DNA只有在生殖细胞形成时才起作用，也说明DNA的完整性对生殖细形成的重要意义。 3） 、消减的DNA的功能。

在其它动物中也存在着类似的基因，这些DNA的作用就是用来产生卵子细胞质中各种发育因子的，这些因子指导受精卵的正常发育（形态的和时序的），因而出现了：果蝇的表面卵裂，鱼类的盘状卵裂和哺乳类动物的转动式卵裂等方式上的差别。即使都属转动式卵裂，兔和鼠在发育速度上存在很大差别。这些差别由母体贮存在卵细胞质内的发育因子决定的。由于这些因子的存在，使得受精卵按它母体规定的方式和速度发育。这可能是种间杂交不成功的原因。 4）、待研究的问题

（1）中胚层诱导（来自两栖类）的研究结果在动物中的普遍性问题

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（2）早期表达的基因如何激活它们下游的靶基因。

第五章 细胞分化

第一节 前 言

一 基本概念

细胞分化(cell differentiation)是胚胎细胞后，未定型的细胞在形态和生化组成上，向专一性或特异性方向分化，或由原来较简单具有可塑性的状态，向异样化稳定状态进行分化的过程。 二 组织细胞分化时的主要特征

细胞出现不同的形态结构，合成组织特异性的蛋白质，演变为特定表型的细胞类型。例如成肌细胞合成肌球蛋白（myosin）和肌动蛋白（actin），表皮细胞合成角蛋白（keratin），胰岛细胞合成胰岛素（insulin）等。

三 细胞形态与功能的统一性

多细胞生物中，大多细胞为了适应于功能的变化，而逐渐在形态上发生相应的变化，比如神经细胞等。因此，狭义地讲，这种功能和形态上逐渐特化的过程就是细胞分化。在个体发育过程，细胞不断特化，产生多种不同而稳定的细胞类型，所以分化实质上是个体产生稳定性组织差异的过程。

四 细胞分化发生的时期

细胞分化发生于生物体的整个生命过程中，在胚胎期达到最大限度，成为胚胎发育的最重要过程之一。

五 细胞分化的分子意义

从分子意义上看，细胞分化意味着某些特异性蛋白质的优先合成，这是由于在特定细胞中某些基因在一定时间内被激活的结果。目前，虽然发育生物学发展迅速，但从受精卵发育到具有复杂结构的胚胎的分子机制还不清楚。

六．细胞分化概念及其特性总结（见ppt）

第 二节 细 胞 决 定

一 . 基本概念

在能识别一个细胞的分化之前，就有一个预先保证细胞怎样变化的时期，这一阶段通称为细胞决定（cell determination）。细胞在这种被称作决定的状态下，沿着特定类型分化的能力已经稳定下来。 二． 胚胎细胞分化的潜能与决定 1．胚胎细胞的“全能性”

生物体整个生命过程都有细胞分化活动，但这种活动在胚胎期为最频繁和最典型。多细胞有机体起源于一个单细胞受精卵，由受精卵衍生出各种细胞和器官，故受精卵属于“全能”细胞（totipotent cell）。哺乳类8细胞前均为全能性细胞，两栖类囊胚之前只有细胞数量的增加，而没有细胞分化，故囊胚之前的细胞为“全能”细胞，原肠胚细胞重排成三胚层后，三胚层衍生出未来的组织器官的轮廓，就开始出现一定的局限性，各胚层细胞只倾向于发育为本胚层的组织器官。 2．胚胎细胞分化的“多能性”

胚胎细胞在发育潜能上过了全能性时期后，逐渐出现了各器官的预定区，进一步局限其分化的潜能，具有演变为多种表型的能力，这种细胞称为“多能细胞”（pluripotent cell）。这种逐渐由“全能”局限为“多能”，最后趋向于“专能”稳定型的分化趋势，是发育过程中，细胞分化过程的一个普遍规律。

3．细胞决定是发育潜能逐渐被的过程

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综述上面两方面内容，可见发育潜能逐渐被的过程即为细胞决定，也就是选择基因表达的过渡阶段。此时的细胞没有可分辨的分化特征，但已经具备了向某一特定方向分化的能力。 4．胚胎细胞分化潜能变化和细胞决定的典型例子（见ppt）

果蝇幼虫期的成虫盘（imaginal disc），成虫盘未分化细胞随着时间的推移分别发育成腿、翅、触角和躯体其他部分。当一个成虫盘移植到另一只幼虫上，被移植的细胞不会失去它们的“决定”，仍能产生成虫的相应部分。研究细胞分化机理的理想材料，是细胞分化前的决定阶段，即，细胞分化前如何选择基因表达的问题。 5．研究细胞决定的两个中心问题

1）、具有全能性的受精卵什么时候获得有限的发育潜能？2）、细胞决定是否可逆？ 6．确定动物胚胎发育的决定时间的方法—胚胎移植

对两栖类研究最多。将原肠早期预定发育成表皮的细胞移植到另一胚胎预定发育成脑组织的区域，被移植细胞发育成脑组织，若到原肠晚期移植则发育成表皮。此移植试验说明，两栖类早期胚胎发育在早原肠胚和晚原肠胚之间的某一个时期开始了细胞决定。 三． 卵细胞质在早期胚胎细胞决定中的重要性

1．决定子(determinant)和细胞质定域（cytoplasm locolization）(见ppt)

不同动物胚胎，全能性的丧失，即细胞决定的时间是不同的。这种不同与卵细胞质中物质分布的不均一性有密切关系。每次卵裂，细胞核物质（包括基因组genome）均匀分配到子细胞中，但受精卵的胞质中物质分布和在子细胞中的分配不均匀。有的物质在细胞中有一定的区域分布，这种不对称性对胚胎的早期发育有很大的影响，在一定程度上决定细胞的早期分化。总之，在细胞中有一定的区域分布，对胚胎细胞的早期分化起一定的决定作用的物质，称为决定子。决定子在受精卵中的特殊定位，以及卵裂时在子细胞中分配的不均匀性，称为细胞质定域。

2．镶嵌型（mosaic）和调整型（regulative）胚胎

依据细胞质定域将胚胎分为两种类型－镶嵌型和调整型

镶嵌型 调整型 有明显的细胞质定域，在胚胎早期细胞已决定决定子的作用较小，细胞间相互作用的影响较大，如海胆（4细胞（如海螺和贝类等软体动物），卵裂时在植物极为全能的）和哺乳类（8细胞前为全能的）受精卵，早期的每个分附近形成极叶（polar lobe）（即胞质外突），下一球都能发育成完整的幼体，这和细胞质的相对均一性有关。 次卵裂也出现，若切除极叶，胚胎发育成无中胚层的畸形，故极叶区有中胚层形成所需的物质，决定子的作用是主要的，细胞间的相互作用是次要的。 3．镶嵌型和调整型之间的界限问题－—无绝对清楚的界线 1）、 海胆卵分为动物极（外胚层，顶部）和植物极（中胚层和内胚层，底部），横切其受精卵，顶部发育成不含内胚层的囊胚，底部发育为不完整的胚胎，说明海胆卵也显示某些镶嵌型的特点。第三次卵裂后，动植物极卵裂球的发育潜能受到了。 2）、 两栖类的蛙卵 一般认为是调整型（因第一次卵裂后的两个卵裂球都能发育成正常的胚胎），但也有镶嵌型特征，因为受精卵的细胞质的赤道部分有灰色新月区，若人为地使一个卵裂球中无灰色新月区，而另一个卵裂球中有之，则只有含灰色新月区的一般能正常发育。说明两栖类胚胎发育中的细胞决定也发生的很早。

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3）、昆虫胚胎发育，既有调整型又有镶嵌型－－模型为果蝇

A：生殖细胞在卵的一特殊部位。受精卵进行核，形成有数千个细胞核的合胞体胚盘（syncytial blastoderm）。极质区形成的细胞较大，叫极细胞（polar cells），为生殖细胞的原基细胞（将来迁移到生殖腺，发育为卵细胞和精细胞） B：极质影响生殖细胞的决定实验：

a 紫外照射卵子后端破坏极质，果蝇不育；

b 未照射的极质注射到照射过的卵子后部，又变为可育的果蝇。

c 果蝇胚盘前端细胞，正常情况不能形成极细胞，若注射极质可形成极细胞

4）、 哺乳类受精卵发育，属于调整型－实验模型是小鼠 A：早期胚胎细胞的决定表现为细胞分化成滋养层和内细胞团，滋养层细胞发育成胚胎的附属结构，内细胞团发育成胎儿。8细胞期前，细胞具有发育的全能性，此阶段被认为是哺乳动物早期胚胎细胞决定的时间。

B：哺乳动物胚胎早期细胞决定机制与细胞在胚胎内分布位置有关，外层细胞－滋养层，内部细胞－内细胞团

实验证据(如何证明这一点)

白色鼠8细胞期的一个卵裂，球置于黑色鼠8细胞期分离来的4个球的，形成一个嵌合体，培养到胚泡，移入母体子宫中，结果是子代为白色品系小鼠，说明由内部细胞发育成的。实验结果说明的问题：a 8细胞期的细胞为全能的，发育的命运还未被确定；b 这些细胞的决定与之在早期胚胎中的相对位置有关。从16细胞期开始，有些细胞被包围在内部，此时为细胞的决定的时间。

4．细胞决定的稳定性和遗传性 1 ）、当细胞决定要走向某一特殊的发育路线时，某些基因进入激活状态，并根据需要准备传递他们的信息，另一些基因要变为长期或永远的沉默，被决定的成什么细胞（如成肌细胞、成神经细胞、成红细胞等）再经过几次复制才开始成体的终末分化，细胞特异的蛋白质合成程序才完全实现。已定向的细胞仍然能，并且将决定的状态传递给子细胞，即一旦细胞决定后，沿着特定类型分化的能力，是很稳定和可遗传的。所谓的细胞遗传，是指产生具有相同决定状态的细胞克隆的现象。 2）、 细胞决定的稳定性和遗传性的典型例子－果蝇的成虫盘（也叫器官芽）

果蝇成虫盘的性状：幼虫体内处于未分化状态的细胞团；变态时（由他们）产生相应的腿、翅、触角等成体结构；不同的成虫盘位于幼虫体内的不同位置；分化方向已决定的细胞团。

成虫盘移植到成体果蝇腹腔中，可一直保持未分化状态，并不断地进行增殖，经多次移植，可保持9年。繁殖1800待后，取出来，移入幼虫体内，当变态时被移植的成虫盘细胞仍能发育成相应的成体结构。说明：成虫盘细胞的决定状态是很稳定，并可遗传，其稳定性和遗传性不受增殖多代的影响。 3 ）、细胞遗传的可能分子机制（细胞决定的遗传性的可能分子机制）

①自催化的自身激活：一些起主导作用的基因编码的蛋白质迁移到细胞核内，不仅激活其

下属基因，而且激活其基因本身。由于这些转录因子（蛋白质）在细胞质中的核糖体上合成，因而也存在于细胞质中，并与两个子细胞共存亡。分配到子细胞的这些因子通过正反馈而增加其本身的合成。于是，补充了因细胞而引起的稀释。这种持之以恒的自我放大，保证了细胞决定状态的稳定和遗传。（如成肌细胞的决定基因MyoD1、果蝇HOM复合体的fushitarazu－Ftz和Ultrabithorax－Ubx等）

②异染色质化－使某些基因长时间的沉默。 ③甲基化－关闭某些基因的表达。

5． 转决定 1 ）、基本概念：

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一般胚胎细胞一旦决定，会沿着特定方向分化，但果蝇中某种突变体或培养的成虫盘细胞中，有时会出现不按已决定的分化类型发育，而长出不相应的成体结构，这种现象叫转决定（transdetermination）。

2)、 转决定的表现和特点

表现是从一种遗传状态转变为另一种遗传状态，它是遗传性突变的结果。

最主要的特点是：转决定不是单一细胞而是一群细胞发生变化； X－射线照射果蝇幼虫，成虫盘中产生一个突变细胞，产生具有一种遗传特征的细胞克隆，以其突变特征与周围其它细胞相区别，因此在转决定组织中，既含有突变类型的细胞，也含有正常基因型的细胞，转决定的细胞一般是变成其他类型的结构，也可以恢复到决定的最初状态。 3 ）、同源异型突变和细胞转决定

①起控制作用的基因调节细胞决定，控制基因突变导致细胞转决定的发生，如头出翅膀或者触角出腿等。即，这种突变表现为身体的一部分结构转变为其它部分的结构，这种现象叫同源异型突变（homeotic mutation），其突变体叫同源异型突变体（homeotic mutant）。

②同源异型突变，实质上是由于控制成虫盘细胞决定的基因发生改变，而导致成虫盘细胞发生转决定的结果。如在转决定中，一个控制基因停止转录或其转录产物功能不适当，结果正常发育的结构就发生了变化。

第三节 胚胎细胞分化

研究细胞分化的标志－——特异性蛋白质的合成，不同类型的细胞含有不同类型的基因产物。当细胞分化时，某一类型细胞仅有某些基因被激活，结果导致各类细胞合成其特有蛋白，以执行其不同的功能。因此，体细胞类型的差异，不是由于它们含有不同的基因组，而是由于被激活的基因不同所造成的。激活或抑制基因表达的因子的来源：细胞内是胞质的特异性，细胞外是相邻细胞的作用和激素对细胞分化的调节作用。 一．核质相互作用

二者缺一不可，胞质提供能量和蛋白质合成的组装物，核则提供mRNA和其它核酸分子的合成模板。基因控制着细胞之中的成分和代谢活动，胞质对基因表达起着作用，二者共同构成了生命活动中矛盾统一的整体。 （一 ）细胞核对细胞质的作用

常用实验方法：核移植，如美国西部蝾螈的皮肤色素是由细胞核控制的。

如何证明：将囊胚的有显性黑色基因的核移植到带有白色隐性基因，经紫外线照射处理的无核卵中，呈现黑色表型。

（二） 细胞质对细胞核的作用

1．常用实验方法：细胞融合、核移植等实验，如终末分化的鸡红细胞与Hela细胞融合，核活化（核体积增大，胞质松散，出现RNA和DNA的合成，核仁重新出现）。Hela细胞中的一种与DNA结合的蛋白质与鸡红细胞核相互作用，使鸡红细胞核某些基因重新被激活。

2． 细胞质内含有一些成分控制基因表达的开关，激活某些基因而抑制另一些基因。实验：爪蟾肾细胞核注入蝾螈的卵母细胞中，经过蛋白质的双向凝胶电泳分析，发现肾细胞核中原来表达的基因不表达了，而原来不表达的基因却被激活表达了。

3． 总之，在细胞分化中，细胞质基因产物不断产生，并加入到原来的胞质成分中，改变胞质成分（各种成分的比例变化），致使胚胎细胞的基因表达环境不断发生改变，核内基因表达状态不断受调整，胚胎细胞逐步决定，不断分化。个体发育中，由于核质间这种相互作用的不断进行，不同的基因，在时空上，按层次有序的逐个表达或关闭，直到不同的终末分化基因的表达，最终形成各种类型的细胞。

二． 胚胎诱导对细胞分化的作用

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（ 一） 基本概念：

某种特异细胞类型的发育和组织特异性蛋白质合成的起始，与不同胚层细胞的相互作用密切相关，这种相互作用表现为一部分细胞对其邻近的另一部分细胞产生影响，并决定其分化方向，此相互作即为胚胎诱导（embryonic induction）。

三个级别的诱导（一般诱导发生在内胚层－中胚层或外胚层－中胚层之间），从诱导层次上看可分为：

初级诱导 脊索中胚层诱导神经板 次级诱导 视杯诱导眼晶状体 三级晶状体诱不同胚层细胞相互作用的结果，导致不同胚层细胞合成组织特异性蛋白质，从而出现组织细胞的分化。

（二 ）中胚层对外胚层的诱导

1 肢体的形态发生由肢芽中胚层决定。胚胎发生中，肢体由肢芽发育而成。肢芽的内部为肢芽中胚层，表面覆盖有外胚层。

两栖类或鸡胚的实验－肢芽中胚层的移植试验：前后肢部位的移植，正常与畸形肢芽中胚层的互换等，证明了肢芽中胚层在肢体的形态发生中起决定作用。

2 皮肤的真皮控制表皮形成不同衍生物。

皮肤中的真皮由中胚层形成，表皮由外胚层形成(细胞产生羽毛、鳞片、毛发等衍生物或外表的角皮层)。用鸡胚做实验较多，真皮移植试验，如鸡腿和翅部位的羽毛不同，足部为鳞片，真皮移植后表皮的衍生物改变。真皮和表皮的相互作用，一方面说明了真皮的控制作用，另一方面还说明外胚层或表皮细胞可诱导形成许多不同的结构。一个典型例子，原脑形成的视杯与覆盖在其上面的外胚层细胞相互作用，诱导这部分外胚层细胞形成眼晶状体。当将视杯移到本来要发育成皮肤的外胚层下，这时由于视杯的诱导作用而形成了晶状体。

（三）内胚层与中胚层的相互作用

主要表现在内部器官形成过程中。消化道开始从内胚层的原肠向中胚层间充质区域生长，两种类型的细胞相互作用，诱导内部器官（唾液腺、胰腺、肺、肝等内胚层细胞）向上皮细胞分化。

具体诱导情况如下：将胰腺前体细胞和胚胎任何部分间充质细胞放在一起，将分化成胰腺腺泡细胞（含有胰腺消化酶）。将唾液腺或肝脏前体细胞和胚胎中部的心区来源的间充质细胞（只能是该来源的细胞）放在一起，才能诱导其分化。说明间充质细胞诱导肝细胞分化有一定的组织特异性。但无种属特异性，如鸡心脏间充质细胞能诱导小鼠内胚层细胞分化为肝细胞。 （四）胚胎诱导的机制

问题：a.不同胚层细胞间相互作用的信息是什么样的物质？b.诱导物以什么方式对靶细胞进行诱导分化? 目前仍不清楚。但初步研究表明：

1． 诱导者组织中存在一种神经化因子，诱导外胚层神经化。另外还有人提出存在一种植物化因子诱导产生脊索、肌肉等中胚层的衍生物组织，还可诱导产生肠、食道、肝等内胚层衍生组织。不同发育系统中诱导物的性质不同，目前认为这些物质可能是一些蛋白和核酸类物质，作用机制不清楚。 2． 胚胎诱导依赖于细胞间的相互作用。其结果对来自果蝇复眼中小眼发育的研究。果蝇复眼是有800个小眼组成的，每个小眼由8个光受体细胞（R1－R8）和12个副细胞组成，光受体细胞R7的发育成熟与相邻的R8细胞的作用有密切关系。R7细胞的分化是受一种同源异型基因－Sevenless（Sev）基因所控制。Sev基因的产物是一种跨膜蛋白，其膜内区段具有酪氨酸激酶活性（与Src、Ros等原癌基因的产物和EGF受体相同，并且其氨基酸顺序具有部分同源性）。该蛋白的外区段可识别外来信号（来自相邻细胞等），然后激活内区段，使靶蛋白酪氨酸残基磷酸化。R8细胞的Boss基因产生一跨膜蛋白Boss(是Sev基因的产物Sev蛋白的配体，bride of sevenless)，当Boss与R7前体细胞的Sev蛋白结合后，使受体二聚化及其酪氨酸残基磷酸化，从而使受体能与其下游的一系列激酶：Drk－Sos－Ras－Raf―――MAPK，通过对一些核蛋白的磷酸化而调节转录，从而调节与

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R7细胞成熟有关的分化基因，使R7细胞发育成熟。

最近发现，秀丽隐杆线虫（C.elegans）雌性外生殖器发育过程中，有类似于果蝇R7细胞发育的信号级联系统参与雌性外生殖器发育的调节。

总之，通过Ras信号传导系统，完成由细胞间相互作用所产生的发育信号（位置信息）的转化，从而将细胞所处的环境与细胞内的基因表达联系起来，诱导细胞分化。这种信号传导系统，在不同种生物个体发育过程中（果蝇和线虫）具有保守性（或叫相似性），说明信号传导作用在胚胎发育中具有重要意义。 3． 细胞外基质（extracellular matrix）在胚胎诱导分化中的作用。两种不同类型的细胞之间，

可通过细胞外基质发生细胞通讯，然后产生相互作用。细胞外基质是糖蛋白复合物：透明质酸，层粘蛋白（laminin），纤粘蛋白（fibronectin），各类胶原纤维等，存在于不同胚层细胞间，以层粘蛋白为主组成一层清晰的结构，称为基膜（basal lamina）。

中胚层 基膜 内胚层（上皮细胞）

基膜在诱导唾液腺形成中的重要作用：在发育的腺体中，如果去掉中胚层和基膜，立即加间充质细胞则不生长；如果继续培养的话，将产生基膜，无间充质则不完全分化，加间充质则完全分化。试验说明：唾液腺形成需要三种要素－——两种不同类型的细胞和基膜，细胞外基质作为一种化学成分在细胞通讯中有重要作用。 『（五 位置信息在胚胎细胞分化中的意义——省略） 一 在肢体形成中，组织器官的建成不仅需要细胞数量的增加，而且还需要它们在空间上的不同分布。在特化区，细胞生长在空间上的局限性对形态发生具有重要作用，可使特化的组织器官保持一定大小形态和空间位置。所以，位置信息就是使细胞能正确地按发育指令进行形态建成。 二 说明位置信息存在及其重要性的实验研究

鸡卵受精3－4天后，在胚胎长轴两侧长出枝芽，进一步发育成腿或翅，所有枝芽中的细胞类型都一致，即外胚层细胞包围着间充质，间充质细胞发育成肌肉，软骨，骨髓等，但是切下翅芽或腿芽移植后形成带有趾爪及鳞片的腿。实验说明：4天胚龄的腿芽和翅芽在组织学上是相同的，说明此处已接受了位置信息。因此说，细胞决定不仅包括使细胞发育成为某种类型的细胞所需要的信息，而且还包括使细胞发育成为一定形态的指令。 三 肢体切除后的再生证明位置信息的存在

两栖类成体动物的肢体切除后可再生（鸟类和哺乳类则不能）。切除后，中胚层细胞产生肢芽－新肢体，其过程与胚胎发育中表现的细胞分化模式极为相似，为精确的重现。说明，残余肢细胞中仍保留着控制细胞分化的特化信息和位置信息。』 （五） 细胞粘着在胚胎发育中的作用

细胞粘着（Cell adhesion）——发育中的细胞具有选择性地与其它细胞相亲合的现象。包括细胞聚集（cell aggregation），细胞迁移（cell migration），细胞识别（cell recognition），细胞粘着在形态发生中起重要作用。 1 细胞聚集

⑴同类细胞间有相互识别能力，依靠这种能力自行归队。典型实验：蛙胚细胞进行重聚合实验，将分散的外，中，内胚层细胞（高pH条件下，培养中的细胞可分散）放在一起，培养后自行归队而重聚合。

⑵胚胎细胞的聚合有组织特异性，即同类型细胞间的聚合速度远大于不同类型细胞间的聚合速度。

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⑶胚胎细胞的聚合没有种属特异性。鸡胚细胞＋小鼠胚胎细胞——不按种属而按同细胞类型重聚在一起，形成不同种属的嵌合体。

⑷聚合体可分化成相应的组织，如肝细胞形成肝子叶，心脏细胞形成心脏组织，此过程与正常胚胎组织发生过程相似。结论：细胞选择性地相互聚集是胚胎组织形成的一个重要环节。 2 细胞迁移

⑴胚胎发育中组织形成的两种方式：a. 基膜（细胞外基质大分子）和特异的细胞连接，维持细胞的粘附，防止分离；b. 细胞游离，迁移，定位，重聚等过程。

⑵细胞迁移是一种阿米巴运动，动物胚胎就像一座充满旅行者的城市，鱼类胚胎中游走的细胞在蠕动攀爬，因胚胎半透明可以看到。鸟类和哺乳动物胚盘中，中胚层细胞并不形成一个皮层或连续的胚层，而像阿米巴虫一样爬行，集聚在外胚层和内胚层之间，当体节裂开时，生骨节和生皮节的细胞迁移。原生殖细胞，血细胞和神经嵴细胞迁移的距离很长。 ⑶ 细胞迁移的机制

细胞迁移和细胞骨架有密切关系，微管在引导细胞运动方向，微丝在细胞收缩方面分别起主导作用，纤粘蛋白对胚胎发育中的细胞迁移起重要作用，即它是细胞迁移的物质基础。若将纤粘蛋白抗体加到体外培养的神经嵴细胞中，使纤粘蛋白钝化，则细胞迁移被抑制，洗去抗体，补充纤粘蛋白后，细胞迁移又恢复。因此纤粘蛋白可能与细胞骨架共同协调细胞的迁移活动。说明富含纤粘蛋白的通路能引导和促进某些细胞的迁移。 3 细胞识别

胚胎细胞迁移到最终位置时，同类细胞相互黏着，而细胞间相互黏着的前提是细胞识别。 ⑴细胞识别的机构是细胞表面的黏着分子（cell adhesion molecule,CAM）。 黏着分子分为两大类：

＋

a 依赖于Ca2的黏着素（cadherin）：E-cadherin(存在于上皮细胞)，N- cadherin（存在于神经，肌肉，晶体细胞），P- cadherin（存在于胚盘及表皮细胞）。这些黏着分子在早期胚胎组织中的细胞黏着中发挥重要作用。

＋

b 非依赖于Ca2的CAM－Ig样的蛋白

研究最多的是神经细胞粘着分子（neural cell adhesion molecule），主要在神经细胞表达。上述两种类型的黏附分子均为跨膜蛋白，其质膜内区段与微丝连接，因而能使细胞间能相互紧密地聚集，若用其抗体干扰细胞的黏着，可破坏胚胎正常组织结构的发生。当不同类型的细胞混合时，同类黏着分子可相互识别和作用，使同类细胞相互黏着而聚集在一起。

⑵细胞粘着分子的表达随组织形态发生的变化而变化。

a 神经管形成并与外胚层脱离时，神经管细胞表面丢失E－cadherin，表达N－cadherin。 b 神经嵴细胞与神经管连接在一起时，大量表达N－cadherin；神经嵴细胞脱离神经管向外迁移时，丢失N－cadherin，迁移后聚集形成周围神经节时，又重新表达。在此迁移和重聚集形成周围神经节时，N－CAM也发生与N－cadherin相同的变化。

⑶在组织形成中cadherin与N－CAM相互协调，在细胞粘着及维持聚集中，cadherin起主要作用，而N－CAM起精细调节作用。

⑷膜整联蛋白（integrin）参与细胞识别 以非同类分子间的相互作用发生黏着。 ⑸选择素（selectins）和凝集素（lectin）

如血细胞与毛细血管的内皮细胞之间的特异性相互作用，淋巴细胞和巨噬细胞与血管壁建立的接触中。

⑹葡萄糖酰化转移酶（glycosyltransferases）为单糖转移酶，位于细胞表面，调节细胞可逆地接触，如半乳糖酰化转移酶（galactosyltransferases）锚定在质膜里，使半乳糖附着在位于邻近细胞表面的受体分子上，介质里没有半乳糖时，这种酶－受体桥可调节细胞黏附；介质里有半乳糖时，

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半乳糖被转移到受体上，酶和受体的结合被解离。小鼠精子和卵子透明带的相互作用就是这种作用机制。

⑺细胞外基质可使细胞粘着聚集牢固

细胞外基质作为配体与integrin结合，integrin又与微丝连接，从而使细胞粘着聚集牢固。 总之，在细胞从组织分离，迁移，定位，同类细胞的识别和黏着过程中，各种黏着分子表达的变化是受到严格的，多种黏着分子以不同的相互作用发挥功能。 三．激素对细胞分化的调节

发育早期临近细胞间相互作用诱导细胞分化，晚期，激素调节分化，激素－血液－不同部位－调节细胞分化，即远距离作用主要是靠激素。激素分为两类：多肽和甾类，作用时必须通过与受体结合。

㈠ 作用机理：不同激素作用于细胞的方式不同 ①多肽激素（促肾上腺素，促甲状腺素等）：该类与其细胞表面受体结合，激活与膜结合的腺苷酸环化酶，由ATP产生cAMP，cAMP激活一些激酶，靶蛋白磷酸化，产生作用

②甾类激素或称固醇类激素（如雌激素，雄激素等）。该类为脂溶性，扩散进入细胞内，与其胞质内的受体结合，进入核内与染色质结合，选择性地激活基因转录。

㈡ 激素作用的水平或靶位

激素作用于：基因、胞质、细胞群体，导致形态发生，主要作用是按预先决定的分化程序引发靶细胞进行分化。

① 激素对基因的激活作用 试验证据：向未成熟小鸡输卵管的一层未分化上皮细胞注射雌激素，诱导上皮细胞，4天后分化形成管状腺细胞，合成卵白蛋白（ovalbamin），到第10天分化形成杯状细胞（合成抗生素，avidin）和纤毛细胞（运动），若停止注射雌激素，蛋白质合成停止，若再注射，蛋白质又重新合成。通过检测mRNA的水平变化，发现雌激素是在转录水平上起调节作用，即注射oestrogen，则卵白蛋白mRNA量增加，停止注射后则其mRNA减少。 果蝇（昆虫）蜕皮素，作用于多线染色体，诱导产生扩大的膨松区（puff），为基因正在转录的区域。早期puff，其产物促进100多个晚期puff产生，扩大了激素的效应。果蝇正常发育中puff的出现具有顺序性。 ② 激素对细胞质的作用

主要作用：使粗面内质网增加，并刺激其合成卵黄蛋白原（vitellogenin）。典型例子：孕酮促进蛙卵母细胞成熟的过程，这种作用不需要细胞核的存在。

③ 激素对细胞群体的作用

包括两个作用：对细胞生长的作用（促进增殖，增加细胞数量），对细胞类型改变（性质上）。

实验证据：大鼠乳腺、垂体等体内生长需雌激素存在，鸡输卵管正常成熟过程中，雌性激

素在上皮细胞分化为管状腺细胞前促进细胞增殖。

激素改变细胞类型的实验证据：爪蟾性别决定实验，爪蟾早期胚胎生长在含雌性激素的水

中，几乎全部胚胎发育为具有雌性功能的个体，一半个体基因型是雄性（ZZ）。染色体为ZZ的雌性个体具有卵巢，能排卵，当与正常雄性爪蟾交配产生ZZ型的雄性个体，功能完全为雄性，取其原生殖细胞移植入雄性宿主中，原生殖细胞分化为精原细胞，当移植入雌性宿主中时，原生殖细胞分化为卵原细胞。说明：宿主环境的性激素对性细胞的分化具有指令性影响。

④ 激素对成体发育及结构形成的影响

典型例子：激素对两栖类和昆虫变态的启动。按着各种细胞预定的发育程序（发育早期已被决定）—－到一定时期生物个体发生变态，变态的发生要靠激素，如两栖类的甲状腺素，昆虫的蜕皮素。

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第六章 成体结构形成过程中细胞分化的基因

整个发育过程受一系列的基因，这些基因按照时间、空间顺序启动或关闭，而且各种基因相互协调地对细胞生长和分化进行。 一．在时间上的－——时间基因

时间基因－在细胞分化的时间中起决定作用的一类基因。这些基因在时间上精确地控制一些发育事件。该方面研究的常用实验模型－线虫，成熟线虫共有959个细胞，例如秀丽隐杆线虫，不同细胞谱系决定这些细胞生长分化的类型，此分化过程受到时间上的精确。这种时控特点是可遗传的。此种线虫的发育经过4个幼虫阶段和1个成虫阶段，在每个阶段末尾要经过一次蜕皮，获得表皮，现发现lin-14基因在其中起控制作用，该基因产物是一种核蛋白，存于晚期胚胎及第一幼虫早期阶段。 二. 在空间上的

1 果蝇胚胎发育程序及体节分化

合胞体的形成（核、胞质）－达到256个核时，向边缘移动－达到512个核时，

后端出现一批细胞叫极细胞（将发育成为生殖细胞）－达到6000个核时，质膜分隔细胞核，边缘形成一层细胞，称此时的胚胎为胚盘（blastoderm）－出现条纹形态的体节－经过胚胎的延长和再缩短过程－出现清晰的体节分界－体腔两侧由成虫盘最终发育成触角、腿、翅等成体结构，这些细胞群的生长受到控制，不会穿过分界线交叉生长，说明成体结构的发育在空间位置上受到精细的。

2 体节分化的基因调节

据对胚胎发育程序的时间先后和对胚胎图式的影响方式，调节果蝇体节分化的基因分为5

类：

①母体效应基因（maternal effect genes）：如bicoid(bcd)、nanos(nos)和torso(tor)等。由卵泡

的滋养层细胞转录其产物， 通过细胞间桥输入卵母细胞，其mRNA的分布为bcd在前部，nos在后部，tor在两端都有。

bcd nos tor

tor bcd

受精后马上翻译成蛋白质，说明卵细胞有前后轴极性，即分子成分不同，这对胚胎发育中体节的分化具有重要作用。若bcd突变导致缺头和胸部体节，头部被尾体节代替。Nos突变导致缺腹部体节。Tor突变导致头尾两端发育不正常，说明bcd、nos、tor分别控制头胸部、腹部、头尾部体节的发育。 ②体节缺口基因（gap genes）：如hunchback、kriipple、tailless等。受精约2小时开始表达。

其mRNA的分布：hunchback于头部到T2体节，其突变导致头后部到第3胸部体节发育异常。Kriipple位于第5－第8副节，其突变导致T1-A5发育异常。因此这两种蛋白弥散扩展至基因转录区以外。故影响范围大。

③体节成对基因（pair rule genes）：如hairy、even-skipped、paired、fushi-tarazu(ftz)等。其

基因表达比缺口基因晚。约在受精2.5小时后表达，合胞体开始细胞化前表达。 mRNA定位：按每2个体节间相隔一定距离在胚胎前后轴进行定位，突变时，单数或偶数副体节消失，然后剩余体节合并成对。对ftz突变后，只剩下7个体节（正常应为14个体节）。因此, 果蝇胚胎体节发育中，这些基因间的相互协调对体节发育的精细调节具有十分重要的作用。

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④体节极性基因（segment polarity genes）：如engraild（刻纹）。在受精后6小时（胚胎切片

原位杂交）开始表达，在每个体节的后部表达，说明刻纹基因对体节后部细胞生长起控制作用。其表达将胚胎分为14个条形区，对每个体节内的前后部分进行细调。其突变导致半个体节缺失和另半个体节的反转重复的不正常发育。如engraild基因。因此，刻纹基因又称区域化基因（compartmentation gene），即对成体结构内部区域化起作用。

⑤ 同源异型基因（homeotic selector genes, HOM genes）

在控制果蝇体节发育中，表达较晚的一类基因，受精后3小时开始表达，但一直延续到成虫期，是最后控制发育为成体果蝇前后各体节形态特征的基因。

A、分类： 按前后体轴顺序将此类基因分为两种基因群，即：触角足复合物（antennapedia complex, Antp-c）和胸腹复合物（bithorax complex, Bx-c），它们均定位于3号染色体上。

Antp-c包含五种基因：labial(Lab)、proboscispedia(Pb)、deformed(Dfd)、sex combs reduced(Scr)、Antennapedia(Antp)。

Bx-c包含三种基因：Ultrabithorax(Ubx)、Abdominal A(Abd-A)、Abdominal(Abd-B)。这些基因在染色体上的定位顺序与其沿体轴前后的表达顺序一致。它们决定各个体节的特征，其突变导致不同体节的相互转化，如Antp突变：头部的触角转变成腿。

研究较多的是Bx-c: Bx-c长300kb, Ubx，Abd-A, Abd-Bg各100kb，外显子占小部分，大部分为内含子，故编码区少，非编码区存在于其gene 的序列。来自母体效应gene，体节缺口gene和体节成对gene的蛋白质为Bx-C的因子，与Bx-C的不同基因序列结合，对Bx-C基因沿前后体轴在空间和时间上的有序表达起非常重要的调节作用。

更详细的讲，Ubx产物分布于P5-P12副体节，P5、P6浓度最高；Abd-A产物分布于P7-P14副体节，P7-P12浓度最高；Abd-B产物分布于P10-P14副体节，P12、P13浓度最高。故Bx-c控制P5-P14副体节的发育。若Bx-c突变T2以后体节异常发育，停留在T2的形态，导致胚胎死亡。Ubx主控T3和A1发育，若突变导致T3以后的所有体节均转变成T2形态。Abd－A主控A2-A4发育，若突变，A2-A4发育异常，A5以后的体节亦不能正常分化，结果A2以后的体节均转变为A1形态。Abd-B主控A5-A8体节发育，若突变，A5-A8均转变为A4形态。可见，Ubx突变不仅影响胸部体节的发育，还影响腹部体节的发育，说明Abd-A和Abd-B基因调节活动中，不仅需要Ubx基因，还需要有Abd-A参加。Ubx、Abd-A、Abd-B基因之间这种逐级影响的关系，说明了Bx-c基因组在胚胎体节发育中的空间顺序关系；这种关系不仅在Bx-c基因之间，在整个HOM基因间也存在。如Antp基因激活自身，也能激活Ubx的表达，而Ubx产物对Antp的表达起抑制作用。 B、同源盒（homeobox）发现的意义

最初，用Antp的cDNA鉴定Antp基因在染色体上的位置时，发现Antp cDNA的探针不仅与Antp基因编码区，而且与相邻的ftz基因的DNA序列也杂交。说明Antp和ftz有共同的DNA片段。后来在Ubx中也找到了相同的DNA片段，然后，以该段DNA为探针找到许多同源异型基因中的相同DNA片段，并将这个共同的DNA片段称为同源盒。同源盒有180bp，编码60个氨基酸的蛋白，并发现这些基因（Antp、ftz、Ubx）的同源盒有80－90％是相同的。

后来在其他无脊椎动物（如甲虫、蠕虫等）和脊椎动物中也找到了同源盒序列，并发现各种动物的同源盒有60－80％的氨基酸顺序是相同的。

同源盒的结构特点及其对基因转录的：富含碱性氨基酸，其蛋白具有螺旋－环－螺旋（HLH）结构域，说明它是可与DNA能结合的转录调节因子（如刻纹基因等），通过与DNA直接结合的方式改变基因表达，从而对胚胎发育进行。 C、 哺乳类和果蝇同源盒基因复合物的比较

在人和小鼠已克隆出4类具有同源异型盒序列的基因，统称为Hox复合物（Hox complex,Hox-c）。在小鼠中命名为Hoxa、Hoxb、Hoxc、Hoxd；在人类中命名为HoxA、HoxB、HoxC、HoxD。各类基因定位于不同的染色体上，在染色体上的排列顺序是沿胚胎体轴从头到尾，此特征

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与果蝇的HOM基因极其相似。小鼠Hoxa1和Hoxa3控制鼠胚胎前区一些结构的正常发育，Hoxb4控制第2颈椎的正常发育，这些基因的模式与果蝇基因HOM的极相似，对这些基因的研究有可能为阐明某些人类新生儿发育不健全的疾病带来希望。哺乳动物Hox-c与果蝇的Hom-c为结构同系物，不仅在同源区的氨基酸（aa）序列上具有高度的同源性，在胚胎发育中，在前后体轴上的表达和调节部位及其功能上也非常相似。还有更多的例子可以说明HOM与Hox的相似性。

总之：HOM与Hox基因间的结构同系物，对胚胎前后体轴结构发育的特征具有惊人的相似性。说明HOM与Hox的结构同系物分别是由一个共同的祖先基因演变来的。尽管果蝇和小鼠及人类在成体结构上差别很大，但在胚胎发育中，在体节结构分化这类空间信息的基因活动中，仍保留某种相似的基本模式。 三、胚胎体节发育的基因特征

在果蝇体节发育中，各类基因具有严密的表达、调节顺序。缺口基因最早表达的Hunchback基因的转录活动受到bicoid蛋白的，而Hunchback蛋白根据其浓度对其它缺口基因的转录起激活或抑制作用。

母体效应基因及缺口基因调节体节成对基因的转录，体节成对基因则参与体节极性基因表达，以次呈现对每个体节前后两部分细胞发育分化的调节。

说明：控制果蝇体节分化的各类基因不仅具有在时间与空间上的表达顺序，而且表现出不同类基因逐级控制的特征。

四、发育基因参与形态建成过程的方式。

这些基因对形态建成的指导作用，表现在特定的表达时间、表达部位和表达量及其浓度梯度分布等。参与的每一种参数，若有改变，都可能导致发育异常。

根据这些发育基因的蛋白的功能特征，可将这些基因的产物分为4类：①转录调节因子； ②物质转移和定位系统； ③膜结合受体及配体系统； ④信号转导系统； 1．转录调节因子（例子很多）：

HOM-C和Hox-c基因产物都具有HLH结构域，能与DNA结合。这些蛋白都属于转录调节因子。其中有些蛋白根据其表达的量对靶基因的转录进行调节，如Hunchback蛋白在高浓度时对krüpple的表达起抑制作用，而当下降到临界浓度以下时则起激活作用。 2．物质转移和定位系统：

母体效应基因的mRNA在滋养细胞中合成，这些mRNA通过细胞间桥输送到卵母细胞，并定位于卵母细胞的不同部位，这种mRNA的输送及其不同的定位都与细胞内微管（MT）的分布有关。

卵母细胞中有微管组织中心（MTOC）,而卵泡细胞中没有MTOC, 由卵母细胞MTOC发出的MT穿过细胞间桥到达各个滋养细胞。滋养细胞合成的物质通过此MT的介导输送到卵母细胞。如bicoid mRNA可与MT结合，MT在卵细胞内的前后梯度分布对bicoid mRNA的定位有影响，MT解聚，bicoid mRNA无法定位，MT重新聚合，定位便可实现。

不同基因产物的定位分布受其他基因产物的控制：果蝇早胚中hunchback mRNA的来源有两部分，受精前合成，分布于整个卵细胞；受精后合成，只分布于胚胎前部，其蛋白质相应只分布于前部。母体来源的mRNA（即受精前合成的部分）的翻译活动受母体效应基因nanos的蛋白的抑制。结果使hunchback蛋白分布仅在胚胎前部，胚胎正常发育。若缺失nanos，母体来源的hunchback mRNA在胚胎后部也翻译成蛋白，后部体节不能形成，导致胚胎死亡。 3．膜结合受体及配体系统:

母体效应基因tor（控制果蝇胚胎前后端部结构发育）的产物定位于细胞膜，为具有酪氨酸激酶活性的受体蛋白。其配体tor样蛋白分布于卵黄膜中（受精前由卵母细胞合成的）。受精后激活tor样蛋白，作为细胞外信号分子与其受体tor蛋白结合，tor的酪氨酸激酶活性被触发，通过前述的复眼R7细胞分化相同的信号转导通路，激活缺口基因hunchback和tailless的转录，参与调节果蝇端部结构的发育。

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果蝇早胚背腹部发育的体系中也有类似的受体配体系统。 4．信号转导系统：

如复眼的R7细胞的Sevenless， 控成体端部结构发育的tor基因产物为膜蛋白，胞外信号作用→受体蛋白磷酸化→Ras→Raf磷酸化级联反应→转化为核内转录信号→靶基因的转录活动受调节。 第七章 胚胎发育中的程序性细胞死亡 一、动物胚胎发育中细胞死亡类型

发育过程中的细胞死亡通常是程序化的，即在特定的时间和部位发生控制性的细胞死亡。若这种精确调节的细胞死亡程序改变，可引起多种先天性发育异常。

细胞死亡类型：1、调亡性细胞死亡（Ⅰ型），特点是：细胞固缩，细胞与细胞间接触破坏，细胞片段化（细胞核DNA也片段化），邻近细胞的吞噬及继发性溶酶体降解细胞片段。见于鼠趾间区的形成；2、溶酶体性的细胞死亡（Ⅱ型），特征：初级溶酶体形成，然后细胞固缩和片段化（细胞核DNA也片段化）。见于变态过程中两栖类动物尾巴的消失；3、坏死性细胞死亡（Ⅲ型），特征：细胞膜受损，肿胀，破裂，内溶物漏出等。见于骨化前胚胎和骺软骨的形成。这三种类型的细胞死亡均见于胚胎发育中。

二． 胚胎发育中的程序性细胞死亡的证据

1．中枢神经系统发生中的程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD） ①神经板向神经管转化

鼠胚：9~20体节期神经沟的闭合首先发生于颈区，神经管闭合前在神经－体节连接处（neuro-somatic junction）可见细胞死亡；神经管闭合后，（鼠）沿头-尾轴的背侧中线亦存在细胞死亡。除沿脊椎CNS背侧中线各段有PCD外，其腹侧亦存在细胞死亡区，其中以间脑和终脑连接处及视泡外突后的胚胎视网膜和视蒂的背侧中线最为明显。

鸡胚：第10期和第11期的间脑和中脑部细胞死亡率低，而第11期菱脑1和菱脑2联合处以及菱脑顶部神经管的背侧壁有大量的细胞死亡。另外，17~19期脊髓可见3个细胞死亡区，即背侧固缩区（18期死亡细胞数最多）；腹侧固缩区（17期死亡细胞数最多）；底板固缩区（19期死亡细胞数最多）。

②神经元细胞的死亡

PCD诱导胚胎发育中80%以上的神经元死亡。

已证明：中枢神经系统（CNS）和周围神经系统（PNS）大部分区域的发育过程中存在特定的神经元细胞死亡期。而神经元的死亡具有时空顺序。

例如：鼠胚：第10天神经元细胞死亡罕见，第14天约70%的大脑皮层细胞死亡；第18天约50%的皮层细胞死亡，而成年鼠皮层细胞几乎无死亡。PCD发生于全皮层，多数位于增殖活跃区。神经元的死亡是调节神经元的数目和连接的重要方式。

出生后CNS仍存在神经元的PCD，主要发生于出生后一周内。小鼠大脑皮层：出生后第一周内凋亡细胞数目进行性增加，其高峰位于出生后第5~8天，之后下降。丘脑中PCD神经元少见。小脑颗粒细胞数目的减少主要见于出生后3~5天（20%~30%），出生后5~9天小脑颗粒细胞广泛出现核DNA片断化。因此，推测小脑颗粒细胞在突触形成前死亡可能有助于调节细胞的数目。 2．管腔形成中的程序型细胞死亡

发育中的脊椎动物最常见的结构元素便是管（腔）道。在管（腔）道形成处可见细胞死亡。并发现外胚层细胞的外层可诱导其内层细胞的死亡。例如：在小鼠胚胎前羊膜腔的形成时有PCD。另外，人肝内胆管发育的全过程中均伴有PCD。 3．肢体发生中的程序型细胞死亡

肢体发育中最重要的事件之一便是细胞死亡，以使肢体具有特定的造型和曲线。如：鸟类和哺乳类动物指（趾）的形成中有大量的细胞死亡。（但是在有蹼动物如鸭，在趾间蹼区很少或没有细胞的死亡）。

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胚胎肢体发育中PCD呈顺序性。观察鼠胚妊娠11~15天肢体发育中的PCD，发现：PCD发生于手（足）间充质细胞，而并不是表面外胚层细胞。指（趾）的形成过程中，指（趾）的间充质细胞的PCD从近手（足）端开始并向远端扩展。PCD开始发生的部位决定了指（趾）形态、掌骨和指（趾）骨的分离和关节腔的形成。指（趾）间区的PCD于胚胎第13天最强烈。胚胎4~5天，PCD于手、足板的胫骨，腓骨边缘大量发生，防止多指（趾），并指（趾）等畸形。

PCD开始和终止的定时效应，PCD发生的部位、强度、时限，由近及远进展的方向等均由遗传决定。

4．生殖细胞发育过程中的PCD ①卵发生过程中PCD

早期的形态学分析表明：99.9%以上的卵泡发生退化过程，导致生殖期内的卵泡闭锁。女婴出生时约有200万个卵母细胞(为胚胎期的20%),青春期仅剩下40万，其中400个可发育成熟并排卵，其余都闭锁。分析表明，卵泡的闭锁是典型的PCD，即：PCD构成了卵泡闭锁过程的基础。

研究鼠胚特定发育阶段原始生殖细胞的凋亡情况，证明雌性鼠发育12天时未见凋亡细胞；13天－17天时有卵母细胞凋亡。 ②睾丸生精细胞的PCD

雄性鼠发育到12天时无PCD，13~17天可见原始生殖细胞凋亡。出生前后约有半数生殖细胞死亡，死亡细胞被睾丸支持细胞吞噬。这些生精细胞的凋亡分为3个时期：a 早期（核内染色体游移到核边缘）；b 中期（凋亡小体）；c 晚期（仅见凋亡小体碎片）。另外，生精细胞的凋亡与鼠的发育期相关，16~28天鼠睾丸内DNA片段含量是8天鼠的1.8~2.0倍。此时PCD最活跃。（灵长类和人类睾丸细胞PCD的报道较少）。

5、脊椎动物胚期泌尿器官发育与程序性细胞死亡。

哺乳动物和其它高等脊椎动物在胚胎发育阶段，泌尿器官和生殖器官均起源于中胚层，二个系统均明显出现暂时性生存的结构。这些结构在成体已消失，但它反映了动物进化历史的过程。高等动物成体阶段结构常在胚胎发育较晚阶段出现，而那些早期出现的，较原始的，而且最终将消失的器官、组织，在它们消失前，常对进化较高级器官的形成起着重要的作用。

脊椎动物泌尿器官起源于体节旁侧的间介中胚层，由它陆续发生前肾→中肾→后肾的分化过程。肾的3个发育过程有顺序诱导作用，即前肾诱导中肾形成，中肾又诱导后肾形成，并且各组成细胞之间又有相互诱导作用。前肾是原始的肾，在脊椎动物发育中很早发生，但除原始鱼类外，在所有脊椎动物体内都己退化。虽然，前肾在发育过程中非常早退化，但它的管道系统却保留下来，对中肾、后肾及生殖系统的发育起着主要诱导作用。前肾发生时，前肾管从前肾向后生长，直通肛门前的消化管。中肾从未分化的生肾组织发生，它受前肾管的诱导向中肾方向分化，中肾的肾小管与中肾管相通，至此，前肾管改称为中肾管。在发育时，如果前肾管被破坏，则从破坏处后段就没有中肾的分化。后肾是成体终生肾，它的形成依赖中肾管。在中肾管后端产生输尿管芽，它朝生肾组织的前方生长，形成后肾管或称输尿管。当输尿管芽与生肾组织接触后，即诱导形成后肾。如果中肾管后端被破坏，则不形成输尿管芽，也就不能诱导后肾的发生。输尿管芽作为后肾发育的诱导者，当它伸入间质，使间质诱导分化并增殖，同时，输尿管芽被诱导而分支。

上述的发育过程中,无用组织的消失过程是有选择性的,预定死亡的细胞在特定时间和部位退化而消失,而整个动物体仍继续生长发育,有实验将大鼠胚胎发育13d的后肾间质分离出来培养,可见未诱导的间质出现程序性细胞死亡所特有的形态特征,如核碎片、核质凝集、细胞核内DNA降解为200bp的小片段。

6、免疫细胞的程序性细胞死亡

程序性细胞死亡是组织发育和细胞增殖过程中维持细胞数目平衡的一个基本功能机制。免疫细胞的增殖和死亡是免疫系统保持自身平衡的重要条件，各种免疫细胞都存在程序性细胞死亡现象。到目前为止，啮齿（nie chi）动物的胸腺细胞在激素等诱导下发生程序性细胞死亡过程仍是程

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序性细胞死亡研究的经典模型。

6.1． T细胞发育与程序性细胞死亡

胸腺是T细胞成熟的场所，根据细胞数目动态观察结果显示，胸腺是一个产生大量短命细胞的场所。据计算，每天进入小鼠胸腺的干细胞仅有100个左右，（STEM CELL，是指后，其子代仍能进行的细胞，可分两种情况：一是后所产生的子代均为与亲本相同的干细胞；二是后产生两类细胞，一为干细胞，一为祖细胞。祖细胞再后只能向一个方向继续分化，最终成为具有特定功能的成熟细胞。后仍产生干细胞的称多能干细胞，而祖细胞则属单能干细胞）

淋巴干细胞增殖的两种方式

（1） （2） 干细胞 干细胞

干细胞 干细胞 干细胞 祖细胞

特定功能的细胞

尽管每天进入小鼠胸腺的干细胞仅有100个左右，而胸腺每天可产生2300万个胸腺细胞，其中97％新生细胞的寿命只有3～4D，只有3％发育为成熟T细胞。研究表明，胸腺内90％以上的未成熟胸腺细胞都要通过程序性细胞死亡过程，选择性清除自身反应胸腺细胞，它是防止出现自身免疫的一个重要机制，也是免疫细胞发育生物学的一个重要组成部分。

淋巴干细胞通过血流进入胸腺，在胸腺内发育、成熟过程中发生基因重排和分化，同时胸腺细

胞要经过严格选择过程，即阳性选择和阴性选择。胸腺细胞的阳性选择导致CD4＋和CD8＋

细胞的出现和发育；胸腺细胞的阴性选择是特异性清除自身免疫性T细胞克隆，有效地防止自身免疫的形成。大部分胸腺细胞是未经阳性或阴性选择过程，因此其平均寿命只有3～4D。胸腺发育过程中，利用程序性细胞死亡机制，去除潜在的自身反应性T细胞克隆。如果胸腺发育过程中，程序性细胞死亡受阻，则形成自身免疫性疾病。但阳性和阴性选择过程中大量细胞死亡的具体机制尚不十分清楚。胸腺细胞发育涉及Bcl-2、c-myc等原癌基因的表达和调节。现发现，越来越多的癌基因及核转录因子与胸腺细胞程序性死亡之间有重要关系。 6.2． B细胞发育与程序性细胞死亡

B细胞在骨髓中发育，经历祖B细胞、前B细胞和未成熟B细胞及成熟B细胞阶段。在进入外周前，大量骨髓B细胞死亡，此现象类似T细胞在胸腺经历的阳性死亡。现己证实，各阶段B细胞均以程序性细胞死亡机制被清除，但其发育过程和机制均不如T细胞发育过程清楚。B细胞亦易被诱导发生程序性细胞死亡，通过选择过程，表达高亲和力抗体的细胞被保留，而不产生高亲和力抗体的细胞则通过程序性细胞死亡机制而死亡。B细胞根据其分化不同阶段对抗原的刺激有不同反应。前B细胞在发育过程中必须经历免疫球蛋白的基因重排。基因重排未成功的B细胞将发生凋亡，重排成功的前B细胞最先表达膜表面IgM。如果前B细胞在此阶段接触抗原将会死亡，这是机体清除自身抗原反应细胞的一种机制。免疫系统中其它细胞，如嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和单核细胞都与炎症发生有密切关系。体外实验表明，这些细胞在各自炎症中的作用可通过细胞因子对程序性细胞死亡的发生加以调节。 7．造血控制与程序性细胞死亡

机体正常造血过程是非常复杂的，不仅是细胞数量的增多，更重要是其功能的分化。在正常发育过程中，血细胞的死亡完全是一种生理性死亡过程。成熟血细胞由骨髓中的造血干细胞产生，在骨髓微环境中，干细胞的发育受各种刺激，包括与其它类型细胞之间生理性相互作用、细胞外基质分子，如纤维粘连蛋白以及生长刺激因子等的相互作用。这些调节因子一起刺激，影响干细胞向血

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液中成熟细胞的发育和过渡。现已鉴定和克隆出与干细胞发育有关的18种生长因子，有的具有生长刺激作用，而有的则具有生长抑制作用。不仅造血干细胞的增殖和分化过程需要生长因子的刺激，而且细胞的生存也需要细胞因子持续不断地刺激。因这些生长因子撤除之后会造成干细胞程序性细胞死亡。在体外，如果移去生长因子则造血母细胞快速凋亡。 8．血管系统发育中的细胞死亡（PCD）。

鸡翅芽血管系统发育中有血管退化的独特区域。新血管区以空间和时间模式为特征出现，而且与发展中软骨的位置相关。对翅芽切片中内皮细胞进行双标，可以分析微血管的消失。（通过向26-30期鸡胚中注射荧光标记的低密度脂蛋白 (DiIacLDL)来标记特异性吸收乙酰化低密度脂蛋白的内皮细胞）。结果表明血管于软骨明显分化前在预定区消退。

鸡胚中，中肾和后肾都有一个肾门系统。中肾的门静脉系统退化。一些中肾的血管表现出血管生成过程来拓殖后肾，然而另外一些中肾的血管表现出退化的迹象，并和中肾一起退化。

三、胚胎发育中程序性细胞死亡的生物学意义

PCD与胚胎发育中细胞、组织和器官的发生密切相关，具有重要的生物学意义。 1．淘汰没有作用或不再起作用的细胞。

如在胚胎发育中80%以上的神经细胞和70%~95%的淋巴细胞以及80%的卵母细胞的凋亡，以保证那些有功能的细胞的营养和空间需要。另外，PCD还可以消除没有形成突触连接的神经元。 2．消除胚胎发育中迁移错误的细胞。

胚胎发育中有广泛的细胞迁移现象，如原始生殖细胞由卵黄囊向生殖腺迁移时，若迁移到生殖腺以外的部位时，可通过PCD被选择性的消除。PCD消除异常迁移的细胞可以保证胚胎正常的形态发育。

3．PCD构成胚体重要的防御机制。

如在淋巴细胞中，PCD使能够识别自体的淋巴细胞选择性凋亡，而保留识别异己的淋巴细胞；PCD使整合有病毒DNA的宿主细胞DNA断裂，用于消除病毒感染；另外，一些细菌、药物或物理因素引起的胚胎细胞的损伤也将通过PCD消除。 四、胚胎发育中程序性细胞死亡的调节

1．激素水平的调节：胚胎发育受到多种激素的调节，以甲状腺素、胰岛素和性激素最为重要。 例1：两栖类动物变态过程中，尾部和鳃部细胞100%死亡，变态中所有细胞的死亡均受甲状腺素的控制。甲状腺素可过早地启动培养的蝌蚪整体和组织发生PCD，外源性的催乳素可阻断甲状腺素的这一作用。反过来的证明：切除甲状腺的蝌蚪的尾、鳃不退化。

进一步研究表明：甲状腺素可诱导自身受体基因的表达，而催乳素则阻断甲状腺素活化的基因的表达。

例2：闭锁卵泡的卵泡液中雄激素/雌激素的比例升高，雄性激素促进颗粒细胞凋亡，而雌性激素则抑制其凋亡。

卵泡刺激激素（FSH）或人绒毛膜促性腺激素（hCG）或黄体生成素(LH)则可防止培养的排卵前的卵泡发生PCD。

例3：生精过程中，大鼠的垂体被切除后，睾丸生精细胞的PCD升高，补充FSH和LH，或睾酮可以抑制PCD。

例4：胰岛素可以抑制鸡胚晶状体上皮细胞的PCD过程，它是晶状体上皮细胞的分化因子和存活因子。

2．细胞因子的调节

细胞因子（cytokine, 在动物受感染后产生的一类信号传递蛋白或肽物质，在功能上类似于激素，在细胞通讯中起局部介体作用, 如干扰素、白介素和肿瘤坏死因子等等），主要是生长因子，与胚胎发育中PCD密切相关。主要包括：NGF，神经营养因子（NT）、FGF、转化生长因子（TGF）

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以及集落刺激因子（CSF）等。生长因子的缺乏可促进PCD的发生。 例1：胚胎发育中NGF的缺乏可以导致神经元的PCD。

例2：在指（趾）细胞死亡前将含FGF-2或FGF-4的肝素珠子植于鸡胚下肢肢芽的指（趾）间组织，可见组织增生，形成蹼状趾，说明FGF-2或FGF-4可以抑制指（趾）的细胞PCD。

例3：G-CSF是粒系造血调节因子；G-CSF受体缺陷，小鼠骨髓嗜中性粒细胞的祖细胞数目减少，血液中嗜中性粒细胞易于凋亡。说明G-CSF可抑制PCD。 3．基因水平调节 例1：线虫发育中，特定细胞出现PCD，其PCD由细胞死亡基因ced-3和ced-4以及存活基因ced-9控制，ced-9抑制PCD的发生。

例2：脊椎动物中也发现参与PCD的诱导或抑制的基因。如P53基因。当DNA损伤时，P53基因产物便阻止细胞周期运行（G1 arrest），使细胞有足够时间进行DNA修复。一旦修复失败，P53基因便诱导PCD。bcl-2基因与线虫的ced-9相似，其基因的表达可以阻止PCD的发生。另一个PCD相关基因是fas，在某些细胞因子如TNF-γ，TNF-α作用下fas基因表达产物Fas抗原，Fas与抗Fas单抗交联诱导PCD。如细胞毒性T细胞，表达 Fas配体（FasL），FasL诱导表达Fas的细胞发生PCD。

与胚胎发育中PCD相关的基因还包括：reaper, c-fos, c-myc, C-abl, Gil3, WT1, STATs等等。有趣的是，c-myc既可以促进PCD又可增强细胞增殖能力。目前认为c-myc蛋白中促凋亡和促增殖功能区为同一区，其作用机制还不清楚。 4．其他调节因素

一氧化氮（NO）参与果蝇发育。NO参与果蝇发育中机体结构大小的。NO合成酶（NOS）在发育中的成虫盘中表达量高，而果蝇幼虫的成虫盘（imaginal discs）细胞的和之后的PCD决定成虫盘的最终大小和成年蝇的结构。抑制幼虫的NOS表达，引起成年果蝇肥大；但外源的NOS则效应相反。可见，NO作为一种抗增殖剂，调节果蝇发育中细胞增殖和分化间的平衡。 五、胚胎发育中先天性畸形PCD

PCD受遗传精确，在特定的时空按一定的顺序发生，且程度不同。若PCD过早或过晚、过多或过少、部位异常都可引起先天性畸形。已发现，许多胚胎发育畸形均与异常PCD有关。

⑴自身调节失控引起的畸形，主要表现在以下3个方面：1、细胞凋亡过少或缺乏而引起的畸形。如并指（趾），先天性消化道、喉、气管、胆道、阴道、肛门狭窄或闭锁，两性畸形，甲状舌骨囊肿等等。2、细胞凋亡过多引起的畸形，如气管-食管瘘，房（室）间隔缺损，唇（腭）裂，短肢畸形，尿道下裂以及多囊肾和囊性肾发育不良。3、PCD异常有可能增加肿瘤发生。

⑵外界刺激引起PCD导致的畸形。增殖活跃的细胞在毒性药物、辐射、UV照射、缺氧等条件下易于凋亡。已证实，维甲酸（RA）、环磷酰胺（CP）等具有致畸作用。RA可调节细胞对生长因子的反应，诱导PCD，此PCD阻止完全分化的神经元和胶质细胞的形成，导致先天性畸形。在小鼠肢体发育中，RA诱导pdn基因表达和PCD，引起小鼠短肢畸形。环磷酰胺（CP）诱导肢体、尾巴PCD导致畸形。CP剂量为10~40mg/kg，PCD细胞为18%~78%，肢体、尾巴畸形，由趾畸形扩展至无肢畸形，尾巴由扭曲畸形发展到短尾或无尾畸形。可见，CP诱导的PCD为其致畸的原因之一。 六、小结

PCD在胚胎发育和形态发生中具有重要作用；PCD受激素、生长因子和基因的精确调节；异常PCD可致先天性畸形或增加肿瘤倾向。以PCD的适宜调节为靶向的药物和治疗策略为先天性畸形的预防提供了新的机遇和思路。

第八章 变态（metamorphosis）

一、基本概念

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在大多数动物的发育过程中，形态或结构的转变是普遍的现象，在有的动物发育中这种转变是剧烈的、显著的。

动物发育中这种剧烈而显著的形态或者结构的转变的现象称为变态。 无脊椎动物如海胆、贻贝、昆虫等；脊椎动物以两栖类最为典型。 变态的一个突出的特点是它受激素的严格。

研究动物早期胚胎发育已有不少良好的实验模型（如前述），将要讲述的变态是研究后期发育基因表达的理想的实验模型。 二、两栖类的变态（研究较深入）

两栖类的变态是与从水生到陆生的转变相联系的。 1．体形变化

①有尾类（蝾螈）：尾鳍的重吸收、外鳃的消失、皮肤的改变； ②无尾类（青蛙和蟾蜍）：变态更显著，几乎所有器官都发生了改变。蝌蚪的运动器官（尾）消失，后肢和前肢形成；新形状的口出现和舌肌肉发育的同时，蝌蚪的角质牙消失。典型的食草性肠道缩短以适应成年蛙的食肉性。鳃和鳃弓退化，肺增大，为了吸收和排出空气的肌肉和软骨形成。 2．变态过程中的生化变化

①血红素和氧的结合：蝌蚪的血红素与氧气结合速度比成蛙的快，而释放比成蛙的慢；蝌蚪中这种结合不依赖pH，而在成蛙中pH升高，氧的结合增加。 ②尿素合成酶的诱导产生。蝌蚪和淡水鱼一样，是排泄氨的；许多成蛙和大多数陆生脊椎动物一样，排泄尿素。在变态中，肝脏产生从二氧化碳和氨合成尿素所需要的酶，即形成了“尿素循环”。 3．神经系统的变化

①光感受器的光感色素发生变化：蝌蚪时的视赤质变为了视紫红质（为陆生和海生脊椎动物所特有的）

②眼位置的变化： 蝌蚪 眼位于头部两侧 （食草类典型的眼） 右眼的神经支配脑的左边； 左眼的神经支配脑的右边； 视网膜神经元没有同侧投射 支配蝌蚪尾肌肉的神经元死亡 成蛙 眼位于头部前端（双眼视觉对捕食有利） 产生了同侧投射的视网膜神经元，使双眼的输入信号到一边脑的同一部位 蝌蚪时期处于休眠状态的舌神经元开始建立联系 总之，变态中，有些神经元死亡，另一些新产生或者建立新的联系。上述变化都发生在变态过程中，故变态是影响整个机体的一次明显的发育转变。 4．两栖类变态的激素

所有上述的变化都是甲状腺素的分泌引起的。 ①体内：

下丘脑产生促甲状腺素释放激素（TRH: thyroliberin）

↓启动

脑垂体释放促甲状腺素（TSH: thyroid-stimulating hormone）

↓TSH活化

休止的甲状腺（thyroid gland）分泌甲状腺素(Thyroxine, T)T3和T4（T3为主要激素）

↓ 诱发变态

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蝌蚪经过T3或T4处理，可以诱发变态，同时诱发正常发育中成体发育相关基因的表达。 同一激素可以在不同组织中引起不同发育程序。如上述的尾的萎缩、肠和脑结构功能的改变以及前后肢的形成等。所有这些变化都由甲状腺素控制，可被类催乳素（PRL）或新生激素（juvenile hormone）所阻断。PRL使蝌蚪不发生变态。 ②体外实验条件：

变态过程中，激素的诱导以及新生激素的相反的作用都是直接的，而且可以在器官培养的条件下重复。

例如：爪蟾蝌蚪后肢芽在低浓度T3处理下离体培养，可以引起正常的肢体发育。而这种作用能够被催乳素阻止（也可阻止蝌蚪尾部的萎缩）。

因此，可以说变态是研究胚胎后期发育的理想模型。 三、哺乳类的胚胎后期发育的变态

在哺乳类母体和胎儿之间有着紧密的联系。要对晚期的胚胎施加任何实验处理，以分析这一比较缓慢的渐进的变化过程，而不影响母体显然是不可能的。尽管如此，仍然观察了一些变态过程。如：

1、形态变化方面： 青蛙变态中 血细胞、肝中成体血红素和白蛋白基因激活 哺乳类胎儿变态中 成体血红素、（甲胎蛋白）→白蛋白基因活化；皮肤角质化；尿素循环酶的诱导产生与两栖类很相似；脑的结构和功能的变化也与两栖类相似 2、激素调节方面：

现知，甲状腺素在出生前对脑的发育具有重要的影响。在人胎儿出生前几星期，血浆中突然出现T3、T4，随后胶质细胞和神经元的增殖加速。伴随以上现象，新生哺乳类的脑获得了新的功能，如一些感觉功能的出现。关于催乳素在哺乳类发育中的作用了解得很少。 四、激素受体基因的表达

1．甲状腺素受体的种类及其表达

在发育很早的时期，青蛙蝌蚪对甲状腺素就已具有反应能力。爪蟾蝌蚪在3~4天时，即内源激素分泌前，近一个月，就表现了对外源T3的反应，说明甲状腺素受体（TR）在发育较早的时期就已表达。

TR被克隆，不仅是受体也是转录因子。TR属于核受体基因家族中甾体/甲状腺/视黄酸家族。 TR有两类：TRα和TRβ。变态前两者的mRNA含量很低，在爪蟾蝌蚪正常发育中，其含量有一个逐渐增加的过程，然后在变态前突然骤升。用外源T3处理早期蝌蚪，可以使TRα和TRβ的mRNA在24小时内迅速分别升高3~5倍和20~50倍。 2．受体基因表达的调节

受体基因受激素本身自我诱导（auto-induction）。T3受体受T3本身的自我诱导，反映了发育信号反应加速的普遍原理；目前对这种普遍原理的机制还不清楚。但是，激素和其它发育信号受体表达的在胚胎发育后期发育中起核心作用。 五、总结

1．在胚胎早期发育的分子基础的研究中采用了各种实验模型，如果蝇的遗传学、爪蟾、鸡胚和转基因小鼠的实验操作等。变态可作为研究胚胎后期发育的理想模型。

2．变态这一理想模型的最大优点：在自由生活的胚胎中可以应用简便的激素操作，诱发或阻止发育。同时，应用器官培养有可能进一步分析成体基因的表达。

3．发育生物学，完整地说，应包括胚胎早期和胚胎后期发育，为了对发育生物学有一个完整的概念，利用变态实验模型对成体表型进行深入研究有重要意义。

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第八章 胚胎干细胞

第一节 胚胎干细胞的研究史

一 胚胎干细胞的概念：

1 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是从早期胚胎内细胞团（inner cell masses，ICM）分离来的，能在体外培养的一种高度未分化细胞。

2 特性：具发育全能性的细胞，能与早期胚胎聚集，注射到胚泡腔后能参与宿主胚胎的发育，而且能分化为成体动物的所有组织，包括生殖细胞。因此，研究胚胎干细胞具十分重要意义，是当今高等哺乳动物生物工程的核心问题之一。 二 ES细胞的研究史

胚胎干细胞的研究与畸胎瘤（embryoal carcinoma cell--EC）的发现和研究密切相关。1958年Stevens最早发现了畸胎瘤，他把小鼠的早期胚胎移植到小鼠的精巢和肾脏的被膜下，得到了EC细胞。EC细胞极像早期胚胎细胞，具发育的多能性。

1974年，有人（Brinster）把EC注射到胚泡腔内形成嵌合体。但这些EC嵌合率低，很少能生产生殖嵌合。原因是这些EC是非整倍体。后来经筛选，1981年，国际上有5株染色体正常的EC细胞（也称teratocarcinoma stem cell:畸胎瘤干细胞＝EC），用EC细胞进行胚泡注射，虽然多数为正常胚胎，但还是有少数形成肿瘤，有些在成年期又出现恶性肿瘤。

1981年，Evans和Kanfman 用了7－8年的时间利用延缓着床的小鼠早期胚胎在体外培养，分离到了ES细胞。以两人的名字的第一个字母命名为EK细胞。以后有人又分离到小鼠桑椹胚的ES细胞，此后又得到了不同品系，不同性别，不同遗传型的小鼠ES细胞系。1988又得到金黄地鼠的ES细胞。

研究小鼠ES细胞得到两点结论：①特异的内源基因位点突变后，选择出来的ES细胞能产生生殖嵌合体。②用同源重组的方法改良ES细胞的基因组，选择出来的ES细胞克隆能产生生殖系的嵌合鼠。

因此把改变的基因结构导入小鼠的基因库，就能得到新的，遗传已得到改良的小鼠品系。从体外培养的细胞到小鼠的育种之间的通路已打开，并建立了良好的方法学。

家畜动物ES细胞的建立情况：绵羊的ES细胞系未成功，猪ES细胞系已建立但无进一步分化的能力。牛的ES细胞系已建立，应用情况不知。1992年有人得到两株牛ES细胞系，培养到丢失。北大、美国Texas大学分离到兔的ES细胞系。但是否能形成生殖嵌合体却不知道。因此家畜动物的ES细胞应用问题较多。 三 ES细胞的特征及其研究意义 1 特征：

①含正常的二倍染色体，可以说它具有全能性。ES核移植到去核卵内，直接发育成动物个体。 ②它像培养细胞，可在体外培养、扩增、遗传操作、选择、克隆和冻存而不失其多能性。 ③在不同的生长条件下具有不同的功能状态：在饲养层细胞上或在含条件培养基时，才呈未分化状态，其它培养条件下，能分化成多种细胞。若悬浮培养，可形成胚样体，像早期胚胎那样发生有秩序的分化。 2 研究ES细胞的意义：

①ES细胞在培养细胞和个体发育之间架起了桥梁。 ②在体细胞和生殖细胞之间架起了桥梁。

③ 对ES细胞基因组进行基因打靶，把外源基因定点掺入，或把内源基因敲除。因此有了ES细胞可在试管内改造动物和创造动物，可生产：生长快，抗病力强，高产的家畜品种和重大应用价值的药物。

④将ES细胞标记，转入胚胎，研究发育与分化的规律和基因。 ⑤ES细胞还可以成为临床器官移植或修复器官及组织的原材料。总之，ES细胞与基因工程和

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胚胎工程结合使畜牧业、医药工业、临床医学发生重大，为人类创造财富。

第二节 ES细胞的分离和改造

一 ES细胞的分离

小鼠ES细胞成功分离到，方法已成熟，家畜ES细胞分离还未成功。小鼠ES细胞分离虽成功，如何维持其二倍体特性，仍存在问题。所有探索各种动物ES细胞的最佳培养条件是关键问题。

（一） 饲养层细胞的选择

不同饲养层细胞对胚胎ICM行为的影响：不同动物的胚胎对培养条件的反应不同，小鼠胚胎适应性广，对小鼠适宜的条件对其它动物却不一定适宜。所以首先要选择好饲养层细胞。例如：小鼠全胚或分离的ICM在STO（已建立的胚胎成纤维细胞）上能吸附、增值，可得到小鼠ES细胞，而羊全胚或ICM却不能。

（二） 条件培养基和几种分化抑制因子的应用

①条件培养基（conditioned medium，CM）

最早Martin(1981)曾用条件培养基（PSA-1(小鼠EC)的条件培养基）分离到了小鼠ES细胞。故以后常用CM取代饲养层细胞来维持ES细胞。使用CM 的优点：a. 可消除饲养细胞的干扰，得到纯化的ES细胞。b.使ES细胞免受Mitomycin-c致癌剂的影响（因制备饲养层细胞经常用Mitomycin-c处理）（丝裂霉素）。c.手术简便；d.因素简单，可进一步分析（分化的启动和关闭机制，细胞分化关键因子的寻找等）。 ②生产CM 的细胞：

HBC(human bladder carcinoma cell line 5637, 人膀胱癌细胞株)，DSA-1（一种鼠EC）；COS细胞株（LIF转染的COS细胞）； T3细胞（小鼠EC）等等。 ③ CM中所含的分化抑制因子：

除T3的CM富含TGF-β外，其它都含：分化抑制因子DIA(differetial inhibitor), LIF(白血病抑制因子：leucocythemia inhibitor factor); HILDA(human interleukin for DA cell)。实际上，这三种因子是同一分子，因具有多种功能：促生长作用等，对不同的细胞有不同的作用，因而有不同的名称。已用LIF分离到小鼠的5株ES细胞。（TGF-β不能支持ES细胞的生长，甚至有抑制它生长的作用）。

（三） 采取不同的培养策略

用不同培养基培养不同发育阶段的胚胎。

动物的品系、胚龄、培养液中各种添加剂对ES细胞获得率的影响（影响ES细胞获得率的因素）。

『二 ES细胞基因组的操作（或改造）省略

基因打靶定位整合最初的基因工程存在的重要问题：外源基因导入受体细胞后的行为无法控制。随即插入后，易导致内源有利基因结构的破坏和失活，或激活有害基因（如oncogene等）。表达水平也难预测。过高表达导致异常的表型。表达过低达不到预期结果。因此，外源基因的定位整合，提高正常转化的效率是动物遗传工程的焦点。 1 基因打靶定位整合技术的建立

80年代中期，人们选择HPRT基因（急救旁路嘌呤生物合成基因）为工具，探索同源重组定位整合的方法学。

（1） 选择HPRT基因为工具的原因：

a. 它在所有细胞中都表达（包括ES细胞）；

b. 人们对它了解详细（包括结构、功能、染色体的位置）；

c. 它是x连锁，雄性ES细胞半是单拷贝。变化时直接表现在表型上，不会受隐、

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显性的制约。

d. 在组织培养中可以用表型表达来选择，也可以通过表型不表达来选择，在6－硫

代鸟嘌呤（6－TG）或8－氮代鸟嘌呤（8－NG）半存活，正负选择对细胞均无害，都能把突变细胞分离出来。

（2） 同源重组定位整合的含义及方法学：

A. 重组是指：DNA片段据碱基互补原则互相配对，并发生交换的现象（或过

程），导致外源DNA取代其同源的染色体DNA片段，而进入受体基因组。仅非同源重组这一原则，重组数量低，变动大。不能得到定点整合的细胞。因此，必须设计基因靶和选择系统，从而产生了现在的基因定位整合方法学。

B.定位整合方法学：a. 先首选定要改造的基因。b.克隆该基因的全部或部分DNA序列（或靶序列）c.克隆靶序列的载体（即靶载体）。通过插入或置换的手段把靶序列造成突变或引入目的基因。然后把靶序列从载体上切下来使成片性载体。

1986年Thomas 以HPRT基因为靶基因，构建了两种同源重组的靶载体：置换型和插入型，在双重选择性培养基G418、6－TG和G418、HAT中，另有定位整合的ES细胞才能存活下来。

为了把定位整合技术推广到全部基因，靶基因的设计和定位整合细胞的筛选方法成了必须解决的问题。现常用的筛选方法有三种。 2 定位整合细胞的筛选方法

（1） 正负选择片段（positive and negative selection ,PNS）

原理：同时放入两个标记基因，即正选择标记基因（eno基因）和负选择标记基因（HSV-tk）

－

使用双选择培养基；凡随机插入者（tk+neo+）在此培养基中死亡，而定点整合者（tkneo+）在此培养基中存活。

（2） 多聚酶链反应（PCR）

原理：DNA扩增技术，只要合成欲扩增的DNA片段两端引物，并加入Taq聚合酶（和A、T、G、C等），可在短时间内将其拷贝数增加上万倍，专一性极强。故可特异性的扩增发生了同源重组的细胞的DNA片段，通过检测DNA扩增结果鉴定发生定位整合的细胞克隆。优点：不用药处理，可以对少量细胞进行鉴定。缺点：必须对每个细胞的DNA进行扩增，工作量大。 （3） 靶基因借用内源基因的元件表达法

原理：把标记基因（neo）构成一种无启动子的结构包埋在同源靶序列里，当成功的定位整合时，它以内源基因的启动在的调节元件启动转录，转录很多，转录的产物变成融合蛋白的一部分。当随机整合时，基因转录少，因此可以把定位整合的细胞选择出来。此法也叫利用无启动子的标记基因来筛选定位整合的细胞克隆。

总之,ES细胞的基因操作近几年来进展迅猛，获得了巨大成功。同源重组定位整合方法可行；整合后的ES细胞经药物筛选仍能保持其多能性，并能通过生殖系统传递。为应用和理论研究打下了良好的基础。』

第三节 ES细胞在细胞分化和发育的基因研究中的应用 一. 利用ES细胞研究细胞分化

自发现EC细胞以来，有关细胞分化方面的研究工作，许多都是以EC细胞为材料进行研究的。EC的优点：（1）具多能性；（2）在一般情况下不分化，需用诱导剂诱导分化。用EC发现了几种细胞分化诱导剂：视黄酸（Retinoic acid , RA）,二甲基亚砜（DMSO）；二丁酰环AMP(dibutyryl cycle AMP);六亚甲基乙酰氨（hexamethylene bis-acetamide）等等。（RA已用于白血病的治疗）。用EC研究细胞分化的局限性：它为胚胎癌细胞，分化能力有缺陷，在体外不能自发分化，可能已失去了对分化抑制因子的要求。用ES细胞研究分化可克服这些缺点。ES细胞也有缺点：必须在饲养层细胞

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上或CM中才能保持其未分化的状态，因此较麻烦。后来由于CM的出现，以及LIF等细胞调节因子研究的进步，使ES细胞的利用方便多了。

1. 利用ES细胞研究细胞分化有以下三个方面的内容：

1）饲养细胞抑制ES细胞分化的研究

用来阐明调节细胞进入分化程序的决定的作用机制，并找出其调节因子，为应用打基础。如已找出上述分化抑制因子。并研究了多种ES细胞、EC、血液干细胞系（正常和恶性的）和其他正常小鼠细胞的LIF受体。发现：ES、EC、正常小鼠单核细胞和M1细胞（小鼠白血病细胞）上都有LIF的受体。其它正常细胞和恶性血液干细胞没有LIF受体。

LIF的作用：（1）对ES细胞分化的抑制；（2）对M1细胞分化有促进作用。LIF对这两种细胞的相反的生物学作用是在同一浓度发生的。说明：ES细胞和M1细胞通过LIF受体与LIF相互作用的信号通路不一样。 2）细胞分化方向的决定 （1）实验例证：

＋DIA /LIF(即在CM中) ES：分化受抑制

ES细胞 － DIA /LIF（非CM中） 中胚层，分化顺利进行

＋DIA /LIF（即在CM中，再加RA） 体壁内胚层，诱导分化

说明：RA不仅拮抗了LIF对ES细胞的分化抑制作用，而且也影响分化程序的选择。 另外，神经生长因子可诱导ES 分化成神经细胞

3）. 细胞对分化条件因子反应的依赖因素：a. 靶细胞本身；（如CCE ES细胞株与CP1/86ES细胞株对RA反应不同）；b. 靶细胞与环境的空间关系。同样的ES在凝集或高密度时可分化成各种不同类型的细胞，而低密度生长时分化成少数几种细胞。 2. ES细胞定向分化的二步重组诱导

此诱导可分化成能连续生产血液干细胞的ES细胞系。通过两个实验完成。

（1）构建ES细胞胚胎细胞嵌合体，整个胚胎都由ES细胞构成。此ES细胞胚胎能完成整个胚胎期的发育，发育似乎正常，出生后能存活1－2天，然后由于哺乳动物无力和脱水而死亡。主要说明：单独的ES细胞能支持胚胎的发育; ES细胞能分化成身体里所有的细胞系。 （2）在嵌合体小鼠胚胎发育到15.5天时，取其干细胞注射到经X射线致死照射的雌性鼠体内（同基因型的）。这种鼠能存活下来。在注射2－3月内杀鼠取其骨髓、脾、胸腺、淋巴结的DNA，杂交分析证明所有这些组织都来自ES细胞。说明：来自胚胎肝的ES细胞的造血干细胞能贡献给所有血液干细胞，这种血液干细胞与正常鼠的血液干细胞一样也具有旺盛的增值能力。把第二次的重组体R2的骨髓细胞5×105注射到5只经X射线致死照射的小鼠体内，2只存活，Southern杂交分析证明其造血组织也是来源于ES细胞。 二步重组诱导ES细胞定向分化研究的意义：

i. 由ES细胞来源的胚胎肝细胞能直接经X射线致死照射的受体鼠重新形成 造血系统。 ii. 证明ES细胞甚至在体外培养许多代的ES细胞具有全部血液干细胞的发育潜能，能

分化成所有血液干细胞。

iii. 实验的成功鼓励我们去研究 使ES细胞能在体外分化成血液干细胞的途径，以便建

立一种能在体外连续不断的提供造血干细胞来源的体外培养系供临床应用和研究。

iv. 通过二步重组诱导ES细胞定向分化成连续生产ES细胞血液干细胞的活体系统。这

将为未来的基因治疗开拓广阔的天地。

本章总结

1. ES细胞与胚胎细胞一样，能产生调节小鼠胚胎正常发育的信号，也能对这些信号正确反应。

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2. 用ES细胞可以在体外培养系统牛，在细胞水平上分析早期胚胎的细胞分化，同时也可以构建成嵌合体，在凶横的动物的水平上研究和分析与发育有关的基因的功能，基因的活动特征等。总之，自1981年建立小鼠ES细胞以来，对科学和生产的发展显示出了巨大推动力。随着ES细胞技术的完善和发展，将产生更大作用。

第九章 成体干细胞在组织维持中的作用—动物组织的维持

动物出生后①许多只是组织增大体积，不存在发育为不同类型的问题②有一部分组织，如皮肤、血液、小肠上皮组织的细胞寿命较短，需有新生细胞不断代替死亡细胞，在细胞更新中，像早胚时干细胞（未分化细胞）一样的增殖分化，其中包括干细胞群体大小的维持，以及已决定的细胞在完成最终分化前次数的调节等。这样来保持组织总细胞群体的恒定和各种生理功能。 第一节 干细胞增殖与分化

一 多能干细胞和专能干细胞（按分化水平分）

专能干细胞：它的子细胞分化为单一类型的分化细胞；如表皮基层的干细胞（角质化细胞） 多能干细胞：可产生2种以上不同类型的分化细胞。如造血干细胞。 二 皮基层干细胞的分化过程

基层干细胞和由它的子细胞位于周围，共有9个细胞组成柱状细胞群，称为表皮增殖单位（epidermal proliforative unit）。边缘子细胞脱离基底膜后向上迁移→棘细胞层→颗粒层细胞→角质化无核细胞（这层细胞不断死亡、脱落，人体不同部位皮肤更新速度约为2－4周）迁移中，角质化伴随着分化：不同层细胞角蛋白成分不同，角蛋白基因是个大家族，不同层细胞（即细胞分化中）选择不同成员表达。促使子细胞进入分化状态的可能机制（不清）：有一观念认为，这与是否脱离基底膜有关，如分离的成纤维细胞在体外培养：与培养皿基底接触则保持增殖状态，悬浮培养则促其分化。

三 骨髓造血干细胞的分化过程

此类干细胞为多能干细胞，至少可以产生12种类型的血细胞。 证明造血干细胞分化上的多能性的实验：脾结节实验 宿主小鼠←γ或χ射线处理 ↓←注入健康小鼠的骨髓细胞

2周后→宿主小鼠血液中含大量供体小鼠的血细胞，并在脾脏表面生长出脾结节，每个结节为一细胞克隆，每个克隆均由一个供体造血干细胞繁殖而成，故结节数与供体小鼠输入的造血干细胞数成正比。用细胞学方法可以鉴别出处于分化中的红系与粒系血细胞。此实验说明：造血干细胞的发育潜能是多能性的。

造血干细胞分化的调节：起调节作用的特异性蛋白质因子，如红细胞生成素，T细胞生长因子，粒细胞刺激因子等（已提纯）。

调节方式：调节各系造血干细胞的生长及生长速度；这些因子与局部环境相互作用，调节最终分化的血细胞相对数量。如骨髓中红细胞：白细胞＝1：1；脾脏为3：1，说明脾脏环境更适合于红细胞生长；外周血红细胞：白细胞＝1000：1；这种比例还与各种血细胞的寿命不同有关。红细胞平均寿命为120天，白细胞仅为1天左右。 四 小肠隐窝底部干细胞的分化

小肠绒毛上皮细胞的更新是来自于此类干细胞。此类干细胞后，一个子细胞保持增殖能力，回到增殖池，另一个子细胞向上迁移，随着迁移失去增殖能力，分化为上皮细胞，至绒毛顶部死亡脱落（小鼠的整个过程为3－5天）。

五 嗅上皮基底干细胞（定向干细胞）的分化

嗅上皮的三种细胞：基底细胞——定向干细胞，后子细胞失去增殖力，转为嗅神经细胞；嗅神细胞——其轴突与脑部相连，球状顶端有变异纤毛，纤毛上有嗅觉受体，哺乳类的可以存活1

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个月。需不断更新，其邻近的基底细胞为具有增殖能力的定向干细胞； 支持细胞。

第二节 神经干细胞

第一 概念

具备自我更新和增殖能力，并在特定因素影响或诱导下，向神经元或胶质细胞分化的原始细胞。 第二 神经干细胞的分布：

以前认为动物出生后，神经系统发育停止，近年来神经干细胞的发现打破以往的认识，即成体神经系统内仍存在神经干细胞（可）。成年动物脑室下区存在有分化潜能的细胞 据发育或损伤的需要分化并迁移到嗅球、海马、脊髓等处。成年小鼠脊髓内有具有繁殖能力的神经干细胞。成年大鼠海马区有神经干细胞，若将其移入脑室则向神经元和胶质细胞分化。

胚鼠（E10.5d）脊髓尾侧神经管上皮细胞是神经干细胞。其存活需要FGF和鸡胚提取物，可向神经元或各种胶质细胞分化。目前认为神经管上皮细胞是向脊髓运动神经元和其他脊髓细胞分化的一种常见祖细胞。

第三 神经干细胞的标志及其特征

一 特征

自我更新能力，可增殖能力；多向分化能力。 二 标志物

Nestin，波形蛋白，RC1抗原。

三 一般认为：多能干细胞产生神经系统细胞时，先在环境控制下产生各种前体细胞，如神经元的性前体细胞（NRPS）、胶质性前体细胞（GRPS）和绅经嵴干细胞（NCSCs）等，然后再形成相应的成熟细胞。而神经干细胞一般不限定先产生特定的前体细胞，而是在环境因素诱导下直接向某一方向分化。

第四 神经干细胞的分化诱导研究 （目前分化诱导机制不清）

一 生长因子（FGF）（一般与其它培养因子协同作用）

二 aFGF加5-羟色胺（5-HT）能诱导胚鼠皮层及纹状体细胞向多巴胺能神经元分化，单独使用不起作用。

三 神经干细胞因子（标志蛋白等）加神经营养因子（NGF, nerve growth factor; BDNF, brain derived neurotrophic factor 脑源性神经营养因子；NT-3, neurotrophin-3, 神经营养因子3）能诱导早期神经嵴细胞分化。（本应发育为胶质细胞的神经前体细胞体外培养，在FGF作用下可诱导分化为神经元。）

四 TGF-β(transfer growth factorβ)促神经嵴干细胞向平滑肌细胞分化。（BDNF促小鼠海马、皮层、小脑、中脑和纹状体内神经干细胞向不同类型的神经元分化）白血病抑制因子、白介素6、血小板源性神经营养因子调节神经细胞分化。

总之，神经干细胞的分化多数情况下是2种或2种以上因子相互作用的结果。 第五节 神经干细胞的应用前景

优点：有分化潜能；能诱导定向分化；增殖能力强；植入成体神经组织后易存活。故当成体神经组织受损伤后，用特定的环境因素诱导神经干细胞向相应的神经组织或细胞分化，以替代损伤组织或细胞。

随年龄增加，神经细胞不断衰老死亡，补充神经干细胞并诱其分化，以达到修复神经组织的目的。

第三节 骨髓基质干细胞（成体干细胞研究现状）

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一． 究意义

二十世纪末二十一世纪初，干细胞的研究引起了一场医学的性变革，在1999年和2000年两次被评为年度世界10大科学进展之首。干细胞是具有自我更新、高度增殖和多系分化潜能的细胞群体。它既是胚胎发育中的自然增殖单位，也是成人细胞再生及各种组织再生的自然增殖单位。人类个体的发生发育过程其实就是干细胞的自我更新和增殖分化过程。干细胞具有能够稳定生存增殖并保持多向分化潜能的特性，因而是便于体外操作的理想靶细胞；其多向分化潜能使人体干细胞增殖分化形成局部组织细胞，是替代、修复或加强受损或衰老组织或器官功能的理想种子细胞。干细胞特有的生物学特征及潜在生物学应用价值已成为近年生物学领域的热点课题。

在已成人体的胎儿、儿童和成人组织中存在的多能干细胞称谓“成体干细胞（Adult stem cell）”,事实上，人体终生需要干细胞去更新损伤和衰老细胞。干细胞的数量和功能也与衰老密切相关。成体干细胞目前只在造血组织（骨髓、脐带和末梢血）、脑、骨胳肌和脂肪组织中发现，这些细胞在体内和体外均能分化形成一个组织系统的多种类型的细胞，基至能跨系统分化，产生几个组织系统的细胞，如骨髓成体干细胞在合适的体内外环境中可长期生长，也可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、骨髓基质细胞及多种血管内皮细胞，还可形成一种肝脏前体细胞—肝卵园细胞，神经和胶质细胞和心肌。高度纯化的造血干细胞可分化形成肝细胞、内皮细胞和心肌细胞，中枢神经系统干细胞可形成血液细胞、肌和许多其它体组织细胞。成体干细胞的这种跨系统分化特性称为“可塑性（Plasticity）”，但其分化机制尚不清楚，这些细胞增殖、导向、趋化和归巢定向过程及其机制和调节因子也不清楚。

二． 成体干细胞的临床应用研究

干细胞的临床应用是从造血干细胞开始的。骨髓移植治疗血液系统疾病起步于20世纪50年代。到80年代，开始采用外周血和脐带血干细胞治疗血液病、免疫缺陷病、遗传性疾病和肿瘤。

1998年Vacanti用多孔珊瑚与自体骨髓人成体多能干细胞诱导分化成的成骨细胞，再造拇指获得成功。

2000年12月，意大利Quarto医生以自体骨髓人成体多能干细胞定向诱导分成的成骨细胞修复多例损伤的骨骼。

虽然临床应用的病例数目前还不多，但临床效果已展示干细胞临床应用的广阔前景，不仅在体外组织构建方面，在细胞治疗、基因治疗、组织器官再生等方面均显示了巨大的应用潜能。

三．人骨髓基质干细胞的分离、培养，鉴定和分化诱导 （一）人骨髓基质干细胞的分离、培养与鉴定

1、 人骨髓基质干细胞的分离、培养与鉴定等技术主要采用我室现成技术。 （二） 诱导人骨髓基质干细胞分化

1．向神经细胞分化：诱导前24h加1g·L-1碱性成纤维生长因子（FGF）入培养液中以促，再以反式维甲酸作诱导剂，然后观察细胞形态的变化，并采用免疫组织化学法，对诱导后第4天的细胞行巢蛋白（nestin）、神经丝蛋白（NF）、神经元特异性

烯醇化酶（NSE）表达的检测。对第8天的细胞行脂肪细胞特异性苏丹Ⅱ染色。

2．向成骨细胞分化： bFGF能刺激BMSc的增殖。培养的BMSc在体外仍具有成骨能力。地塞米松、β－甘油磷酸钠和维生素C可促进BMSc分化为成骨细胞。

3．向软骨细胞分化：离心细胞形成一个小球，然后用没有血清加了TGF-β3的培养液，培养细胞10－14天可出现关节软骨

4．向肌细胞分化：骨髓基质细胞中加入5－氮胞苷24小时后，继续培养7－11天后，便可分化成肌细胞

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5．向心肌细胞分化：用5－氮胞苷诱导分化，连续筛选自然搏动的细胞培养。

动物胚胎工程与基因工程：

第十章 鱼类细胞核移植

一、前言

最初的细胞核移植是1939年Commandon和Fonbrune在单细胞动物——变形虫中完成的。同种移核变形虫可以生长并繁殖后代。1959年，Danielli将一种变形虫核移到另一种去核的变形虫中，在移核后的变形虫中看到了三种遗传情况：①核遗传；②质遗传；③核和质遗传的混合。因此Danielli认为，在变形虫中细胞核和细胞质在遗传上具有同等的重要性。

由于变形虫的原始性，得出的结论不能代表高等动物的情况。Briggs和King首先在两栖类动物中进行了细胞核移植的研究；其后许多科学家利用该技术对两栖类动物中的核质关系进行了广泛的研究：1、胚胎发育阶段越晚，其细胞核发育的全能性越小；2、爪蟾卵孵化期内胚层细胞核具有全能性，但胚胎发育再往后，移核卵不能正常发育；3、一些分化的细胞（如神经细胞核一些内胚层细胞）没有发育的全能性，即使连续移核，移核卵也不能正常发育；4、移核卵、移核胚胎和移核个体的染色体数目经常为异倍体，而且发育阶段越晚，异倍性越强；5、两栖类得移核只能在亲缘亲近的亚种间进行，种间核质杂交卵很难发育为个体；6、唯一获得移核个体的种间两栖类动物的移核证明，核质杂种后代的性状主要与核相似，但也有一些性状为核和质的混合性状；7、作为受体，处于第一次减数中期的卵母细胞与成熟卵相比，在接受了外源细胞核后具有更高的发育能力。

两栖类及哺乳类动物作为核移植动物的局限性：①两栖类只能在亲缘关系很近的种间进行，经济效益低，难确定性状等；②哺乳类尽管成绩大，但只能在不同品系间进行，操作繁琐，对研究核质关系来说不理想。

童第周等：鱼类核移植。发展了技术、效益高的细胞工程鱼（如鲤鱼即移核鱼）；在核质关系理论研究中发挥了重要作用。现已在种间、属间、亚科间、科间、目间、甚至纲间（哺乳纲和鱼纲）中进行。涉及到十几个组合，有的组合得成鱼，有的组合得幼鱼，有的只得到早期胚胎。 二、鱼类细胞核移植的基本方法 1．显微注射法

大部分是采用此方法完成的。基本步骤如下：（四个方面） ①供体核亲本发育到囊胚期（或其他需要的时期），用镊子剥去卵膜，(然后用发圈切下囊胚放于Holtfreter（赫氏液）的分离液中，待细胞分离为单个，吸入赫氏液中备用)。将囊胚细胞分散为单个细胞放入赫氏液中；

②用作受体的成熟卵挤入冷开水中，待卵膜稍胀起时，用镊子剥去卵膜，也可用胰酶脱膜。将裸卵吸到盛有赫氏液，底部铺有一层琼脂的培养皿中，用玻璃针将卵的雌核挑去，雌核的位置在第二个极体的下面；

③用显微注射针吸取作为供体的囊胚细胞，通过显微操作装置，将细胞核注射到受体卵动物极的。注射针的直径要比囊胚细胞直径略小，细胞在针内呈圆柱体（长度比为1∶2到1∶4），这样注射时细胞膜才能破裂。注入核，注入完整细胞不发育。拔出针后受体卵膜自动愈合； ④ 移出移核卵到赫氏液中，适温下发育。 2．电融合法

利用细胞融合进行核移植是一种新的方法。最早用仙台病毒诱导细胞融合，以后电刺激诱导的融合成为哺乳类动物中普遍采用的核移植技术。鱼类中1988年有成功报道。证实其为可行的核移植方法。

实验过程有3个方面; ①囊胚细胞的获得：

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供体卵受精后，马上用胰酶脱膜。脱膜方法：将受精卵放入冷开水中，在卵膜梢举起时，将冷开水倒掉，加入0.25%的胰蛋白酶溶液（赫氏液配制）。轻摇，以充分发挥酶的作用。脱膜后，将受精卵快速吸至赫氏液内，并以赫氏液洗3~5次，待受精卵发育到囊胚期，取60粒囊胚（使融合液中细胞浓度为104个/ml）于5ml盛有赫氏液的分离液的离心管中轻轻打散，离心去卵黄，经赫氏液和甘露醇（0.2mol/L，三蒸水配制）洗后吸取囊胚细胞。

②受体卵制备：受体卵的卵膜可用镊子直接剥离，但为获得大量的受体卵，应采用胰蛋白酶脱膜，方法同上，脱膜时间：不同鱼卵时间不同，而且与水温和是否摇动有关。如泥鳅种，24℃轻摇20秒可全部脱膜；斑马鱼24℃轻摇7分钟全部脱膜。用胰蛋白酶脱卵膜，发育时期同步，且量大，可满足实验要求。 ③电融合移核：①步中的囊胚细胞经100ug/ml的链霉蛋白酶E(pronaseE，用融液配。融合液：0.2mol/L的甘露醇中含有0.1mmol/LcaCl2)处理6~10分钟（20℃）后，加入到融膜槽中（注：囊胚细胞处理和卵的脱膜应同时进行），然后加入脱膜的受体卵，混匀。开动正旋交变电场（0.6MHz,35~50V/cm）作用30秒，可见囊胚细胞以辐射方式排列于卵的周围。脉冲（400~500V/cm，衰减时间为30us）两次。间隔1~2秒。取出融合卵在赫氏液内洗后，在此液中发育。

图

上述核移植方法的比较：电融合法的优点：①操作易掌握，不需长时间训练；②产量高，每次可处理60个卵以上，每次需时20分钟；③有望于程序化。缺点是：多次试验才能确定最佳技术参数（每次不同）。 三、移核组合的结果

1．获得移核成鱼的组合：

①种内组合：鲫鱼核+金鱼质→2.7%到成鱼；②属间组合：鲤鱼核+鲫鱼质→2.69%发育到成鱼；或反过来，即鲫鱼核+鲤鱼质→0.98%道成鱼；③亚科间组合：草鱼核+团头鲂的胞质→3.6%发育到成鱼。

2．获得移核幼鱼的组合：

①亚科间组合：有的可种间组合，只获得幼鱼，而且收率低，不能发育到成鱼；②科间组合：金鱼核+泥鳅质→5%到幼鱼；反过来只有0.6%到幼鱼（均死于血液循环障碍），斑马鱼核+泥鳅质→0.17%到幼鱼；③目间组合：罗非鱼核+鲤鱼质→0.05%左右到幼鱼（死于血液循环障碍）；罗非鱼核+泥鳅质→0.05%左右到幼鱼（卵黄吸收过早完毕，在能进食以前死亡）。

3．获得移核胚胎的组合：①目间组合：罗非鱼核+金鱼质→大部分到囊胚；②纲间组合：小鼠16细胞期的核+泥鳅的去核卵→25%到囊胚，不能到原肠胚，原因是染色体丢失太严重。 四、培养细胞的核移植

现在还有用体外短期培养的囊胚期细胞核，或肾脏短期培养的细胞核+同种鱼的去核卵中（如鲫鱼）→一条成鱼。

不同种的移植还未得到成鱼。 五、金鱼中的连续移植

双尾金鱼核+单尾金鱼质→得到双尾移核鱼→再移核→得到单尾金鱼→再连续移核→单尾金鱼的比例升高。说明：连续移植核，胞质的作用得到加强，即细胞质具有修饰细胞和原来功能的作用。

六、受精卵雌核的作用

为了研究雌核的作用，童第周先生采用不去核的卵+外源核→结果：发育过程和幼鱼形态与去核卵无差别。后来不少人做了类似的实验，结果与童先生的相同。因此认为：大多数情况下，雌核没有参与发育过程。但是，近来有人发现，雌核参与了发育，参与形式为：雌核与外源核融合成三倍体，此三倍体核至少可以发育到原肠期。 七、多个外源核进入一个受体卵的后果

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显微注射只进入一个核，电融合往往几个核被送入一个受体卵，多核融合能够产生四倍体的胚胎或者是二倍体与四倍体的嵌合胚胎，多核间存在竞争，经过一次或几次卵裂，每个卵裂球中只有一个细胞核时，竞争得到缓解，从而得到了正常发育。 八、外源核入卵的位置效应

显微注射法将外核放到卵的动物极中心；电融合是任意的，因此引起多种发育方式：如果从非动物及中心如卵内得到偏离动物极中心的囊胚，或者出现部分囊胚，二者都难发育下去。 九、影响移核卵发育的因素

移核卵的发育主要与以下5个方面有关：

1、供体和受体的质量：一般供体细胞质量能保证，发育到所需时期可用于实验。受体卵的质量需严格掌握。保证受体卵质量的注意事项：①亲本鱼要饲养好；②催产用激素的计量要恰当；③保证卵不过熟，即催熟的卵马上用于实验；④操作时间不超过30分钟，操作过慢时，常使受体卵的胎盘过高隆起，使卵子的发育力减弱。

2、操作人员的熟练情况：显微注射法的实验结果大都取决于技术水平；电融合要求低，不依赖操作。

3、移核亲本亲缘关系的远近：核质相容性大小随两亲本亲缘关系的远近而变化。亲缘关系远，侧相容性小，反之亦然。当很近时，能够发育成成鱼；远时，发育成囊胚等。

4、供体和受体染色体数目的差异：亲缘关系远近相同时，亲本间染色体数目的差异决定着相容性的大小。如：罗非鱼（2n=46）+金鱼（2n=100）发育成囊胚，，罗非鱼（2n=46）+泥鳅（2n=48）发育成幼鱼。（上述两种均属目间移核组合） 5、供体和受体胚胎发育的特性

① 供体和受体胚胎发育速度的差异。这种差异导致有丝时染色体的丢失，进而使移核卵发育

停止。例：小鼠囊胚核+泥鳅卵时的染色体丢失即属此原因，（发育只到囊胚） ② 胚胎发育的其他特性：

罗非鱼核+泥鳅质组合中，获两条幼鱼，但都不能发育下去。原因：罗非鱼在开口进食以前，其大的卵黄可维持其营养达20天。而泥鳅卵黄少，难以满足移核幼鱼进食前的营养需要，不能继续发育。

十、移核卵发育的模式（归纳为两点加以说明） 1． 移核卵的发育与受精卵的相同 （1）显微注射法对移核后完全相同

（2）电融合：开始时同时进入受体卵的多个外源核均与合子核一样发育，因此最初的发育同时出现多个卵裂球，但至囊胚以前，胚胎开头逐渐得到调整，以后的发育与正常受精卵的相同。

2、移核卵囊胚以前的发育取决于受体细胞质，与外源核的种类无关。外源核此时的作用只是启动卵的发育。前述的多种组合中，不论亲缘关系的远近，移核卵总能发育到囊胚期。发育模式（泛指cell速度，细胞分布）总是与受体卵相同。以上两点说明：在外源核中的基因开始表达以前，外源核的种类不影响移核卵的发育，移核卵的发育受受体卵中控制卵裂的分子的控制。外源核基因开始表达时（原肠胚以后），基因产物会影响到移核卵的进一步发育。 十一、由鱼类细胞核移植得出的结论

1、囊胚细胞核具有发育的全能性。2、属间及亚科间的核质杂交卵可发育为性成熟的移核鱼；主表现核性状，但也表现部分质的性状；也出现新性状，而且可遗传。3、有些亚科间和属间的移核只能得到幼鱼和胚胎，主表达核性状和部分质的性状。4、培养细胞连续移核后，可得移核成鱼，说明此培养的细胞核具有全能性。5、囊胚细胞经连续移核可以加强细胞质的性状。6、核质相容性与两亲本之间的新缘关系、染色体数目差、发育速度差相关。

第十一章 转基因动物：转基因鱼

一、 前言

1、转基因动物的研究史：

（1）转基因动物：80年代早期，产生了一项技术，即将外源基因导入小鼠受精卵，产生携带外源基因的小鼠品系，这种带有外源基因，并能通过其生殖细胞将外源基因传达室给后代的动物称“转基因动物”。已得到的转基因动物：线虫、果蝇、海胆、两栖类、鱼类、小鼠和家畜等。 （2）转基因动物的应用：a考察发育和发育的基因调节机理，致癌基因的作用机制和免疫系统内部错综复杂的细胞反应。b建立基因表达体系：微生物、真核细胞和大动物“加工厂”。

（3）转基因鱼的研究史：鱼类是低等脊椎动物，在进化上处于重要地位，是转基因动物的极好材料。我国朱作言1985年首次报道鱼类转基因实验结果。继中国之后，世界上有几十个实验室先后开展了这一项领域的研究工作。我国的中科院水生所、发育所、青岛海洋所等从事这方面工作。 （4）鱼类作为转基因动物研究材料的特点：a产卵量大，一次可得数千个卵母细胞或受精卵，材料丰富。B体外受精、体外发育、胚胎操作简单。C有些鱼的卵具透明的卵膜，好操作。（有些鱼受精卵原核不易看到，需胞质注射，基因用量大（每卵注射上亿拷贝基因），尽管损伤小，但外源基因的整合率低，若能做到核注射克服此不足）。D鱼的卵膜软硬。有些鱼卵膜硬（如鲑鱼等）先用粗针扎一小孔，再注射。（受精孔也易进针，而且核靠近受精孔，提高整合率）。有的鱼卵膜软（金鱼、泥鳅），用胰酶消化可除去。斑玛鱼的卵膜薄而透明，可直接注射。 （5）转基因鱼研究的意义：实践意义，理论意义都很重要，（因鱼类在分类学上处于特殊地位）。 二、 实验技术和方法

1、外源基因的构建：初期研究中，多用哺乳类动物基因的启动子和结构基因组成载体系统。（如人生长激素基因等），启动子：SV—40、Rous肉瘤病毒的等，缺点是：表达效率低，不安全。现用全鱼基因（all-fish gene），全鱼基因是指：基因的启动子和结构基因都来自鱼类本身（可以是不同的种）。现已构建出了多种全鱼基因作为鱼类转基因的载体系统。 构建过程：特定启动子和报导基因相连。（报导基因：细菌乙酰转移酶CAT基因，萤火虫荧光素酶基因等）；蛋白的组织特异性表达往往是由启动子的，故可选取用合适的启动子和目的基因相连，指导目的基因在转基因个体发育的特定时间，特定组织内表达。这为研究发育中细胞间的相互作用提供了一条新途径。构建好的基因与质粒载体相连，扩增生化，直接注射或性内切酶切成线状，注射浓度一般在5~100ug/ml之间。 2、基因导入方法。

（1）显微注射法：最常用比较有效。a亲鱼人工催产，分别收集卵子和精液，体外人工受精；b受精后3~5分钟，去卵膜，移至含有Holtfreter液（0.35%NaCl,0.0005%KCl,0.01%CaCl2,0.02%NaHCO3）的平皿中；c将外源基因溶于转导溶液；d用注射玻璃微针吸取DNA溶液，在受精卵第一次卵裂前将外源基因注入动物极细胞质中；e注射后的胚胎，于室温下在Holtfreter液中发育到心跳期，再转入普通水完成胚胎发育（注意死胚在挑出，以防污染水质）（适用于卵膜转软的淡水鲤科鱼类）。 （2）电脉冲法，很好的方法。胰酶去卵膜，下外源DNA溶液一同放入一特制的电脉冲槽中，然后向这一体系施加一定的直流脉冲，外源DNA可进入已去卵膜的受精卵。外源DNA可整合到胚胎细胞基因组中，产生转基因鱼个体。优点：简单，同时处理大量受精卵。缺点：DNA导入无定向性，多次实验才能确定最佳脉冲参数。（可能机制：受精膜有天然小孔，低电压下，外源DNA通过这些小孔进入受精卵）。 （3）精子作载体的基因转移 19年首次在小鼠中成功。（成熟精子作载体）后来中科院的于建康用此法将外源抗冻蛋白（antifreeze protein,AFP）基因转入金鱼。 方法：将精子以一定的浓度稀释后，与待注射的线状DNA在4℃共同孵育30分钟，再与卵子受精。这样可将外源DNA导入受精卵内。

可能的原理：鱼类卵表面有受精孔，受精时整个精子进入卵细胞（与哺乳类动物不同，不脱被膜），在孵育时进入精子或吸附在精子表面的DNA被带入卵内。

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（4）培养细胞作载体的基因转移。a核移植法：先将外源基因导入培养细胞核内，筛选出转基因阳性的培养细胞，再通过与卵细胞进行核移植培育转基因个体。b制备鱼类嵌合体：斑马鱼囊胚细胞培养，转入外源DNA，这种细胞的核移入发育到囊胚的胚胎中，得到了鱼类的转基因嵌合体。如果DNA进入生殖细胞，可得到纯合的转基因鱼子代。

（5）利用卵母细胞获得转基因鱼：选取收集生发泡清晰可见的卵母细胞（第五期卵），将外源基因注入生发泡，在体外条件下培养到成熟，再与成熟精子受精。 3、外源基因在受体内整合，表达的检测分析

报导基因：CAT：细菌的氯霉素乙酰转移酶基因与ES细胞一章细胞基本相同。 三、 转基因鱼实验模型的建立

高等脊椎动物，转基因技术的建立是以小鼠为实验模型。最近建立了转基因鱼实验模型。为了建立鱼类实验模型必须研究的几个方面的内容：（1）DNA导入的最佳方式，DNA导入后的命运，DNA的整合表达和通过生殖细胞进行传递的规律。作为实验模型鱼（model fish）应具备的特点：a卵膜薄而透明；b易于进行显微注射；c成熟周期短；d终年产卵等。

日本青鱼和班马鱼现作为理想的实验模型的原因：（1）小型鲤科鱼类易于室内饲养；（2）性成熟期短，仅2~4月；（3）产卵周期短，如斑马鱼只有两天；（4）产卵具有严格的光周期性，可以人工控制产卵时间，而且都已培育出纯系，便于在确定的遗传背景下评估转基因的作用。 四、 转基因鱼的生物控制

1、进行生物控制的理由：因转基因的作用具有长期性和连续性的特点，不仅在当代起作用，还可遗传给下一代，而且在不同品系间杂交时使转基因在整个种内蔓延。因此，在对转基因的安全性和潜在的表型效应作出全面的估计之前，要对转基因群体进行生物控制。 2、两大类生物控制：（1）物理性的控制措施，在设施方法上管理，防止转基因个体流失。（2）生物性的控制措施：主要使转基因品系无生殖能力或不育，以防止转基因的蔓延。 3、生物性控制的主要方法：（1）通过基因组操作培育三倍体鱼。不能形成有功能的生殖细胞，雄、雌鱼均不育。（2）激素诱导不育。鲑鱼幼鱼饲养在含低量的雄性激素的水中时，雌性基因型个体转变为生理雄性。若在喂食时哺以大量的雄性激素，可使基因型为雄性及雌性的个体均不育。（3）外科手术法：通过切除性腺组织使转基因鱼不育（工作量大，切除有时不完全，可以诱导再生，小鱼不好做）。（4）放射线处理法，γ射线处理杀伤生殖细胞，延缓性成熟（剂量不易掌握）。（5）自身免疫法：脊椎动物可以通过诱导对自身参加生殖过程的主要蛋白的免疫反应，使生殖能力丧失。（6）化学诱导法：用药物干扰激素的正常作用，如用抗性激素（雄、雌）的药物处理转基因鱼，使之不能性成熟，丧失生殖能力。（7）行为控制法，如对生殖回游的利用等。（“记住”养殖场的特殊标志，如鲑鱼）。（8）单性群体法：用遗传手段或化学物质处理造成单性群体，控制转基因品系的繁殖。（9）转基因法诱导不育：基因的组织特异性表达主要是受其上游的启动子序列的，特定的启动子与细胞毒性基因相连，使毒素基因仅在特定的细胞内表达，使这些细胞被破坏，如破坏生殖细胞可以造成不育。

渔业上现常用三倍体鱼，雄性激素处理来实现养殖鱼群的不育。

第四章 其它转基因动物（哺乳类动物）

一、 基因转移的方法（主要6种）

1、嵌合体小鼠：8细胞期的小鼠胚胎，在体外重新组合，然后移入母体内产生的小鼠为嵌合体小鼠（allophenic mice）；此小鼠携带有两套截然不同但存在的遗传信息。不能用于研究单个基因在发育中的作用。

2、DNA介导的基因转移（DNA-mediated gene transfer,DNAGT）：细胞+病毒DNA短暂接触后，病毒携带的基因转到细胞中（MH3T3+疱疹病毒DNA）

3、畸胎瘤嵌合体：基因先被转入畸胎瘤植入小鼠的囊胚腔中，可以形成嵌合体小鼠（产生有功能生殖细胞的概率很低）

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4、逆转录病毒基因转移法

以逆转录病毒为载体进行转基因：单一拷贝的DNA可整合到转染细胞的染色体位点上。已证明，病毒转染的小鼠胚胎可以发育成携带病毒基因的小鼠，并按孟德尔规律遗传给子代。

小鼠胚胎在着床前的阶段都可以浸泡在浓的病毒原液中，或者可与产生病毒的单层细胞培养在一起。逆转录病毒能感染许多体细胞，但对生殖细胞的感染频率很低。

此法制作转基因鸡可行（不能用显策注射法导入外源基因进入卵原核中），此法优点：简便易地；缺点：（1）不能插入太长的外源DNA；否则影响逆转录病毒的功能；（2）病毒整合到宿主基因组的过程，必须要有病毒长末端重复序列（LTR）的协助。

目前此法仍是十分有用的研究方法。

5、胚胎干细胞法：外源DNA导入ES细胞—转入胚胎—发育。

6、显微注射法：原核期受精卵（图）—植入雌鼠子宫—注射外源基因的整合率因基因不同而变化较大，最低3%，最高为%。通常显微注射的基因在受精卵第一次前整合到染色体组上。有70%的小鼠在所有细胞中都有外源基因的整合，另外30%的小鼠整合发生在一次或多次复制之后，外源基因只在一部分细胞中出现，形成嵌合体。

注意：微注射DNA的整合最终导致宿主DNA中的染色体序列的丢失、重排、插入突变；（由于整合的随机性造成），常出现死胚，畸型胚胎，生长不良等现象。今后的努力方向是定点整合。

另外的方法：（1）磷酸钙沉淀法：哺乳动物培养细胞体外转移外源基因最常用的方法。机理：DNA与磷酸钙形成沉淀物，通过细胞的胞饮作用进入细胞质，然后进入细胞核，DNA整合到染色体上，实现转移。（2）电脉冲法。（3）DEAE—葡聚糖介导法。（4）细胞融合。（5）染色体介导法：将M期染色全与磷酸钙形成共沉淀物，然后再加到受体细胞上，实现基因转移。（6）精子载体法（鸡、羊、兔中已成功） 二、 外源基因的表达

影响真核生物发育过程中基因表达的3种主要因子：（1）存于基因内部或环绕于基因周围，顺式元件（cis-acting element）；（2）反向因子（trans-acting factors）~在打开的染色体区域或与基因起作用且刺激转录；（3）整合位点：是基因在宿主基因组中的定位。 三、 转基因小鼠的特殊用途

1、用于免疫学研究的转基因小鼠 2、用于肿瘤学研究的转基因小鼠

3、转基因小鼠作为人类疾病的动物模型 4、转基因小鼠作为基因治疗的模型 5、转基因小鼠在发育遗传学上的应用

四、转基因大动物的研究：猪、兔、羊、奶牛等，生产生长激素、人血清白蛋白、人乳铁蛋白；α-1抗胰蛋白酶（治疗肺气肿）转基因动物在制药业中的应用社会意义和经济效益很大。

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