核酸提取纯化常见问题解答

核酸提取纯化 常见问题解答

1.AccuPrep®凝胶回收试剂盒常见问题 2.AccuPrep®基因组DNA提取试剂盒常见问题 3.AccuPrep® GMO提取试剂盒常见问题 4.AccuPrep® PCR纯化试剂盒常见问题 5.AccuPrep®质粒提取试剂盒常见问题 6.AccuPrep®粪便DNA提取试剂盒常见问题 7.AccuPrep®病毒RNA提取试剂盒常见问题

8.琼脂糖凝胶回收和PCR纯化常见问题

9.质粒DNA提取操作常见问题 AccuPrep®凝胶回收试剂

盒 ↑TOP

Q1. 产量低

A1. 1）凝胶不完全溶化会导致DNA产量的降低。离液盐不足不仅会导致凝胶溶化不完全，DNA被包裹不

能释放到溶液中，而且还降低柱子对DNA的亲和力，最终导致DNA产量降低。

2）加入等量的无水乙醇到W缓冲液中了吗? 过浓的W缓冲液会将DNA洗脱，从而导致产量的降低。

3）错误的洗脱缓冲液会降低产量. 洗脱缓冲也不能包含过多的盐. 缓冲液的 pH 应调至7.0-8.5。

4）错误的结合条件例如pH过高会导致产量的降低GB缓冲液含有pH指示剂，当颜色为黄色时表示pH

在正常范围内。如果颜色为红色或橘黄色，表示pH已经超出了正常的范围。这时应该加入几滴醋

酸钠溶液去调整pH值到正常范围内。

5）放入了过多的琼脂糖凝胶块。如果放入了超过400mg的琼脂糖凝胶块可能会降低DNA结合柱的吸

附力，从而导致DNA产量的降低。

Q2．琼脂糖凝胶样品悬浮在溶液中

A2. 琼脂糖凝胶样品悬浮在溶液中，这可能是因为样品中含有WB缓冲液。WB缓冲液中的乙醇会导致悬浮，这种情况下离心样品三次。如果悬浮的状况依然存在，那么打开盖子空气中放置10分钟挥发乙醇，再离心一次。

Q3．提纯后的后续酶反应效率降低

A3. 1)样品中高浓度的盐抑制了酶的活性。这种情况下，加入W缓冲液到结合柱后放置结合柱5分钟，然后再离心。2)样品中含有残留的WB缓冲液，残留的乙醇会抑制后续的酶反应，结合柱必须要完全晾干。如果问题仍然存在, 第二次离心后让结合柱晾干10分钟。3）一起被洗脱的玻璃纤维影响了酶的活性，再离心1分钟，转移上清液到一个新的离心管 中。

AccuPrep® 基因组DNA提取试剂

盒 ↑TOP

Q1. DNA产量或纯度低

A1. 1）缓冲液或其他试剂暴露在不合适的条件下，导致了效率降低。

确保试剂到货后存放于室温(15-25℃)，试剂使用后瓶盖要拧紧，保持其pH值及稳定性，避免污

染。冻干试剂溶解后应分装并于–20℃保存。

2）在洗涤缓冲液1和2中没有加入无水乙醇。

加入乙醇后，充分混匀洗涤缓冲液W1和W2，并且作标记，表明乙醇己加入。

3）试剂和样本没有充分混匀。

每次样本管中加入试剂后都需要及时混匀。

4）您可能没有选用适合的试剂来洗脱DNA。

洗脱DNA需要碱性条件，使用试剂盒中提供的洗脱缓冲液进行洗脱。

5）裂解可能不完全。

确保裂解液从混浊变的澄清，表明蛋白质已经降解。根据组织类型不同需要的裂解时间会有差

异。裂解通常需要1-3小时， 为保证其效率，可以使用振荡水浴的方法（如实验操作中所述）。

样品中加入蛋白酶Ｋ后要立即混匀。裂解液加入结合柱前将样品与异丙醇充分混匀。

6）从组织中提取的产量低。

在进行消化与裂解步骤之前确保组织破碎为小块（或粉末状），以下两步增加了

与蛋白酶Ｋ一起

孵育的时间：A 将组织与蛋白酶Ｋ孵育过夜。 B. 将组织与蛋白酶Ｋ孵育3 ~ 4小时，然后加入新

鲜的蛋白酶Ｋ30 µl再孵育1 ~ 2小时。

7）产物在260nm处的吸光值(A260)太高。

结合柱中的玻璃纤维可能与核酸一同被洗脱下来。这些纤维可以将光散射，造成了较高的吸光值

读数。在最后的洗脱阶段，太多的离心也可能导致将结合柱中的玻璃纤维洗脱下来，除去玻璃纤

维的方法如下面所述。

Q2.提取的DNA不能够被酶切或酶切完全

A2. 结合柱中的玻璃纤维可能同核酸一起被洗脱下来。这些纤维会抑制酶切反应。最终洗脱步骤完成后，以最大速度离心１分钟，可以在管底看到玻璃纤维，把上清液转移到一个新管中，不吸出原来管中的玻璃纤维即可。

Q3．组织样本中的DNA降解

A3. 获得的组织样本应立即-20°C 冷冻保存，直至开始裂解步骤。使用研钵和研棒在

液氮作用下将组织研磨成粉末，在没有裂解的组织中可能有核酸酶活性。

Q4．血液样本的提取最终洗脱步骤仍有颜色

A4. 结合柱可能洗涤不充分，应洗涤结合柱直至流出液体成无色，将200 µl洗脱液与200 µl GC缓冲液混合，再加入100 µl 异丙醇，重复纯化步骤 。

Q5．在某些缓冲液中有白色沉淀(TL 或GC缓冲液)

A5. 经过在低温下的长期存放，组织裂解缓冲液或结合缓冲液中可能出现白色沉淀。在60°C孵育可使沉淀溶解。沉淀对结果无影响，在较高温度下溶解沉淀后不会提高产量及纯化的核酸质量。

AccuPrep® GMO提取试剂

盒 ↑TOP

Q1. DNA 产量或纯度低

A1. 1) 试剂盒保存条件不适当。到货后存于15-25℃。

2) 缓冲液或其他试剂暴露在不合适的条件下，导致了效率降低。

确保试剂到货后存放于室温(15~25°C)，试剂使用后瓶盖要拧紧，保持其pH值及稳定性，避免污

染。冻干试剂溶解后应分装并于2 ~ 8℃或-15 ~ -25℃保存。

3) 使用前在洗涤缓冲液中没有加入无水乙醇。加入乙醇后充分混匀并存于15 ~ 25℃。做标记标明是

否已加入。

4) 试剂和样本没有充分混匀。每次样本管中加入试剂后都需要及时混匀。

Q2. DNA洗脱回收率低

A2.可能使用了不适当的洗脱缓冲液。不要用水洗脱，请用试剂盒中提供的洗脱缓冲液洗脱。

Q3. 提取的DNA不能够被酶切或酶切完全

A3. 结合柱中的玻璃纤维可能同核酸一起被洗脱下来。这些纤维会抑制酶切反应。最终洗脱步骤完成后，以最大速度离心１分钟，可以在管低看到玻璃纤维，把上清液转移到一个新管中，不吸出原来管中的玻璃纤维即可。

Q4. 产物在260nm处的吸光值(A260)太高

A4. 结合柱中的玻璃纤维可能与核酸一同被洗脱下来。这些纤维可以将光散射，造成了较高的吸光值读数。除去玻璃纤维的方法如上所述。

Q5. DNA产量低

A5. 1) 蛋白酶K溶解不完全。按照下面步骤完全溶解蛋白酶K:

1.吸取2.5ml双蒸水加入蛋白酶K冻干粉小瓶中。

2.盖上瓶盖，颠倒几次使蛋白酶K完全溶解。

3.分装并做标记，存于–15 to -25°C。

注意: 按照此种方法溶解的蛋白酶K至少可稳定存放12个月。

2) 裂解不完全。加入蛋白酶K后立即将样本混匀。裂解液加入结合柱前要与异丙醇彻底混匀。

Q6. 从组织中提取产量低

A6. 蛋白酶K消化不完全。确保消化与裂解步骤之前组织破碎成小块。有两种方法增加孵育时间：.组织与蛋白酶K一起孵育过夜, 或孵育蛋白酶K 3~4小时，再加入30 μL蛋白酶K 温育1~2小时。

Q7. 组织样本中的DNA降解

A7. 在没有裂解的组织中存在核酸酶活性。组织在进行裂解步骤前应该冻存于-20 °C，样品进行匀质化时使用小块组织(20-40 mg)。

Q8. 血液样本的提取最终洗脱步骤仍有颜色

A8. 结合柱可能洗涤不充分，应洗涤结合柱直至流出液体成无色，将200 µl洗脱液与400 µl 结合缓冲液混合，再加入100 µl 异丙醇，重复纯化步骤 。

Q9. 在PL缓冲液和B缓冲液中有白色沉淀

A9. 经过在低温下的长期存放，PL缓冲液或B缓冲液中可能出现白色沉淀。在70°C孵育可使沉淀溶解。沉淀对结果无影响，在较高温度下溶解沉淀后不会提高产量及纯化的核酸质量。

AccuPrep® PCR纯化试剂

盒 ↑TOP

Q1. 低产量

A1. 1. 您是否将PCR产物与结合缓冲液充分混匀？不足浓度的离液盐不会增加DNA与结合柱的吸附。

2. 您是否在洗涤缓冲液中加入了足量的无水乙醇？浓缩的洗涤缓冲液可以洗去结合的DNA。

3. 使用不正确的洗脱缓冲液可能会降低产量。洗脱缓冲液不能含有太多盐离子，最适pH值应为7.0-

8.5。

Q2. 样品在琼脂糖凝胶中上样后漂浮

A2. 样品可能包含残留的洗涤缓冲液因而导致漂浮。必须离心确保柱子中没有挂壁的液滴。如果这种情况持续发生，第二次离心后可以将柱子在空气中晾干10 min，然后再进行洗脱。

Q3. 后续酶切反应不正常

A3. 1. 样品中高浓度的盐离子会抑制酶切反应，这种情况下，应在结合柱中加入洗涤缓冲液后静置5 min,

再离心。

2. 样品中包含残留的洗涤缓冲液，残留的乙醇影响酶切反应的进行，结合柱必须完全干燥。如果这种

情况持续发生，第二次离心后可以将柱子在空气中晾干10 min，然后再进行洗脱。

3. 玻璃纤维与核酸一同被洗脱下来干扰了酶的活性，离心1min将上清转移至一个新管即可。

AccuPrep® 质粒提取试剂

盒 ↑TOP

Q1. 质粒产量低

A1. 1. 您是否收集了足够数量的细胞?产量依赖于宿主菌型，细胞过量也可能会使产量降低.请参阅附录。

2. 您是否使用了重悬缓冲液充分悬浮细胞？不完全重悬浮细胞会降低裂解效率。

3. 中和缓冲液中是否有盐沉淀？涡旋振荡重新使沉淀溶解。离液盐浓度不适当会导致产量的降低。如

果沉淀不易溶解，可于60℃加热。

4. 加入RNase A 干粉后试剂是否保存超过了６个月？低浓度的RNase A可以导致质粒产量低，６个

月后，再加入一些RNase A，至多达到100 µg/µl。

Q2. 染色体DNA污染(电泳分析时出现了杂带)

A2. 在第三步，样品不能够涡旋和剧烈振荡，裂解时间不能超过５分钟，这些都可能切断染色体DNA，轻柔处理裂解液。

Q3. 进行琼脂糖凝胶电泳上样时样品漂浮

A3. 样品含有残留乙醇导致了漂浮，离心后必须使柱子完全干燥，确保结合柱内无挂壁液滴。

Q4. 序列分析时有许多背景条带

A4. 您是否检查了宿主E. coli菌株的内切酶活性？HB101, JM系列及正常野生型宿主有很高内切酶活性，通过降解质粒干扰测序反应。对于这些类型，需要第七步变性过程。

Q5. 样品中含有RNA

A5. 1. 收集细胞的量过多。我们推荐使用适当的量，根据附录中显示的宿主细胞光密度。

2. RNase活性减弱。RNase A干粉加入到重悬缓冲液中保存超过6个月以上，RNase活性会减弱，

需再加入一些RNase A干粉，多至100 µg/µl。

Q6. 玻璃纤维的洗脱

A6. 玻璃纤维与核酸一同被洗脱下来干扰了酶的活性，以最大速度离心1min，上清转移至一个新管即可 。

AccuPrep® 粪便DNA提取试剂

盒 ↑TOP

Q1. 提取后DNA纯度过低

A1. 1. 试剂盒的储存条件不正确。 ® 试剂盒到货后需要15-25℃保存.

2. 缓冲液和其他试剂暴露在影响其活性的环境下。 ® 所有缓冲液均应保存于15-25°C。试剂瓶使

用后均要盖好盖子以保护其pH值和稳定性，避免污染。任何冻干的试剂被稀释使用后都要储存在

2-8℃或 -15- -25℃ 。

3. 洗涤缓冲液（W Buffer）中没加乙醇。 ® W Buffer使用之前要先加入适量的无水乙醇。加入后混

合好，并储存于15 - 25℃. 做好标记以便区分是否已加入乙醇。

4. 样品和试剂没有完全混合。 ® 每一步加完试剂到样品中后，都要充分混匀。

Q2. 洗脱后，DNA的回收率低

A2. 可能没有用适合的洗脱缓冲液去洗脱DNA. 洗脱液需要用碱性的缓冲液。 à 下次实验时不要用水洗脱DNA，用试剂盒中的洗脱缓冲液洗脱DNA。

Q3. 提取的DNA用性酶切不完全或完全不能进行酶切

A3. 玻璃纤维可能会同DNA一起被从柱子中洗脱，它会影响内切酶的活性，最后的洗脱步骤完成后，离心机调到最大速度离心一分钟. 玻璃纤维可能在管底被观测到。将上

清液转移到一个新的管中，注意不要带走管底的玻璃纤维。

Q4. 用分光光度计定量时A260值过高

A4. 玻璃纤维可能同DNA一起从柱子中洗脱下来，它也有吸光作用导致A260值过高 ® 除去玻璃纤维的方法同上述方法一样。

Q5. DNA产量过低

A5. a.蛋白酶K没有被完全溶解。按如下的操作步骤完全溶解蛋白酶K:

1）. 取1.25ml的双蒸水到盛有蛋白酶K的管中。

2）. 盖上管盖，颠倒几次直到蛋白酶K完全溶解。

3）. 分装后储存于 –15 to -25℃.*注意: 用这种方法储存得当，蛋白酶K的活性可以保存1年以上。

b 可能裂解不完全。 ®加入蛋白酶K后立即将样品混合好。在样品加入结合柱之前，一直搅拌将异丙

醇和裂解产物混合好。

Q6. SL缓冲液或ST缓冲液中出现白色沉淀

A6. 在长时间的低温下保存SL缓冲液或ST缓冲液，其中会出现白色沉淀。 ® 任何

在SL缓冲液或ST缓冲液中出现的白色沉淀，都必须在70°C下加热溶解. 沉淀并不影响缓冲液的功能, 高温溶解沉淀也不会增加提取核酸的产量。

AccuPrep® 病毒RNA提取试剂

盒 ↑TOP

Q1. 提取后的RNA纯度低

A1. 1. 试剂盒的保存温度不正确，试剂盒需要15-25℃保存。

2. 加入Poly(A)到VB缓冲液后混合完全。

3. 洗涤缓冲液（W Buffer）中没加乙醇，W Buffer使用之前要先加入适量的无水乙醇。混合好后储存

于15 ~ 25℃。做好标记以便区分。

4. 样品和试剂没有混合完全，每一步试剂加到样品中后，都要充分混合。

Q2. 洗脱后，RNA的回收率低

A2. 可能没有用适合的洗脱缓冲液去洗脱RNA. 洗脱液需要用碱性的PH缓冲液. à 下次实验时不要用水洗脱，请使用用试剂盒中的洗脱缓冲液进行洗脱。

琼

脂

糖

凝

胶

回

收

和

PCR

纯

化

常

见

问

题 ↑TOP

Q1. 产量低

A1. 1) 溶解不完全使产量降低。不足浓度的离液盐影响DNA与硅基质表面的结合。

2) 您是否在W缓冲液中加入了足量的乙醇？浓缩的W缓冲液可能会洗去结合的DNA。

3) 使用不适当的洗脱缓冲液可能降低产量。洗脱缓冲液不应包含太多的盐。缓冲液pH值应调至7.0-

8.5。

4) 不适当的结合条件如高pH值会降低产量。SB缓冲液包含pH指示剂，颜色为黄色。超出pH范围后

颜色变为红色或橙色。这种情况下可加入醋酸钠调整pH值至适当范围。

5) 切割的胶块太大，多于400mg的凝胶即会导致DNA结合效率的降低。

Q2. 后续酶切反应受到影响

A2. 1) 样品的高盐浓度抑制酶切。这种情况下可使用W缓冲液洗脱两次。

2) 样品包含残留的W缓冲液。残留的乙醇抑制酶切反应。

3) 不完全去除硅基质会降低后续酶切反应的活性。因为基质有可能结合蛋白质。

质

粒

DNA

提

取

操

作

常

见

问

题 ↑TOP

Q1. 质粒产量低

A1. 1) 您是否收集了足量细胞？产量依赖于宿主类型。过量的细胞也会导致产量降低。

2) 您是否使用溶液I完全重悬了细胞？不完全重悬会降低裂解的效率。

3) 在溶液II, III或SB缓冲液中是否有盐沉淀？涡旋或震荡使沉淀溶解。离液盐浓度不适当会降低产量,

如果沉淀不易溶解，可加热到50℃。

Q2. 染色体DNA污染 (琼脂糖凝胶电泳时出现了非预期条带)

A2. 在第4步，样品不应涡旋或剧烈震荡，裂解时间不应超过5分钟，否则均可能导

致染色体DNA断裂污染样品。处理裂解液时操作要轻缓。

Q3. 琼脂糖凝胶电泳上样时样品漂浮

A3. 样品可能包含残留的W缓冲液。样品中残留乙醇会导致漂浮。必须使样品完全干燥但不能过干。

Q4. 序列分析时出现太多背景条带

A4. 您是否检查了宿主E. coli的内切酶活性？HB101，JM系列及正常野生型宿主都有很高的核酸内切酶活性，通过降解质粒DNA干扰了测序反应。这时应该增加第11步的孵育时间。

Q5. 样品包含RNA

A5. 收集的细胞太多。我们推荐使用的细菌培养物体积要适当。