核酸检验基本技术

第六章 核酸检验基本技术

第一节 分子生物学基本知识

一、DNA和RNA

DNA是脱氧核糖核酸的英文缩写。DNA以核苷酸排列顺序形式储存遗传信息。

DNA分子由4种核苷酸组成，由碱基互补维持DNA双螺旋结构。

在动植物、细菌和真菌中都含有DNA，但在病毒中不一定含DNA。

DNA为长丝状分子相互纠缠，其溶液十分黏稠。

它对紫外线有最强的吸收，通常用260nm波长测DNA溶液浓度，它在近中性环境中带负电荷，DNA变性后OD值会升高。

因DNA不溶于乙醇，常用二倍量乙醇沉淀DNA。

在变性温度时，它的黏性突然降低。淬火是为了保持DNA单恋状态。

DNA变性后溶液慢慢冷却，DNA会自动回复双螺旋结构。

RNA是核糖核酸的英文缩写，在大多数生物类型中，RNA起遗传信息传递作用并指导合成蛋白质，但在一部分病毒中，RNA也是遗传信息的保存者。

RNA分子中除了含有核糖而不是脱氧核糖外，凡DNA中出现胸腺嘧啶的地方都代之以尿嘧啶。

二、DNA的复制和修复

细胞分裂一次，染色体DNA就合成一次。

DNA分子拆开成两条链，每一条单链按照碱基配对的原则合成另一条新的单链，成为半保留复制。

在合成DNA时限制性核酸内切酶不是合成DNA的必要条件。

DNA多聚酶只能结合在一长段DNA单链的一小段局部双链结构上，才能顺利开始DNA合成。

在DNA合成中单核苷酸分子必须顺序以共价链连接在已形成核酸链3?末端的羟基上。

在合成大声错误时，DNA多聚酶会切除错误核苷酸，在那个位置上重新加一个正确核苷酸。

在人工合成DNA时，至加一种或两种三磷酸单核苷酸，那么和成就会停止在缺失的核苷酸位置上。

在大肠菌DNA损伤修复时填补缺口最重要的酶是DNA聚合酶Ⅰ，而复制最主要的DNA聚合酶是DNA聚合酶Ⅱ。

该酶的核心聚合酶中，具有3?-5?外切酶活性。DNA修复过程中尿嘧啶糖基酶系统不包括SⅠ核酸酶。

逆转录酶的RNAaseH活性是一般DNA聚合酶所不具备的。

三、转录

在生物体内，DNA知道的RNA合成过程称为转录。

它是按照储存在DNA尚的遗传信息合成。

合成RNA时DNA双链也要解旋，解旋部位称启动子。

大肠菌的RNA聚合酶有5个亚基，其σ亚基有启动子作用。

四、翻译

再合成各种不同RNA中，tRNA具有搬运氨基酸功能。

构成核糖体骨架的是rRNA，而mRNA直接决定蛋白质的结构。

4种核苷酸排列组成遗传信息，很撑蛋白质时转换成20种氨基酸的排列顺序，遗传信息的这种转换称为翻译。

3个核苷酸排列顺序代表一种氨基酸密码，表示蛋白质合成开始的密码有一种，DNA3个终止密码子分别是UAA、UAG、UGA。

在细菌里，依靠rRNA和mRNA之间一段互补序列能发现蛋白质合成开始的位置。

元和生物核糖体是由16SrRNA、23SrRNA和5SrRNA组成，在振和生物核糖体的五种主要的组蛋白中，H1在进化中最不保守。

在核糖体上，有2个位置上暴露出mRNA分子相邻的2个密码子，当蛋白质合成进行到没有携带任何一种氨基酸的tRNA与其对应，这说明合成蛋白质结束，并已开始同一种蛋白质分子的合成。

合成蛋白质后，决定其空间结构的是蛋白质的氨基酸排列顺序确定后，就能自动折叠卷曲呈一定的空间形状。

第二节 分子生物学基本技术

一、质粒DNA的分离、纯化和鉴定

质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1~200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。

质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表示所携带的遗传信息。

质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如致病的能力和对抗生素的抗性等。

把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中进行繁殖和表达的工具叫载体。

细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。

质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。

与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必须序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。

一个理想的克隆抗体大致应有下列一些特性：

①分子量小、多拷贝、松弛控制型；

②具有多种常用的限制性内切酶的单切点；

③能插入较大的外源DNA片段；

④具有容易操作的检测表型。

常用的质粒载体大小一般在1~10kb，如PBR322、PUC序列、PGEM序列和pBluescript（pBS）等。

从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：

①培养细菌使质粒扩增；②收集和裂解细胞；③分离和纯化质粒DNA。

含有治理细菌应在能够保存质粒的条件下培养，生长到足够数量时，加入抑制蛋白质合成的抗生素，在细菌停止繁殖后质粒仍然还在复制，这样就可以提高质粒的收获量。

采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和Triton X-100可使细胞膜裂解。

经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断呈不同大小的线性片段。

当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而质粒的共价闭合环状DNA的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片产然在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在也液相中。

离心除去断裂的染色体DNA和细胞的碎片，使用酚处理等方法除去包括核酸酶等的蛋白质，在使用乙醇沉积等方法将质粒DNA从上清液中沉积下来，就可以获得高浓度的质粒溶液。

细胞在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其他形式的质粒DNA。如果质粒DNA

两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子，称开环DNA；

如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA。

二、记忆组DNA的提取

基因组DNA的提取是研究各种生物，包括病原微生物遗传特征的基本条件。

利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。

加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及地步，从而达到提取的目的。

在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组的DNA时应量在温和条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。

一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上，否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。

而进行RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段（20kb以下），并可以保证含PCR所扩增的片段（一般2kb以下）。

不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同；不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。

组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等又较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑出去多糖和酚类物质。

三、RNA的提取和cDNA合成

在病原微生物中，许多种类病毒的基因组由RNA组成，真核生物的组织或细胞中也存在着大量的RNA，提取这些RNA，是了解生物和微生物中的生命过程，认识疾病的基本条件。

细胞内总RNA制备方法很多，如异硫氰酸胍热本分发等。许多公司有现成的总RNA提取试剂盒，可快速有效地提取到高质量的总RNA。

分离的总RNA可利用mRNA3?末端含有多聚（A）+的特点，当RNA流经oligo（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo（dT）纤维素上，然后逐渐降低盐浓度洗脱，在地盐溶液或蒸馏水中，mRNA被洗下。

经过两次oligo（dT）纤维素柱，可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存1年以上。

RNA还可以通过酶促反应逆转录合成cDNA来加以研究，将双链cDNA和载体连接，然后转化扩增，即可获得cDNA文库，构建的cDNA文库可用于振和生物基因的结构、表达和调控的分析；

比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一序列问题。

cDNA合成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成cDNA第一链，聚合酶合成cDNA第二链，加入合成接头以及将双链DNA克隆到适当载体（噬菌体或质粒）。

四、DNA酶切及凝胶电泳

限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。

它可分为三类，其中Ⅱ类限制性内切酶在分子克隆和微生物鉴定中得到广泛应用。

绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4个或6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列。

与的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段，有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称黏性末端。

利用限制性内切酶的这些性质，可以对各种DNA结构进行限制性内切酶分析。

DNA经限制性内切酶切割后，产生许多一定长度的片段，使用电泳的方法分离不同长度的片段，一种DNA结构就能形成一种特征性的图形，称为DNA的电泳图谱，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量为~1μg。

限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同，各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度（大多数为37℃）。

对质粒DNA酶切反应而言，限制性内切酶用量可按标准体系1μgDA加1单位酶，下滑1~2小时。

但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2~3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。

在酶切图谱制作过程中，琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。

琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。

琼脂糖凝胶分离DNA片段大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。

琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。

聚丙烯酰胺分离小片段DNA（5~500bp）效果较好，其分辨力极高，甚至相差1bp的DNA片段就能分开。

聚丙烯酰胺凝胶通常采用垂直装置进行电泳。

电泳完毕后，使用溴化一啶染色，DNA片段聚集的地方，在紫外线下可以显示发橙色荧光的条带。

如果电泳中使用了已知大小的DNA片段作为分子量标志，可以测量并计算出每一DNA片段的长度。

结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析将这些片段排列起来，便可作出DNA的限制性内切酶酶切图谱。

DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。

需要注意DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性，只有严格控制条件才能保证酶切图谱的准确性。

第三节 探针和杂交技术

DNA的双链结构解旋形成单链称为DNA的变性，变性后的DNA单链，仍可通过碱基配对重新次年工程双链结构，称为复性。

在复性过程中，不同来源的互补核苷酸系列形成稳定的杂合双链DNA的过程称为分子杂交。

带有可以识别标记的已知核苷酸系列称为探针，由于杂交过程的高度特异性，可以根据所使用的探针测知对应系列的存在，这种方法称为杂交技术。

核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性，因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因系列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。

因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用，而且在临床诊断上的应用也日趋增多。

核算探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针。

分子生物研究中，DNA探针最为常用，通常使用已知的DNA片段，将带有显色酶促反应标记的单核苷酸合成其中，也可在PCR反应的过程中加入标记的单核苷酸，扩增的产物即可用作探针。

利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的点突变。

常用的寡核苷酸探针主要有两种：

单一已知系列的寡核苷酸探针和许多简并性寡核苷酸探针组成的寡核苷酸探针库。

单一已知系列的寡核苷酸探针能与它们的目的系列准确配对，可以准确地设计杂交条件，以保证探针只与目的系列杂交而不与系列相近的非完全配对系列杂交，对于一些未知系列的目的片段则无效。

RNA探针一般都是单链，它具有单链DNA探针的优点，又具有许多DNA单链探针所没有的优点，主要是：RNA:DNA杂交体比DNA:DNA杂交体有更高的稳定性，所以在杂交反应中RNA探针比相同比活性的DNA探针所产生信号要强。

RNA:RNA杂交体用RNA酶A酶切比S1酶切DNA:RNA杂交体容易控制，所以用RNA探针进行RNA结构分析比用DNA探针效果好。

分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用带有标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。

根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类：

（1）Southern杂交：

DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维膜或尼龙膜针上，然后与探针杂交。

被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。

（2）Northern杂交：

RNA片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后用探针杂交。

被检对象为RNA，探针为DNA或RNA。

（3）其他：

根据杂交所用的方法，另外还有斑点杂交、狭槽杂交和原位杂交等。

有3种固相支持体可用于杂交：

硝酸纤维素滤膜、尼龙膜和Whatman 541滤纸。Whatman 541滤纸有很高的湿强度，最早用于筛选细菌菌落，与硝酸纤维滤膜相比有一些有限：它更便宜，杂交中更耐用，干燥过程中不易变形和碎裂等。

然而若变形过程不小心，杂交信号的强度会明显弱于用硝酸纤维滤膜时所得到的信号强度。

因此，常规的细菌筛选和各种杂交时多选用硝酸纤维滤膜作为固相支持体。

第四节 扩增技术

PCR（聚合酶链反应）是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。

它包括三个基本步骤：

①变形：双链DNA片段在94℃下解链；

②退火：两种寡核苷酸引物在适当温度（50℃左右）下与模板上的目的系列通过氢键配对；

③延伸：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。

由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环模板，所以经25~35轮循环就可使DNA扩增达106倍。

PCR反应中的成分主要有：

（1）引物：

PCR反应产物的特异性由一堆上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。

（2）4种三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）：

理论上4种dNTP各20μmol/L，足以在100μl反应中合成μg的DNA。

当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。

4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。

（3）Mg2+：

Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，通常反应体系中Mg2+浓度范围为~2mmol/L。

（4）模板：

PCR反应必须以DNA为模板进行扩增，模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子（线状分子比环状分子的扩增能效果稍好），就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。

（5）Taq DNA聚合酶：

Taq DNA聚合酶耐高温，其活性半衰期℃为130分钟，95℃为40分钟，97℃为5分钟。

（6）反应缓冲液：

反应缓冲液一般含10~50mmol/L Tris·Cl，20℃下~，50mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+。

利用扩增技术可以获得任何数量的已知基因或DNA片段，也可以进一步通过系列测定来逐段查明生物基因组的结构，在分子水平上的基因组多态性检测技术中，也有一些扩增技术为基础。

例如随机扩增的多态性DNA（RAPD）分析和扩增片段长度多态性（AFLP）分析。

前者利用一系列（通常数百个）不停的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链（通常为10聚体）为引物，对所研究基因组DNA进行PCR扩增；

后者则在限制酶切割的基础上，利用DNA片段两端的黏性末端连接人工合成的“接头”，再根据接头序列进行扩增。

扩增的产物电泳分离后形成图形，可以作为整个基因组的特征标志，也可以将扩增的片段测序后，对基因组的结构进行细致的分析。

第五节 高通量检测技术

生物基因组是一个机器巨大的分子，目前，已经可以使用精确的测定方法，查明其中每一部分的特征。

然而，这种测定的数量及其庞大，迫切需要发展在一次测定中，获得成百上千反应的结果。

这样的技术，称为高通量检测技术。目前，生物芯片技术是发展最快，也是应用最为广泛的高通量技术。

生物芯片技术是20试剂90年代生命科学领域中迅速发展起来的一项新技术，其本质是固定在玻片等载体上的微型生物化学分析系统，芯片上每平方厘米可密集排列成千上万个生物分子，能快速准确地检测细胞、蛋白质、DNA及其他生物组分，并获得样品的有关信息，其效率是传统方法的成百上千倍。

根据芯片上的固定的探针不同，生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片，另外根据原理还有元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片。

基因芯片也称为基因微阵列技术，指采用原位合成或显微打印手段，将数以万计的靶基因或寡核苷酸片段固化于支持物表面上，产生探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过监测杂交信号来实现对生物样品进行快速、并行、高效检测或医学诊断。

基因微阵列技术主要包括四个基本技术环节：芯片微阵列制备、样品的准备和标记、生物分子反应和信号的检测机数据分析处理。

目前微阵列技术在应用方面集中在以下几个方面：

①基因表达谱；

②比较基因组学；

③微生物检测；

④单核酸多态性分析；

⑤测序；

⑥其他。

目前生产的90%的基因芯片用于基因表达谱分析、病毒基因分型和SNP的研究。

与之相对应的，%的芯片用于临床诊断。

与常规的检测手段相比较微阵列技术存在以下缺点：

①所需的设备昂贵。

②制备样品，标记过程复杂，耗费的时间过长。

③芯片用于检测缺少统一的标准化的问题，不同的技术平台判定阳性信号的标准不同。

④高度集成化样品制备、基因扩增、核算表计及检测仪器的研究和开发。

⑤不能对微生物特别是病毒进行定量分析。

虽然基因芯片技术在微生物诊断中存在一定的不足，但还存在很大的应用前景，其在微生物诊断中，具有以下优越性：

①高通量，可以同时对多种微生物进行监控。

②多条探针的分子杂交，可以有效地克服PCR易被污染的特点，从而提高了特异性。

③可以克服窗口期漏检情况的发生。

特别是将其应用于对集中微生物的多重感染的诊断上和鉴定新的病原微生物上，如在SARS病毒的鉴定中发挥了很大的作用。

可以预测在不久的将来，人们可望在一张基因芯片上检测到几乎所有病原微生物基因，在检测病原微生物的同时，还可以同步测试对药物的敏感性，实现真正意义上的病原微生物检测的技术革命。