实验六 负荷尿中核黄素的测定

实验六 负荷尿中核黄素的测定

（荧光法）

（一）目的意义

尿中核黄素排出量测定是评价人体核黄素营养状况的一种方法，包括负荷试验和核黄素肌酐比值测定。

（二）原理

含有核黄素的溶液在紫外线下发黄绿色荧光，在稀溶液中荧光强度与核黄素浓度成正比。核黄素又可被低亚硫酸钠还原而失去荧光，故测定还原前后的荧光强度可去除干扰性荧光物质的影响。

（三）仪器与试剂

1．荧光光度计

2．酸性水 取浓硫酸0.3ml，加蒸馏水至200ml。

3．核黄素标准储备液 精密称取25mg核黄素于1000ml容量瓶中，用酸性水稀释至刻度，移至棕色瓶内，冷藏备用。

4．核黄素标准应用液 吸取上液4ml，用酸性水稀释至100ml。临用时配制。

5．低亚硫酸钠（Na2S2O4）

（四）操作步骤

1．样品 取尿样lml加酸性水19ml于一具塞试管内，混匀，在激发波长420nm和发射波长530nm处测定荧光强度。记下读数（A）后，取10mg低亚硫酸钠直接加人比色杯内，摇匀，立即测定荧光强度并读数（B）。

2．内标准 取尿样1.0ml加核黄素标准应用液1.5ml，加酸性水17.5ml，混匀，在同样情况下测定荧光强度，记下读数（C），取10mg低亚硫酸钠直接加入比色杯内，摇匀，立即测定荧光强度并读数（D）。

（五）结果计算

（六）说明

1．所有操作需在暗室内进行。

2．作内标准的目的是除去尿样中可能存在的有荧光的物质。

3．使用荧光光度计是需用荧光红钠校正。

荧光红钠溶液的配制：溶解25.0mg荧光红钠（sodium fluorescein）于少量水中，

搅拌使其溶解后加水至250ml，此液为储备液。取储备液0.25ml加水稀释成250ml，为工作液。

校正步骤：现选择所需激发波长和发射波长，校正仪器零点，然后以荧光红钠工作液校正荧光计使指针在某一刻度，在测定样品的荧光强度。

4. 如遇尿样混浊，难以直接读数，可将尿液按食品中核黄素测定方法稀释后，过硅镁层析柱再进行测定。