【目的】
验证丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。
【原理】
琥珀酸在琥珀酸脱氢酶催化下脱氢生成延胡索酸,脱下的氢被受氢体接受。本实验用亚甲蓝(MB)作为受氢体,亚甲蓝接受琥珀酸脱下的氢由蓝色还原成无色的甲烯白(MBH2)。丙二酸与琥珀酸分子结构相似,能竞争性抑制琥珀酸脱氢酶。通过观察亚甲蓝颜色消退的程度,可以判断丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制程度。
COOHCH2CH2COOH琥珀酸 亚甲蓝(蓝色)COOH+MB琥珀酸脱氢酶丙二酸(-)CHCHCOOH延胡索酸+MBH2还原性亚甲蓝(无色)
【器材】
试管及试管架、滴管、剪刀、研钵或20ml匀浆器、电热恒温水浴箱。 【试剂】
1. 0.1mol/L磷酸缓冲液(PH7.4)
取0.1mol/L Na2HPO4溶液19ml和0.1mol/L NaH2PO4溶液81ml混合即可。 2. 1.5% 琥珀酸钠溶液 3. 1% 丙二酸钠溶液 4. 0.02% 亚甲蓝溶液 5.液状石蜡 【操作】
1. 取新鲜动物肌肉或肝5g左右,放入研钵,用剪刀将组织剪碎,然后加入10ml在冰箱中保存的PH7.4的磷酸缓冲液充分研磨均匀(或在匀浆器内进行匀浆,制备成20%匀浆液)。
2. 取4支试管,编号,按下表操作:
表3-11 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用
加入物(滴)
匀浆 1.5%琥珀酸钠溶
液 1%丙二酸钠溶液
蒸馏水 0.02%亚甲蓝溶液
3. 各管混匀后,各加少量液状石蜡覆盖在液体上,置37℃水浴中保温,随时观察各管颜色变化,并记录各管亚甲蓝褪色时间。
【结果及分析】
比较各管亚甲蓝褪色情况,并对实验结果进行分析。 【思考题】
1. 什么是竞争性抑制作用,与非竞争性抑制作用有何不同。
2. 为什么要用石蜡油隔绝空气来进行实验?
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