氨基酸和生物资源２０１６，３８（３）：３６～３９ Ａｍ ０ Ａｃ ｓ＆Ｂ ０ ｃ ＲＰｓ０ ｒｃｅｓ ＤＯＩ：１０．１４１８８／ｊ．ａｊｓｈ．２０１６．０３．００８ 快速检测中药材乌梢蛇ＬＡＭＰ方法的建立 孙清萍，陈素珍，盛英美 （广东省药品检验所，广东广州５１０１８Ｏ） 摘要：乌梢蛇作为一种名贵中药材，市面上伪品较多，干燥熏黑处理后的样品，更是真伪难辨。本研究致力于开发一套基 于环介导等温扩增（１ｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）为基础的快速筛查乌梢蛇的方法。本研究以乌梢蛇 １２ｓ ｒＲＮＡ基因序列为基础设计并筛选出１套ＬＡＭＰ引物。通过调整反应条件，建立了对乌梢蛇ＬＡＭＰ的检查方法。结果显 示，６２。Ｃ下连续反应１５ ｍｉｎ左右出现典型的“ｓ”型荧光吸收曲线，实现了对乌梢蛇１２ｓ ｒＲＮＡ基因序列的特异扩增。根据 ＬＡＭＰ灵敏度高的特点，本研究简化了ＤＮＡ的提取方法，缩短了检测的时间。相对于常规的ＰＣＲ方法，本研究建立的以快 速ＤＮＡ提取为基础的乌梢蛇ＬＡＭＰ快速筛查方法具有简单、快速、灵敏、对设备要求低等特点，适用于对中药材乌梢蛇的快 速筛查。 关键词：乌梢蛇；环介导等温扩增；快速筛查 中圈分类号：Ｒ ９２７．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００６－８３７６（２０１６）０３－００３６—０４ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｏｏｐ—Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｚａｏｃｙｓ ｄｈｕｍｎａｄｅｓ ＳＵＮ Ｑｉｎｇｐｉｎｇ，ＣＨＥＮ Ｓｕｚｈｅｎ，ＳＨＥＮＧ Ｙｉｎｇｍｅｉ （Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，５１０１８０，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｚａｏｃｙｓ ｄｈｕｍｎａｄｅｓ ｉＳ ａ ｋｉｎｄ Ｏｆ ｖａｌｕａｂｌｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈｅｒｂａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｔｈｅｒｅ ａｒｅ ｍａｎｙ ｋｉｎｄｓ ０｛ｆａｋｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｍａｒｋｅｔ ａｎｄ ｉｔ ｉｓ ｖｅｒｙ ｈａｒｄ ｔｏ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ ｔｈｅ ｒｅａｌ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆａｋｅ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｓｎａｋｅｓ ａｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ｄｒｙｉｎｇ ａｎｄ ｆｕｍｉｇａｔｉｏｎ．Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ ｒａｐｉｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）， ｐｒｏｐｅｒ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ＬＡＭＰ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ １ ２ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｚａｏｃｙｓ ｄｈｕｍｎａｄｅｓ，ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｂｙ ａｄｊｕｓｔｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ ＬＡＭＰ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｚａｏｃｙｓ ｄｈｕｍｎａｄｅｓ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｈｅ ＬＡＭＰ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａ ｔｙｐｉｃａｌ“Ｓ”ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ＯＣ— ｅｕｒｒｅｄ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ＬＡＭＰ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｌａｓｔｅｄ ｆｏｒ １５ ｍｉｎｕｔｅｓ ａｔ ６２℃．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＬＡＭＰ，ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ｓｈｏｒｔｅｎｅｄ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＬＡＭＰ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｒａｐｉｄ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｉｓ ｓｉｍｐｌｅ， ｑｕｉｃｋ，ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ａｎｄ ｌｏｗ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ．Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｓｈｏｗｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＬＡＭＰ ｍｅｔｈｏｄ ｃａｎ ｂｅ ａｐ— ｐｌｉｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｚａｏｃｙｓ ｄｈｕｍｎａｄｅｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｚａｏｃｙｓ ｄｈｕｍｎａｄｅｓ；ＬＡＭＰ（１ｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）；ｒａｐｉｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ 于宋代《开宝本草》，名日乌蛇，《本草纲目》中又名乌 ０引 言 乌梢蛇是脊索动物门（Ｃｈｏｒｄａｔａ）爬行纲（Ｒｅｐ— ｔｉｌｉａ）游蛇科（Ｃｏｌｕｂｒｉｄａｅ）乌梢蛇（Ｚａｏｃｙｓ ｄｈｕｍ— 梢蛇，迄今已有１ ０００多年的药用历史。乌梢蛇具 有祛风湿、通经络、定惊止痉等功效，作为中药临床 功效确切口］，《中华人民共和国药典》（２０１０年版）将 ｎａｄｅｓ）的干燥体，为临床祛风通络的常用中药，始载 收稿日期：２０１５—１２—２５ 修回日期：２０１６—０３—２１ 作者简介：孙清萍（１９７７一），男，博士，现主要从事药物安全评价研究。 Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｄｓｑｐＩ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｔｏｍ 乌梢蛇作为中药材进行收载［２］。 乌梢蛇作为一种名贵中药材，市面上伪品较多， 由于干燥熏黑处理后的样品形态、颜色发生较大变 基金项目：广东省食品药品检验系统项目（ＺＡ２０１２００１３）；广东省中 医药管理局项目（２０１２２２０１） 化，同其他蛇难以区别［３］。调查表明，目前流通中的 乌梢蛇伪品主要为同为游蛇科的蕲蛇（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ 氨基酸和生物资源 ・ ３７ ・ ａｃｕｔｕｓ）、红点锦蛇（Ｅｌａｐｈｅ ｒｕｆｏｄｏｒｓａｔａ）、黑眉锦蛇 （Ｅｌａｐｈｅ ｔａｅｎｉｕｒａ）、玉斑锦蛇（Ｅｌａｐｈｅ ｍａｎｄａｒｉ— 本文首次将ＬＡＭＰ技术引入到中药材乌梢蛇 的真伪筛查中。针对乌梢蛇１２ｓ ｒＲＮＡ基因设计特 ｎＵＳ）、王锦蛇（Ｅｌａｐｈｅ ｃａｒｉｎａｔａ）和灰鼠蛇（Ｐｔｙａｓ ｋｏｒｒｏｓ）［ 。 异性引物，建立了中药材乌梢蛇的ＬＡＭＰ检测方 法。 基于ＤＮＡ多态性差异的分子标记技术能克服 传统中药材鉴别的不足，实现在分子水平对中药材 的鉴别。《中华人民共和国药典》（２０１０年版）已将 常规ＰＣＲ的方法引入了到乌梢蛇的鉴别中＿２］。但 常规的ＰＣＲ方法对实验条件要求高、步骤多、耗时 长，难以实现快速检测及在基层普及。２０００年， １材料与方法 １．１ 材料 乌梢蛇由广东省药品检验所中药室提供（已按 《中华人民共和国药典》２０１０年版的标准，鉴定合 格）；蕲蛇购于广州同仁堂药店。 １．２试剂与仪器 Ｎｏｔｏｍｉ等ｌ＿５ 首先提出了一种新的核酸扩增技术，即 环介导等温扩增（１ｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉ— ｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）。该方法利用了ＤＮＡ在６Ｏ～６５℃ 左右处于动态平衡状态，ＤＮＡ可在此温度下进行合 核酸提取液（２００ ｍｍｏｌ Ｔｒｉｓ—ＨＣ１，ｐＨ ８。０；２５０ ｍｍｏｌ ＮａＣ１；２５ ｍｍｏｌ ＥＤＴＡ）；ＤＮＡ核酸检测试剂 盒（包含Ｐ＾ＤＮＡ聚合酶、ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ及荧光染 料，广州迪奥生物科技有限公司）。 ＰＣＲ仪Ｔ１００（美国Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司）。迪奥恒温 荧光检测仪３０８Ｃ（广州迪奥生物科技有限公司）。 全部引物经ＨＰＬＣ纯化，由生工生物工程（上 海）股份有限公司提供。 １．３ 引物设计 成反应的特性。利用４条特异性引物和一种具有链 置换活性的ＤＮＡ聚合酶（Ｂｓｔ—ＤＮＡ聚合酶），使得 链置换ＤＮＡ合成不停地自我循环。该方法在等温 条件下可高效、快速、高特异性地扩增靶序列，可直 接通过副产物焦磷酸镁沉淀的浊度判断是否发生反 应，也可通过加入核酸染料ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ，通过对 激发荧光的检测来判断是否发生反应。该技术解决 以乌梢蛇１２ｓ ｒＲＮＡ（序列编号：ｇｉ ｌ９８００６２９ Ｉ ｇｂ ｌ ＡＦ２３６６７６．２ ｌ ＡＦ２３６６７６）基因序列为基础，通过 了核酸诊断上出现的诸多难题，使快速诊断成为可 能。目前，ＬＡＭＰ技术已经广泛应用于对病毒 ］、 ＢＬＡＳＴ查找分析目标基因在多个蛇类间的序列多 态性，并以此为基础设计２套引物，引物组合的序列 见表ｌ。 细菌 、真菌 、支原体 、寄生虫 。。，以及环境、食 品中的细菌＿】 等病原体的快速检测。 表１ 乌梢蛇环介导等温扩增特异引物组合 Ｔａｂ．１ Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ Ｚａｏｃｙｓ ｄｈｕｍｎａｄｅｓ 引物名称 ＺＡ０—１＃一Ｆ３ 序列（５ 一３ ） ＡＣＣＣＡＡＧＡＣＡＣＣＡＡＧＣＡＡＧ ＺＡ（）＿１＃一Ｂ３ ＺＡＣ卜１＃一ＦＩＰ ＺＡ０—１＃一ＢＩＰ ＺＡ０ ２＃一Ｆ３ ＺＡ（）＿２＃一Ｂ３ ＺＡＣ卜２＃一ＦＩＰ ＺＡ０—２＃一ＢＩＰ ＧＣＴＴＴＣＡＣＧＡＧＴＧＧＡＡＧＴＴＧＴ ＧＴＣＧＡＧＣＴＴＴＣＧＣＴＴＡＴＧＧＣＣＴＡＡＴＴＴＴＣＣＡＴＡＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＡ ＣＣＡＡＣＧＧＣＧＴＡＡＡＧＣＡＣＧＡＣＴＡＴＴＴＴＧＴＧＧＣＴＴＡＴＧＧＣＴＴＴＴＴＡＣＡＧＣ ＡＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＡＴＣＡＧＧＴＡ ＣＡＣＧＡＧＴＧＧＡＡＧＴＴＧＴＣＴＴＡＴ ＧＧＡＴＴＡＡＣＣＧＧＣＣＣＴＧＴＧＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＡＧＴＴＡＡ ＧＧＴＴＡＣＡＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＡＡＡＣＴＧＧＧＴＴＴＣＡＴＴＣＣＴＡＡＴＧＧＴ １．４ ＤＮＡ的提取 １２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ。加入１ ｍｌ ７０ 无水乙醇 反复吸打１ ｒａｉｎ后１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｒａｉｎ。弃掉 上清液晾干后加３０￣５０ Ｌ蒸馏水溶解。 常规法提取基因组ＤＮＡ参照《中华人民共和 国药典９２０１０年版中ＤＮＡ提取的方法Ｌ２］。本研究 为了实现快速筛查真伪乌梢蛇的目标，在文献口 ¨ 报道的基础上，摸索了一套能用于ＲＡＭＰ的快速提 １．５环介导等温扩增反应 反应体系为：２３ ｌ反应试剂（ＤＮＡ核酸检测试 剂盒），１ Ｌ引物混合物（内引物终浓度为１．６ ｔＬｍｏｌ ・取ＤＮＡ的方法，具体如下：将液氮碾磨后的组织材 料置于１．５ ｍＬ离心管中，加入适量核酸提取液震 荡混匀。１２ ０００ ｒ・ｍｉｎ 离心５～８ ｍｉｎ，取上清， Ｌ＿。，外引物终浓度为０，２ ｔｔＭ）及２ Ｌ模版 ＤＮＡ。混匀后置于迪奥恒温荧光检测仪３０８Ｃ中 ６２℃反应４５ ｍｉｎ。 加入等体积的异丙醇混匀，室温静置２ ｒａｉｎ后 ・ ３８ ・ 孙清萍等：快速检测中药材乌梢蛇ＬＡＭＰ方法的建立 １．６普通ＰＣＲ反应 反应体系：模板ＤＮＡ １ Ｌ，１０×ｂｕｆｆｅｒ ２．５ Ｌ，１０ Ｍ ｄＮＴＰ １ Ｌ，弓ｌ物ＺＡＯ一１＃－Ｆ３及ＺＡＯ一 引物进行普通ＰＣＲ扩增反应，结果如图３，实验组 （ｓ）在２８０ ｂｐ附近有清晰明亮的条带，片段大小与 预期条带大小（２７８ ｂｐ）相吻合。表明外引物能很好 地对乌梢蛇１２ｓ ｒＲＮＡ基因的目标片段进行扩增。 Ｍ Ｓ １＃一Ｂ３各１ Ｌ，ＤＮＡ聚合酶０．２ Ｌ，用灭菌水补 足至２５ Ｌ。ＰＣＲ程序设定如下：①预变性：９４。Ｃ ５ ｒａｉｎ；②变性：９４℃３０ Ｓ；③退火：６１℃３０ Ｓ；④延 伸：７２℃３０ Ｓ；⑤７２。Ｃ １５ ｒａｉｎ。步骤２至步骤４设 定循环数为３０个。 ２结果与分析 ２．１ 引物的筛选 以乌梢蛇的样本为乌梢蛇阳性样品，进行ＤＮＡ 提取。以ＤＮＡ核酸检测试剂盒进行ＲＡＭＰ反应， 筛选引物组合。引物组合１在第１５ ｒａｉｎ左右，呈现 出典型的“Ｓ”型扩增曲线（图１），引物组合２在４５ ａｒｉｎ内未见明显的“Ｓ”型扩增曲线（图２），表明引物 组合１可用于乌梢蛇的ＬＡＭＰ扩增反应。因此选 用引物组合１作为快速筛查乌梢蛇的引物。 ３０ ２７ ２４ ＝２１ １８ 蕈１５ ｌ２ ９ ６ ３ 反应时间／ｍｉｎ 图１ 引物组合１的环介导等温扩增结果 Ｆｉｇ．１ Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ １ ３０ ２７芒 ； ６ ３ 反应时间／ａｒｉｎ 图２引物组合２的环介导等温扩增结果 Ｆｉｇ．２ Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ ２ ２．２ ＬＡＭＰ外引物的ＰＣＲ反应与鉴定 以乌梢蛇基因组ＤＮＡ为模板，加入ＬＡＭＰ外 ２ ０００ ｌ ５００ ｌ ０００ ５００ １５Ｏ 图３环介导等温扩增外引物的ＰＣＲ反应结果 Ｆｉｇ．３ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ ｂｙ ｏｕｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２．３ 乌梢蛇ＬＡＭＰ快速筛查 ＬＡＭＰ技术的高灵敏度为简化提取ＤＮＡ步 骤，缩短检测时间提供了可能。本研究摸索出一套 适合于ＬＡＭＰ的快速ＤＮＡ提取方法。以快速提 取的乌梢蛇基因组ＤＮＡ作为样品组，以快速提取 的蕲蛇基因组ＤＮＡ作为阴性对照组，分别进行 ＬＡＭＰ扩增反应，于６２。Ｃ孵育４５ ｍｉｎ，结果如图４， 在第１５ ｒａｉｎ左右，乌梢蛇样品组的荧光强度显著上 升，最终呈现出“Ｓ”型的阳性曲线，表明设计的引物 能成功完成ＬＡＭＰ扩增反应。但蕲蛇样品组（图 ５）直到反应结束，荧光强度也没有明显变化，表明扩 增结果为阴性。该结果表明，所设计的引物能实现 乌梢蛇的特异扩增与检测。 反应时间／ｍｉｎ 图４乌梢蛇的环介导等温扩增扩增结果 Ｆｉｇ．４ Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｚａｏｃｙｓ ｄｈｕｍｎａｄｅｓ 甚 越骥 氨基酸和生物资源 ・ ３９ ・ ４ ２ ｌ ９ ８ ７ ５ ４ ２ ｌ 米 反应时间／ｒｎｉｎ 图５蕲蛇的环介导等温扩增扩增结果 Ｆｉｇ．５ Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ａｃｕｔｕｓ ３讨论 近年来，药品、食品的安全事件频发，民众的饮 食用药安全受到了越来越多的威胁。这对保、食、 化、药的监管与检验提出了新的要求。“快筛快检” 理念正是在当前复杂形势的背景下提出来的［１ 。 “快筛快检”力求快速、简便地对可能的威胁进行筛 查，在条件简陋的基层检验机构能开展检验，甚至能 在监管现场进行快速检测，是对“假冒伪劣”的巨大 威慑。 由于中药材在制备过程中常会经受烘干、熏蒸、 切片等处理，传统的基于色、形、味的鉴别方法的局 限性较大。本研究首次将ＬＡＭＰ技术引入到伪品 中药材乌梢蛇的筛查之中，实现了在分子水平对中 药材的筛查鉴别，克服了传统的基于色、形、味的鉴 别方法的局限性。而且ＬＡＭＰ技术灵敏度高的特 点，使其所需的ＤＮＡ量非常少，有研究结果表明６ 个拷贝的ＤＮＡ就可以完成ＬＡＭＰ反应＿ｌ ，这为设 计快速的ＤＮＡ提取方法提供了空间。本研究将 ＬＡＭＰ与快速ＤＮＡ提取方法结合，实现了中药材 乌梢蛇的简便、快速的筛查。使在基层药检机构甚 至是在快检车上对中药材的快速筛查成为可能。本 研究表明，ＬＡＭＰ技术在有ＤＮＡ存留的中药材、食 品、保健食品等的快速筛查中有较广阔的应用前景。 参考文献 －Ｉ１］林豁，胡丽娜，李娜．动物药整理研究——乌梢蛇 ［Ｊ］．吉林中医药，２００９，２９（１１）：９８２—９８４． ｆ２］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典．２０１０年版一 部［Ｍ］．北京：中国医药科技出版社，２０１０：７２—７３． ［３］ 张昱．乌梢蛇鉴别要领简述［Ｊ］．中国乡村医药杂志， ２０１３，（１５）：５０—５０． １－４］黄璐琦，冯成强，唐晓晶．高特异性ＰＣＲ方法鉴别乌 梢蛇及其混淆品［Ｊ］．中国药学杂志，２００７，４２（５）： ３３３—３３６． ［５］ Ｎｏｔｏｍｉ Ｔ，Ｏｋａｙａｍａ Ｈ，Ｍａｓｕｂｕｃｈｉ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｌｏｏｐ－ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０００，２８（１２）：６３—６５． ［６］庄明亮，李江红，陈大福，等．应用环介导等温扩增 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