一、电泳技术概念
带电颗粒在电场作用下,向着与其电性相反的电极移动,称为电泳。电泳技术简介电泳法,是指带电荷的供试品(蛋白质、核苷酸等)在惰性支持介质(如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)中,于电场的作用下,向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动,使组分分离成狭窄的区带,用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。
二.电泳技术的基本原理和分类
在电场中,推动带电质点运动的力(F)等于质点所带净电荷量(Q)与电场强度(E)的乘积。F=QE质点的前移同样要受到阻力(F)的影响,对于一个球形质点,服从Stoke定律,即:F′=6πrην(式中r为质点半径,η为介质粘度,ν为质点移动速度),当质点在电场中作稳定运动时:F=F′即QE=6πrην
电泳法可分为自由电泳(无支持体)及区带电泳(有支持体)两大类。自由电泳又包括Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。区带电泳则包括滤纸电泳(常压及高压)、薄层电泳(薄膜及薄板)、凝胶电泳(琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶)等。
三.影响电泳迁移率的因素
⒈电场强度 如以滤纸作支持物,其两端浸入到电极液中,电极液与滤纸交界面的纸长为20cm,测得的电位降为200V,那么电场强度为200V/20cm=10V/cm。电场强度大,带电质点的迁移率加速,因此省时,但因产生大量热量,应配备冷却装置以维持恒温。
⒉溶液的pH值 溶液的pH决定被分离物质的解离程度和质点的带电性质及所带净电荷量。例如蛋白质分子,它是既有酸性基团(-COOH),又有碱性基团(-NH2)的两性电解质,在某一溶液中所带正负电荷相等,即分子的净电荷等于零,此时,蛋白质在电场中不再移动,溶液的这一pH值为该蛋白质的等电点(isoelctric point,pI)。若溶液pH处于等电点酸侧,即pH<pl,则蛋白质带正电荷,在电场中向负极移动。若溶液pH处于等电点碱侧,即pH>pl,则蛋白质带负电荷,向正极移动。溶液的pH离pl越远,质点所带净电荷越多,电泳迁移率越大。因此在电泳时,应根据样品性质,选择合适的pH值缓冲液。 ⒊溶液的离子强度 电泳液中的离子浓度增加时会引起质点迁移率的降低。其原因是带电质点吸引相反符合的离子聚集其周围,形成一个与运动质点符合相反的离子氛(ionic atmosphere),离子氛不仅降低质点的带电量,同时增加质点前移的阻力,甚至使其不能泳动。然而离子浓度过低,会降低缓冲液的总浓度及缓冲容量,不易维持溶液的pH值,影响质点的带电量,改变泳动速度。 ⒋电渗 在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗
(electro-osmosis)。其产生的原因是固体支持物多孔,且带有可解离的化学
基团,因此常吸附溶液中的正离子或负离子,使溶液相对带负电或正电。如以滤纸作支持物时,纸上纤维素吸附OH-带负电荷,与纸接触的水溶液因产生H3O+,带正电荷移向负极,若质点原来在电场中移向负极,结果质点的表现速度比其固有速度要快,若质点原来移向正极,表现速度比其固有速度要慢,可见应尽可能选择低电渗作用的支持物以减少电渗的影响。
四、电泳分析常用方法
(一)醋酸纤维素薄膜电泳
醋酸纤维素薄膜对蛋白质样品吸附性小,几乎能完全消除纸电泳中出现的“拖尾”现象,又因为膜的亲水性比较小,它所容纳的缓冲液也少,电泳时电流的大部分由样品传导,所以分离速度快,电泳时间短,样品用量少
(二)以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。其中聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel
electrophoresis,PAGE)普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大,对一般蛋白质不起分子筛作用,但适用于分离同工酶及其亚型,大分子核酸等应用较广
(三)等电聚焦电泳技术
一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01pH单位,因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。
(四)其他电泳技术
⒈IEF/SDS-PAGE双向电泳法 ⒉毛细管电泳 五.电泳技术的应用
电泳技术可以物质进行定性及定量分析,或者将一定的混合物分离成各个组份以及作少量电泳制备。因为它的这种独特功能,所以就成了分子生物学研究工作中不可缺少的重要分析手段,被广泛应用于基础理论研究、农业科学、医药卫生、工业生产、国防科研、法医学和商检等许多领域。
在医院临床检验中,利用电泳技术分析血清中的酶及同工酶,可以诊断肾病的综合症、心绞痛、肝硬化、肝癌、多发生骨髓瘤、恶性肿瘤、乙型肝炎、慢性肝炎等疾病;分析血色素组份,可以判定血细胞的正常与异常;;测定体液中可能存在微生物、原虫的特异性抗原成份,在抗原成份分离的基础上,寻找所需的单克隆抗体等等。
在公安、政法侦审工作中,利用电泳技术检测的结果,对确定案件性质、提供侦察线索和犯罪证据等,常常起着十分重要的作用。在工业陶瓷生产中,借助它来除去粘土中所混杂的氧化铁杂质„
因篇幅问题不能全部显示,请点此查看更多更全内容