胡黄连苷Ⅱ对大鼠肾缺血再灌注损伤后肾细胞凋亡反应的保护作用

胡黄连苷Ⅱ对大鼠肾缺血再灌注损伤后肾细胞凋亡反应的保护作用

目的 观察胡黄连苷Ⅱ对大鼠肾缺血再灌注损伤后肾细胞凋亡的保护作用。 方法 建立肾缺血再灌注损伤大鼠模型，将实验大鼠随机分为3组，即假手术组、缺血再灌注组和胡黄连苷Ⅱ组，每组10只。全自動生化分析仪检测大鼠血清肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）浓度，光镜观察病理组织变化，免疫组化检测Caspase-3表达，Real-time PCR及Western blot检测Bax、Bcl-2和PARP-1表达水平。 结果 与假手术组比较，缺血再灌注组Cr、BUN水平均明显增高；光镜病理组织可见肾小管损伤明显；免疫组化示Caspase-3表达增强；Real-time PCR及Western blot检测Bax、PARP-1表达增强，而Bcl-2表达减轻，差异有统计学意义（P < 0.05）。胡黄连苷Ⅱ组与缺血再灌注组比较，肾功能指标明显减低，肾小管上皮细胞损伤减轻，Caspase-3表达显著减弱，Bax与PARP-1的活性明显下降；Bcl-2表达显著增强，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 胡黄连苷Ⅱ在肾脏缺血再灌注损伤时能有效地保护肾功能，其作用机制可能与增加Bcl-2表达，降低Bax、PARP-1、Caspase-3等凋亡基因的表达有关。

标签： 缺血再灌注损伤；胡黄连苷Ⅱ；凋亡

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是临床上常见的危重病症，由多种病因导致[1]。AKI因其较高的死亡率而具有重要的临床意义，至今仍然有30%～70%不等[2]。肾脏缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）是导致AKI的重要因素之一，常发生在肾移植、保留肾单位手术、肾动脉狭窄、肾积水、主动脉搭桥手术、体外循环、栓塞性疾病、意外或医源性损伤中等。目前，用于减轻肾IRI的措施主要分为三类：药物干预、外科或机械性干预和基因治疗等，而寻求一种有效、廉价的措施，势必会产生较大的经济和社会效益。胡黄连根提取物含有多种萜类化合物和糖苷[3]，胡黄连苷Ⅱ是提取物的主要活性成分之一。许多研究表明，胡黄连苷Ⅱ有大量的药理作用，包括神经保护、肝脏保护、抗炎、抗凋亡、免疫调节等作用[4-5]，对心、脑和肢体IRI均有保护作用[6-9]。然而，其在肾IRI中的作用研究缺乏，因此笔者欲研究胡黄连苷Ⅱ在肾IRI中的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 模型的建立与分组

健康雄性SD大鼠30只，8～10周龄，购自武汉大学医学院实验动物中心（合格证号：42009800001176），体重为250～300 g，实验前适应性喂养1周，自由饮水、进食。采用随机数字表法将大鼠分为以下3组：①假手术组（n = 10）：腹腔注射20 g/L戊巴比妥钠（40 mg/kg），麻醉大鼠，然后游离双侧肾脏，切除右肾后缝合腹壁；②缺血再灌注组（n = 10）：手术步骤与假手术组相同，但在游离双侧肾脏及切除右肾后，用无创伤血管夹夹闭左肾动、静脉45 min进行缺血，然后开放血管夹进行再灌注24 h（既往文献研究表明再灌注24 h是研究肾脏缺血再灌注急性损伤的最佳时间点），肾脏由暗红变色鲜红色代表再灌注成功。③

胡黄连苷Ⅱ组（n = 10）：手术步骤与缺血再灌注组相同，但在缺血45 min后、再灌注之初腹腔注射（关于胡黄连苷Ⅱ对器官缺血再灌注损伤的文献报道均采用的是腹腔注射）Picroside Ⅱ（10 mg/kg），而假手术组和缺血再灌注组注射等量的1 mol/L的PBS。

1.2 试剂

胡黄连苷Ⅱ购于天津奎青医药公司，TLR4抗体购自Santa Cruz公司，NF-κB抗体购Santa Cruz公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.3 样本采集和处理

1.3.1 标本采集 分别于缺血/再灌注损伤24 h后采集大鼠下腔腹腔静脉血待测，处死各组大鼠获取肾脏组织，一部分迅速置于-80℃中保存，另一部分用固定液固定后，常规石蜡包埋。

1.3.2 血清尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）的检测 将采集的大鼠血液标本常温离心3000 r/min，离心10 min后，使用Olympus全自动生化分析仪（Au2700）测定血清Cr和BUN水平。

1.3.3 肾组织病理学检查 取大鼠肾组织，用多聚甲醛固定后，脱水，透明，浸蜡，包埋，切片，脱蜡，HE染色，后在200倍光镜下观察其病理改变。

1.3.4 免疫组化测定Caspase-3的表达情况 肾组织石蜡切片，厚4 μm，按SP法免疫组化试剂盒进行操作，加入Caspase-3（1∶100）抗体及相应二抗，DAB显色5 min后封片。细胞浆或细胞核有棕黄色表达者为阳性细胞。

1.3.5 Real-time PCR检测Bax、Bcl-2和PARP-1 常规Trizol试剂抽提总RNA，核酸蛋白分析仪测定RNA浓度后，取总RNA 1 μg，逆转录生成cDNA。Bax上游引物：5′-TGAACTGGACAACAACATGGAG-3′，下游引物：5′-AGCAAAGTAGAAAAGGGCAACC-3′；Bcl-2上游引物：5′-TTTGATTTCTCCTGGCTGTCT-3′，下游引物：5′-CTGATTTGACCATTTGCCTG-3′；PARP-1上游引物：5′-TCTCCAATCGCTTCTACACCCT-3′，下游引物：5′-TACTGCTGTCATCAGACCCACC-3′；内参β-actin上游引物：5′-TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3′，下游引物：5′-GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3′。PCR反应条件均为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，扩增35个循环，最后1次为72℃延伸7 min。结果以目的基因与β-actin的比值表示。1.3.6 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测Bax、Bcl-2和PARP-1 从-80℃冰箱中取出保存后的肾组织，采用BCA试剂盒检测蛋白浓度，取40 μg蛋白上样，用10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，转膜，50 g/L脱脂牛奶封闭2 h，后加入1∶1000稀释的Bax、Bcl-2和PARP-1抗体，4℃下摇床过夜。之后与辣根过氧化物酶结合的羊抗大鼠抗体（1∶2000稀释）结合，洗膜后ECL法显色、照相。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清Cr和BUN水平的比较

与假手术组比较，缺血再灌注组和胡黄连苷Ⅱ组的Cr和BUN明显增高，差异有统计学意义（P < 0.05）。胡黄连苷Ⅱ组的Cr和BUN水平较缺血再灌注组显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图1。

2.2 各组大鼠肾组织HE染色结果

與假手术组比较，缺血再灌注组光镜下可见肾小管上皮细胞明显变性坏死，髓质出血，管腔内有脱落坏死细胞管型。Picroside Ⅱ组光镜下可见部分肾小管细胞轻度水肿样变性，管型少见。见图2。

2.3 各组大鼠Caspase-3免疫组化染色结果

免疫组化结果显示：假手术组大鼠肾脏组织中Caspase-3很少表达，缺血再灌注损伤组强阳性表达，而Picroside Ⅱ组为阳性表达，相比缺血再灌注损伤组明显减弱。见图3（封三）。

2.4 各组大鼠Real-time PCR结果比较

与假手术组比较，缺血再灌注组和Picroside Ⅱ组Bax和PARP-1的mRNA水平显著增高，Bcl-2水平明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。Picroside Ⅱ组的Bax、PARP-1的mRNA水平与缺血再灌注组比较明显减低，Bcl-2水平显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图4。

2.5 各组大鼠肾组织Bax、Bcl-2和PARP-1表达的比较

与假手术组比较，缺血再灌注组和Picroside Ⅱ组Bax和PARP-1的蛋白表达水平显著增高，Bcl-2表达明显降低。Picroside Ⅱ组Bax、PARP-1的蛋白水平与缺血再灌注组比较明显减低，Bcl-2的表达显著升高。见图5。

3 讨论

肾IRI可以导致AKI、慢性肾衰和终末期肾病[1-2]，并且是影响移植肾存活率的主要原因之一[10-11]。近年来研究证实，肾IRI通过影响免疫机制导致急性

排斥反应（acute rejection，AR）的发生[12]。并且，随着免疫抑制剂的成熟运用，IRI作为最重要的非抗原依赖因素，可直接导致慢性排斥反应（chronic rejection，CR），移植肾失功能[13]。因此，努力寻求一种减轻肾脏IRI有效、廉价的措施，势必会产生较大的经济和社会效益。

肾脏IRI损伤的机制至今尚未完全阐明，主要学说包括氧自由基作用、白细胞作用、钙超载、活性因子作用等方面。据文献报道，移植肾脏缺血再灌注后引起的肾细胞凋亡是IRI的重要原因[14]。Bcl-2家族是关键的调节因子，既可以促进细胞成活如Bcl-2，也可以使细胞死亡如Bax[15]。Bcl-2水平的升高可以促进细胞存活并且有证据表明具有防止凋亡的效果[16]。然而，Bax启动细胞程序性死亡的关键调节子，是一种凋亡蛋白，由激活的Caspases启动。Bcl-2与Bax的比率决定细胞对凋亡刺激的敏感性[17-18]。本研究中，与假手术组比较，缺血再灌注组的Bax和PARP-1的表达水平显著增高，Bcl-2水平明显降低。胡黄连苷Ⅱ组Bax、PARP-1的表达水平与缺血再灌注组比较明显减低，Bcl-2水平显著升高。这表明，胡黄连苷Ⅱ可以有效抑制细胞的Bax /Bcl-2比率，进而抑制肾IRI导致的肾组织损伤。

研究表明，Caspase能促进和实现在哺乳动物细胞中的细胞凋亡，Caspase-3是Caspase级联反应瀑布中最关键的下游凋亡蛋白酶[19]。一些细胞外信号通过Fas受体途径激活Caspase-8，激活的Caspase-8促进Caspase活化，水解细胞特异性蛋白和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP），从而诱导细胞凋亡[20]。在本研究中，与缺血再灌注组比较，胡黄连苷Ⅱ组的肾组织损伤明显减轻，Caspase-3表达水平明显减低。胡黄连苷Ⅱ组PARP-1 mRNA及蛋白表达水平明显减低。这表明胡黄连苷Ⅱ可以有效抑制细胞的Caspase凋亡通路。

胡黄连苷Ⅱ可作为一种有效、廉价的治疗措施，在减轻缺血再灌注对肾脏组织的损伤、改善肾功能方面具有潜在的应用价值。

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