流行性出血热原代细胞多价纯化疫苗的研究

・论　吾・　Ｂ【ｌｌｌ　Ｍｅｄ　Ｒｅｓ．Ｍａｒ　２０ｏ２．Ｖｄ．３１　Ｎｏ．３　流行－眭出血热原代细胞多价　纯化疫苗的研究　中国药品生物制品检定所（１０００５０）　董关术抗长寿　朱智勇　韩亮　［编者注］董关术研究员出生于１９５２年。北京微生物学会理事，中国生物工程学会会员，国家生物制　品标准化委员会委员，卫生部自然疫源性疾病咨询委员会委员，国家新药审评专家组成员。主要研究厌氧　棒状杆苗苗苗的免疫调节作用和对肿瘤的治疗效果，建立丁动物模型和探索临床治疗机理。主要从事ＨＩＶ　的生物学和分子生物学研究．抗ＨＩＶ一１的药物筛选以及ＨＰ￣治疗中的抗Ａｚｒ作用机理及其变异毒株的研　究。　本研究的技术关键是优良生产毒种的选　育和纯化工艺的建立以及纯化疫苗检定项目　和质量标准的确定。通过反复的实验研究选　育出与我国已商业化生产和销售的三种单价　疫苗相匹配的三株毒种Ｚ３７，Ｐｓ６和８４Ｆ１ｉ。　这三株毒种毒力强，抗原性广谱，免疫原性　好。作为生产毒种与原三种单价疫苗配伍制　备的双价疫苗对７６—１１８（Ｉ型）和ＵＲ（Ⅱ　型）病毒的中和抗体效价均大于１：２０，其　他检定指标均达到出血热疫苗生产毒种要求　的标准。纯化工艺主要采用Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４ＦＦ凝　胶柱层析。此方法投资少，操作简便，纯化　性，确立生产用毒种。　采用终末稀释法挑选出高滴度毒种，适　应于相应的细胞培养，用此方法选育出与地　鼠肾原代细胞Ⅱ型单价（Ｉ舯株）疫苗配伍　用的Ｉ型毒株Ｐｓ６和８４Ｆ１ｉ和与沙鼠肾原代　细胞Ｉ型单价（Ｚ１０）疫苗配伍用的Ⅱ型毒　株Ｚ３７。已分别研制成两种地鼠肾原代细胞　双价疫苗和一种沙鼠肾原代细胞双价疫苗。　该三株病毒在适应细胞上的感染滴度达　８．０Ｌｏｇ　ＣＣＩＤ５０／ｍｌ以上，与不同型别的单抗　反应实验（ＩＦＡＴ）和与国内外十余株病毒的　交叉中和实验（ＰＲＭ）结果表明，Ｚ３７、ＩＸ３　效果好，回收率高，适合大规模生产。以该　工艺路线生产的双价纯化疫苗，经检定各项　指标全部合格。　一６和８４Ｆ１＿ｉ三株毒种均具有较好的免疫原　性和抗原广谱性，传代稳定性试验证明其毒　力和抗原性稳定，制成的双价疫苗，效力试　验对７６～１１８和ＵＲ毒株的中和抗体　（ＰＡＮＴ）均达１：２０以上。　２．生产工艺研究：（１）改变生产操作　、研究任务　１．毒种的选育：通过毒种选育制备试　验性灭活疫苗，免疫家兔制备抗血清，用分　离自我国南北各地的多株病毒进行交叉中和　试验，确定疫苗候选毒种的血清型和免疫原　车课题为国家煎点科技项目（攻关）计划　１．中吲预防医学科学院病毒学研究所　２浙江省疾病预防控制中心　３长春生物制品研究所　步骤和细胞培养维持液的配方，实现了两次　或多次收获病毒原液，使收获率比原来提高　了１倍，降低了生产成本。（２）浓缩纯化方　法的研究，以ｌ０万分子截留量的滤膜进行　超滤浓缩。病毒的回收率可达到９５％以上，　纯化工艺的研究主要是以Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４ＦＦ凝胶　维普资讯 http://www.cqvip.com

医学研究通讯２０Ｏ２年第３ｌ卷第３期　柱层析纯化。细胞培养的病毒疫苗含有大量　的细胞成分和一定量的小牛血清，出血热病　毒又是一类大小不均一的分子量范围较大的　生物大分子物质，病毒颗粒在７８～２１０ｒｉｍ之　间，因此寻找合适的层析介质，采用简便、　・论　吾・　ｌ４、２８天三针组。副反应观察除在北方点　出现２例直经＜２．５ｃｍ的注射处局部红肿外　未发现任何其他副反应。　免疫原性观察：采用间接免疫荧光试验　（ＩＦＡＴ）和ＥＬＩＳＡ方法，对两地部分接种者　免疫前后血清进行检测，结果三针组ＩＦＡＴ　抗体阳转率对Ｉ型为９５．５９％，对Ⅱ型为　９４．６ｌ％，ＥＨＳＡ抗体阳转率为ｌ００％。ＧＭＴ　１９６８。两针组ＩＦ３＿Ｔ抗体阳转率对Ｉ型病毒　７６～１ｌ８株为９２．７０％，对Ⅱ型病毒ＵＲ株为　８９．９５％，ＥＨＳＡ抗体阳转率为１（３０％，　ＧＭＴ１７３５。　条件温和的纯化方法是保证疫苗的免疫原性　不受影响，最大程度地回收抗原，去除杂蛋　白的关键。通过对不同层析介质的试验研　究，最后优选出　｝　ａｒＤｓｅ４ＦＦ凝胶柱层析纯　化方法，用此介质层析纯化的疫苗，抗原回　收率大于８０％，牛血清和杂蛋白去除率均　大于９９％。用此生产工艺和技术路线中试　的双价纯化疫苗，疫苗抗原量大于１：２５６　（ＥＬＩＳＡ或血凝试验），总蛋白含量小于　８０ｔｃ／ｍｌ，热源质检查、过敏性试验和其他　理化检定指标均符合新型疫苗的要求。疫苗　效力试验，其免疫血清中和抗体效价均大于　１：２０以上。纯化疫苗的质量与原来的细胞　中国药品生物制品检定所对以上各组分　别抽样４ｏ～５３人份血清进行空斑减少中和　试验（ＰＲ　、）测定其血清学效果，结果三　针组ＰＲＩＮＴ抗体阳转率对Ｉ型病毒７６～１１８　株为９３．３３％，ＧＭＴ１１．９９，对Ⅱ型病毒ＵＲ　株为９２．２２％，ＧＩＭＴ１０．７８。两针组ＨｉＮＴ阳　培养疫苗相比上了一个档次，整体水平有很　大提高，流行性出血热原代地鼠肾细胞多价　纯化疫苗于１９９９年６月中请发明专　利。　转率对Ｉ型病毒７６—１１８株为８７．３８％．　ＧＭＴ　１０．２３，对Ⅱ型病毒ＵＲ株为８９．２３％，　ＧＭＴ１０．２３。　以上观察结果显示：（１）双价肾综合征　出血热纯化疫苗接种后，无一例出现全身反　应，较双价疫苗具有更好的安全性。（２）纯　化疫苗免疫３针后ＩＦＡＴ抗体阳转率对两个　型均高于９０％，ＥＨＳＡ抗体阳转率达１（３０％，　３．疫苗质量控制：（１）抗原量测定：比　已商业化生产和销售的原粗制苗提高２～４　倍。达到１：２５６。（２）疫苗效力测定：按照　中国《生物制品规程》中流行性出血热疫苗　的效力试验方法测定中和抗体，中和抗体效　价大于１：２０。比原粗制苗提高ｌ倍。（３）疫　苗中杂蛋白或过敏原测定：用本研究项目中　确定的纯化方法，疫苗中的杂蛋白含量可达　到蚰微克／剂以下，达到或超过Ｋ＇ＴＩＯ对相　关人用疫苗的标准。　二、双价纯化疫苗的免疫学效果　长春生物制品研究所以Ｌ９９和ＰＳ一６毒　株生产的双价纯化疫苗分别在南　北方的广　西壮族自治区和长春市双阳区进行了临床观　察，观察对象年龄在ｌ５～５５岁，共观察　１１６８人。免疫程序为０、ｌ４天二针组和０、　中和抗体阳转率对两个型也都达到９０％以　上，证明纯化疫苗具有较好的免疫学效果。　（３）纯化疫苗免疫２针后，ＩＦＡＴ抗体阳转　率对两个型均达到８５％以上，ＥＬＩＳＡ抗体阳　转率达１（３０％，中和抗体阳转率对两个型也　都达到８５％以上。比较两针组和三针组的　免疫学效果，经统计学处理，免疫荧光抗体　和蚀斑减少中和抗体的Ｐ值分别为＞Ｏ．０１　和０．１，显示二针与三针的免疫程序都能达　到良好的免疫效果，两针组免疫程序简单，　易于操作和被受种者接受，因此纯化双价疫　苗对原粗制疫苗相比具有明显优势。　ｌ５・　维普资讯 http://www.cqvip.com

・论　着・　Ｂｌ】ｌｌ　Ｍｅｄ　Ｒｅ８．Ｍａｒ　２ＯＯ２．Ｖｏ１．３１　Ｎｏ．３　前的粗制疫苗。该方向亦符合我国政府的医　三、该成果的转化、产业化所取得的经　济和社会效益　药发展政策。而高质量双价纯化疫苗的应　用，将提高流行性出血热的预防效果，目前　临床治疗一个病人平均需４０００～５Ｃ００元人　民币，而全国每年的病例数达几万。该疫苗　的应用将有效控制该病的发生和流行．因此　势必能提高人民健康水平，促进社会经济发　展产生良好的社会效益。　本项研究的沙鼠肾细胞双价疫苗已取得　新药证书和生产文号，并获得浙江省科技进　步一等奖和国家科技进步三等奖。并已向市　场投放了２００多万人份，取得了较好的经济　效益和社会效益，但此仅为阶段性成果。　由于我国是流行性出血热发病例数最多　的国家，全世界９Ｏ％以上的病例在中国，　全国有２８个省、市、自治区广泛流行，直　接受威胁的人口达数亿之多。近几年，虽然　三种出血热单价疫苗和一种双价疫苗投放市　场，但得到预防接种疫苗的仅有Ｉ（３００多万　人口．还不到疫区人口的１０％，因此，出　血热疫苗应用前景是广阔的。流行性出血热　双价纯化疫苗与现行的疫苗相比，具有抗原　四、成果推广应用前景　本成果与目前国内应用的几种出血热疫　苗相比具有抗原量高（≥１：２５６）、抗原性广　谱（含有Ｉ、Ⅱ型病毒抗原）、杂蛋白少　（单位剂量含异源蛋白（８０ｔＪｇ），临床应用更　安全有效等优点，因此，更易被疫区人民所　接受。出血热在我国流行广泛，疫区人口达　ｌ亿以上，发病率和病死率较高。随着出血　热疫苗防病效果被实践所肯定和人民对接种　疫苗认识的提高，疫苗应用的前景是广阔　的。　（收稿：２００１一呻一２２）　量高，抗原性广谱，杂蛋白少，可减少注射　次数，简化免疫程序。可在各类型疫区使　用，副反应低，免疫效果好等优点，更容易　被疫区人民接受，双价纯化疫苗必将代替目　（上接第６页）　学会强烈地推荐对台适的　ＡＭＩ使用Ｂ一受体阻止剂。然而，在老年人　群中，Ｓ一受体阻止剂的使用明显不足。老　年ＡＭＩ后Ｂ一受体阻止剂使用过少的不良后　果为：使老年ＡＭＩ的患者失去了廉价的预　防和减少并发症和死亡率的机会；使死亡率　和再住院率增高（即使在２３４５例年龄大于　７５岁以上的患者也是如此）。　医生对老年人不使用８一受体阻止剂的　原因是：考虑到这些患者ＡＭＩ后不久即应　老年患者中，使用８一受体阻止剂，对其生　存率的影响至少与非老年相同，老年ＡＭＩ　患者应该用８一受体阻止剂来代替钙通道阻　止剂作为ＡＭＩ后的常规预防性治疗。　老年人用药失误的预防：预防老年人用　药失误直用全方位、综合考虑的方法。除了　医生对老年各脏器的生理改变有详细的了　饵，对病理及各种疾病的特点有详细的了　解，对药物的相互影响外，应考虑到老年人　对药物的副作用反应差或由于精神障碍，不　能及时表达药物的不良反应，此外，错服、　用了钙通道阻止刺；考虑患者是否会发生心　力衰竭；患者有糖尿病，错误地认为Ｂ一受　体阻止剂会影响血糖；认为Ｓ一受体阻止剂　会对生活质量有不良反应。　漏服药物在老年人中也是经常发生的事情，　在治疗老年患者时，医生、患者及患者家属　三方面密切配合才是防止老年用药失误的根　本原则。　（收藕　１９９９一¨一ｉｉ）　现认为尽管医生知道８一受体阻止剂的　正确答案，但却忽略了该药的继续应用。在　１６・