黑木耳多糖的提取及其工艺研究

编号：

四川农业大学

本科毕业论文

（2013届）

题 目：黑木耳多糖的提取工艺研究 学 院：风景园林学院 专 业：生物技术教育

学生姓名：柯鳗峻 学号：20099065 指导教师：罗傲雪 职称：副教授 完成日期：2013 年 5 月 4 日

四川农业大学教务处制

目录

1 前言······································································4 1.1 黑木耳的资源分布·························································4 1.2 黑木耳的生长习性·························································4 1.3 黑木耳中多糖的活性·······················································5 2 研究前景···································································6 2.1 材料与试剂·······························································6 2.2 仪器·····································································6 3 实验方法···································································6 3.1 标准曲线的制备···························································6 3.1.1 对照品溶液的制备·······················································6 3.1.2 标准曲线的制备·························································6 3.2 黑木耳多糖（APS）的提取工艺流程···········································7 3.3 APS的提取率的计算························································7 3.4 APS的成分分析····························································7 4 结果与分析··································································7 4.1 黑木耳多糖提取工艺条件的研究·············································7 4.1.1 标准曲线的结果及绘制···················································7

4.1.2 葡萄糖标准品测定的结果················································7

4.1.3 葡萄糖标准品测定结果曲线的绘制·········································8 4.1.4 单因素实验结果 ························································8 料液比对多糖得率的影响·····················································8 提取温度对多糖得率的影响···················································9 提取时间对多糖得率的影响···················································9 4.1.5 正交试验设计及结果·····················································10 4.2 对APS 最佳工艺条件的确定················································11 4.3 黑木耳多糖的成分分析·····················································11 5 结论······································································12 参考文献····································································12 致谢········································································13

黑木耳多糖的提取及其工艺研究

姓名：柯鳗峻

（四川农业大学风景园林学院，生物技术专业，611830） 导师：罗傲雪

（四川农业大学风景园林学院，园林植物系，611830） 摘要：目的：研究提取多糖的最佳条件。方法：本文通过酶法来提取黑木

耳多糖，从而来确定最佳提取条件。结果：利用中性蛋白酶来提取多糖，其最佳提取条件为：料水比1:40,浸提温度60℃，浸提时间2.5h，多糖的得率为4.96%。

关键词：黑木耳 多糖 提取 正交设计

Study on extraction of polysaccharide from auricularia Auricular

and its process

Name: Ke Manjun

(College of Sichuan agricultural University landscape, biological technology, 611,830)

Instructor: Luo Aoxue

(College of Sichuan agricultural University landscape, landscape plants, 611,830) Abstract: Objective: Auricularia Auricula, and to determine the best extraction condition. The result: the u to research the optimal conditions of extracting polysaccharides. Method: this se of neutral protease extracted polysaccharides and its optimal extraction Condition: water 1:40, extraction temperature 60℃, the extraction time 2.5h.

. Key words: protease of Auricularia； Auricula ； polysaccharide； extract.

1前言

1.1 黑木耳资源的分布

黑木耳多糖是黑木耳子实体中的重要活性物质，除具有一般的生化性质外，还具有调节免疫功能、抗血栓、抑菌、降血糖、抗溃疡、抗肝炎和抗突变、降血脂和促进血清蛋白生物合成等多种功效[1]

木耳生长于栎、杨、榕、槐等120多种阔叶树的腐木上，单生或群生。真菌学分类属担子菌纲，木耳目，木耳科。国内有9个种，黑龙江拥有现有的全部8个品种，云南现有7个种、河南卢氏县有一种。野生黑木耳主要分布在大小兴安岭林区、秦巴山脉、伏牛山脉等。湖北房县、随州、四川青川、云南文山、红河、保山、德宏、丽江、大理、西双版纳、曲靖等地州市和河南省卢氏县是中国木耳的生产区。

我国是世界上主要的木耳生产国，年产量占世界总产量的90%以上[2].黑木耳是著名的山珍，可食、可药、可补，中国老百姓餐桌上久食不厌，有“素中之荤”之美誉，世界上被称之为“中餐中的黑色瑰宝”。而黑木耳培植方法，在世界农艺、园艺、菌艺史上，都堪称一绝。 1.2 黑木耳的生长习性

黑木耳属于腐生性中温型真菌。菌丝在6～36℃之间均可生长，但以22～32℃最适宜；15～27℃都可分化出于实体，但以20～24℃最适宜，河南省卢氏县就是因为良好的天然环境造就了卢氏黑木耳为其地理保护产品。菌丝在含水量60%～70%的栽培料及段木中均可生长，子实体形成时要求耳木含水量达70%以上，空气相对湿度90%～95%[3]。暗中能正常生长，子实体生长期需250～1000 lx的光照强度。为好气性真菌，pH5～5.6最适宜。黑木耳栽培方法有段木栽培与塑料袋代料栽培等多种。

黑木耳，其性味甘平，是我国传统保健佳品，也是世界公认的保健品。它是我国珍贵的药用和食用胶质真菌，属于木耳系真菌类胆子菌纲。黑木耳营养丰富，食味鲜美，含义人体不可缺少的蛋白质、脂肪、碳水化合物，钙、铁、胡萝卜素、维生素B1、B2等。其具有益气强身、补气血、润肺、止血、止痛、通便等功效。可防止动脉硬化、高血压和眼底出血，增强抵抗力，延年益寿[4-5]。黑木耳多糖有抗凝血、抗血栓、增强机体免疫功能及降血脂等多种功效[6]。黑木耳多糖为黑

木耳的重要活性成分，近年来，随着人们营养保健意识的增强，对黑木耳的研究也越来越深入，结果表明，黑木耳的重要生理功能都是与其多糖组分密切相关的

［7］

。

1.3 黑木耳中多糖的活性

多糖是由多个相同或不相同的单糖基以糖苷键相连而成的聚合度超过10的高聚物。其基本结构是一种或多种单糖，由一个糖的还原性端基与另一个糖的C2、C3、C4或C6的-OH彼此脱水缩合而成的大分子化合物，结构复杂，不具有原来单糖的性质。多糖还原性小，有旋光性，分子量一般较大，不溶于有机溶剂[8],量通常在数万至数百万之间，多糖纯品实质上是一定分子量范围的均一组分。

迄今为止，人类对核酸和蛋白质的研究取得了重大进展，推动了生命科学及相关科学领域的发展，多糖将成为最后一类有待攻破的生物活性大分子。多糖的来源大致分为植物来源多糖、动物来源多糖和微生物来源多糖，即细菌多糖和真菌多糖[9]

多糖是一种具有合成高分子所没有的特殊生物活性的物质，因其化学结构中的糖基数量相对单糖和双糖为多而得名。在自然界中多糖的种类繁多，它们在动物、植物、微生物中均有存在且履行一系列不同的功能。微生物产生的多糖可以分为胞内多糖、细胞壁多糖和胞外多糖三类。根据多糖化学结构中糖基的种类，又可将其分为同聚多糖和杂聚多糖，前者为相同单糖所组成，如阿拉伯胶、淀粉等，后者为一种以上单糖所组成，如半纤维素，粘多糖[10],用真菌多糖是微生物多糖的重要组成部分。食药用真菌多糖在国际上称为“生物反应调节剂”（Biological responsemodifier, BRN），它已成为目前医药保健品开发的热点

现代研究表明，黑木耳多糖是一种较全面的保健食品和保健药品，黑木耳多糖、酸性杂多糖组分β—D—葡聚糖组分都有可能分别作为药物的有效成分而单独使用或作为辅助药物使用。例如：目前临床常用的抗溃疡药物不良反应突出，长期服用难以忍受，黑木耳多糖对溃疡病有效，且未见不良反应。它很可能是一种新的低毒抗溃疡药物。另外，其β—D—葡聚糖组分抗肿瘤活性很突出，可与放疗或抗肿瘤药物合用，对肿瘤的治疗有协同作用，并可降低副作用。酸性杂多糖的升白细胞活性很显著而且毒性低，有望将其开发为一种低毒、高效的升白细胞药物。而黑木耳细胞壁关键组分几丁质和β-葡聚糖，质地坚韧不易被人体消

化，所以黑木耳细胞壁内所含有的其他多种有效成分也很难透过细胞壁被人体所吸收[11]。 1.4 研究前景

近年来，随着糖科学和糖技术的发展，黑木耳多糖已日益被人们所重视，它将会为人类的健康和安全提供更为有利的帮助，黑木耳多糖将具有更广阔的发展前景。

多糖常用的提取方法有：热水浸提法、酸浸提法、碱浸提法、酶法等[12-15].传统黑木耳多糖提取采用水体系，需要多次浸提，操作时间长，收率低。酸浸提法和碱浸提法容易使部分多糖发生水解，破坏多糖的活性结构、减少多糖得率。本文采用酶法提取黑木耳多糖，确定了最佳条件，为建立高效、经济的多糖提取途径提供了参考。

2材料与仪器

2.1材料与试剂：黑木耳、无水乙醇、浓硫酸、葡萄糖、氢氧化钠、氢氧化钾、

苯酚、牛血清蛋白、考马斯亮蓝 ，均为分析纯。

2.2仪器：紫外分光光度计、电子天平、恒温水浴锅、旋转蒸发器、微波真空

干燥箱。

3实验方法 3.1. 标准曲线的绘制 3.1.1 对照品溶液的制备

精密称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖标准品0.0250 g，加水溶解，250 mL容量瓶定容，即得0.1 mg.mL/1的葡萄糖对照品液。 3.1.2 标准曲线的制备

精密量取上述对照品液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于具塞试管中，分别加蒸馏水水至2.0 mL，各加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，放置10 min，冷却至室温，空白对照以2.0 mL蒸馏水代替葡萄糖液，根据所测结果绘制标准曲线并求得回归方程。

3.2. 黑木耳多糖（APS）的提取工艺流程

原料处理→干燥称重→提取→过滤→离心→留上清液→蒸发浓缩至原体积的1/4→醇析→冷冻离心→粗体物→洗涤干燥→多糖粗品 3.3. APS提取率的计算

APS采用苯酚－硫酸法对其进行含量测定，然后按下式计算APS提取率： 黑木耳多糖含量（％）=（C×D×f）/W×100

上式中，C为供试液中葡萄糖浓度（mg/ml）；D为多糖的稀释因素（ml）；f为换算因子，W为供试黑木耳的重量（mg）。 3.4 APS的成分分析

APS的主要化学成分采用以下方法测定。水分：减压干燥法；灰分：国标法；还原糖：3,5-二肖基水杨酸法；总糖：样品加盐酸（1+1），在68-70℃水浴中加热15min水解后，按还原糖测定方法；蛋白质：考马斯亮蓝G-250法。

4 结果与分析

4.1 黑木耳多糖提取工艺条件的研究 4.1.1 标准曲线的结果及绘制

以标准溶液质量浓度（mg·L-1）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，见图1。试验制得标准曲线的回归方程为：y = 14.517x - 0.0114 （R² = 0.998）。 结果表明，其质量浓度与峰面积在0.01～0.05mg.L-1时呈良好的线性关系。

4.1.2 葡萄糖标准品测定的结果

表2 葡萄糖标准曲线所测得吸光度值

样品 1 2 3 4 5

浓度（mg·L-1） 吸光度 1

吸光度 2 吸光度 3 平均值

0.01 0.02 0.03 0.04 0.05

0.133 0.256 0.422 0.560 0.725

0.135 0.261 0.435 0.563 0.726

0.131 0.266 0.430 0.5 0.730

0.133 0.261 0.429 0.559 0.727

4.1.3 葡萄糖标准品测定结果曲线的绘制

图1 葡萄糖的标准曲线

4.1.4 单因素实验结果

①料液比对多糖得率的影响

图2 料液比对APS提取率的影响

从图2 中可以看出，随着料液比的增大，提取率先提高后降低，料液比的最佳条件为1:40左右为宜。

②提取温度对多糖得率的影响

图3 提取温度对APS提取率的影响

从图3中可以看出，当提取温度低于60℃时APS提取效率

呈上升趋势，在60℃时，APS提取率达到最大值。再升高温度，APS提取率开始下降。这是由于在升温和机械波的作用下，APS结构遭到破坏，造成透绿下降。因此，最佳提取温度应在60℃附近。

③提取时间对多糖得率的影响

图4 提取时间对APS提取得率的影响

从图4可以看出，提取时间在前0.5～2.5h内，APS提取率随时间延长而

升高；在2.5h提取率达到最大值。这表明APS的提取过程与时间密切相关，提取时间较短时，产物溶解不充分；时间过长，大分子多糖在热及搅拌的作用下发生断裂，影响APS的得率。所以，APS的最佳提取时间应在2.5h左右。

4.1.5 正交试验设计及结果

此次试验设计3个因素、3个水平：料液比（A）、提取温度（B）、提取时间（C），这三个

因素对APS的提取有一定的影响。以黑木耳为对象，采用上述提取方法，得出最佳的提取工艺条件。

表2 因素水平

水平 1 2 3

正交试验设计组合和APS得率见表2.

表2 对APS提取的正交试验结果

实验号 料液比（A） 提取时间（B） 1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 1 1 2 2 2 3 3 3

1 2 3 1 2 3 1 2 3

温度(C) 1 2 3 2 3 1 3 1 2

多糖的率（%）

2.51 2.13 3.37 3.79 1.41 3.09 1.28 2.73 2.16

料液比 50 60 70

提取时间（min）

120 150 180

温度（℃） 1∶20 1∶40 1∶60

4.2 对APS 最佳工艺条件的确定

此次试验以黑木耳为对象，在不同的温度、提取时间、物料比、下对黑木耳中多糖类化

合物的进行提取研究，分析结果如下表3。

表3 方差分析表

源 校正模型 截距 A B C 误差 总计 校正的总计

Ⅰ型平方和 2.842 56.100 0.884 0.924 1.033 0.000 61.851 5.751

a

df 6 1 2 2 2 0 9 8

均方 0.474 56.100 0.442 0.462 0.516

F - - - - -

Sig - - - - -

从上表可以直观地看出，各因素水平对APS的提取率影响的强弱顺序依次是

C>B>A,所以温度最具有显著性差异。根据实验结果，得到多糖的最佳提取条件为：温度为60℃，提取时间为2.5小时，料液比为1：40，然后采用最佳提取条件再对黑木耳中多糖进行提取。得到多糖的提取率为4.96%。

4.3 黑木耳多糖的成分分析

制备所得黑木耳多糖主要成分的含量见表4.

表4 黑木耳多糖主要成分的含量（%）

APS

灰分 7.94

水分 12.15

还原糖 12.07

总糖 16.56

多糖 47.56

粗蛋白 9.12

5 结论

5.1 从多糖的提取实验条件极其结果可以看出，温度对多糖的提取率影响较大，温度上升提取率增高，但考虑到温度过高可能会影响多糖生物活性，故选浸提温度为60℃。从而得到黑木耳多糖的最佳提取工艺条件为：浸提温度为60℃,40倍加水量，浸提2.5小时。

5.2 所制备的多糖以大分子的多糖为主，还含有一定量的蛋白质、还原糖及灰分，为粗多糖。

参考文献

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[2]刘大纹，李铁柱，孙永海.黑木耳多糖提取工艺的优化[J].农业机械学报，2007，38(5):100-102.

[3]SONE Y, KAKUTA M, MISAKI A, et al. Isolation and characterization of polysaccharides of “Kikurgac’fruit body of Auricularia Auricula-juade [J]. Agric Boil Chem,1978,42(2):417-422. [4] KAKUTA M, MISAKI A, et al. Study on international and antitum effect of polysaccharides antitum or action of periodate [J]. Carbobyd Res,1981,92:115-129 . [5]杨新美,中国食用菌栽培学（第一版）[M].北京：农业出版社，1988. [6]陈和生,孙振亚,黑木耳多糖的研究进展[J].时珍国医国药,2003,14（5）：300、301. [7]周鹏,谢明勇.多糖的生物活性[J].食品研究与开发,2001,22（2）：6-8. [8]林数钱,中国药用菌生产与产品开发[J].北京:中国农业出版社,1995,211-212. [9]曾凯宏,明建,曾凯芳.真菌多糖的结构与功能,食品科技[J],2001（4）：65-66. [10]王谦,大型食用真菌的多糖类物质,广西轻工业[J],1995（4）：16-19.

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[15]王金凤.木耳多糖提取工艺研究[J].食品科学,2004,25（6）:143~146.

致谢

经过一个暑假的忙碌和工作，本次毕业设计已经接近尾声，作为一个本科生的毕

业设计，由于经验的匮乏难免有许多考虑不周全的地方，如果没有导师的督促指导，以及一起工作的同学们的支持，一个人完成是很困难的。

在这里，首先要感谢我的导师罗傲雪老师。罗老师平日里工作繁多，但在我做毕业设计期间，从教我们理论课到查阅资料，开题报告的确定和修改，中期检查，后期详细设计，每个实验步骤等整个过程中都不厌其烦地给予了我悉心的指导。除了罗老师的专业水平外，他的治学严谨和对科学研究的精神也是我永远学习的榜样，并将积极影响我今后的学习和工作。

其次要感谢和我一起做毕业设计的全体同学，让我在假期过的精彩而充实。感谢苦心教导我们的班主任老师，感谢大学四年所有的老师，教给我的人生道理，教给我的专业知识才能让我在今后的工作学习中受益颇丰。感谢所有的同学们，正是有了你们的支持和鼓励，此次毕业设计才会顺利完成。

最后感谢四川农业大学四年来对我的大力栽培。在这里请接受我诚挚的谢意！