第１１期总第２０９期 ２０１１年１１月 农业科技与装备 Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｎｏ．１１ Ｔｏｒａｌ Ｎｏ．２０９ ＮＯＶ．２０１１ 猪源益生乳酸杆菌的分离选育 袁书林 ，一，：孔庆新 ，金 锋１ ７郭小华 （１．江苏食品职业技术学院，江苏淮安２２３００３；２．淮安淮大科技发展有限公司，江苏淮安２２３００５） 摘要：为提高仔猪抵抗胃肠道菌群失衡的能力，采用：分离选育的方法，从仔猪胃部分离出７０株乳酸杆菌、肠道分离出３４５株乳酸 杆菌。对分离出的菌株进行耐酸、耐胆盐、耐高铜、耐胃蛋白酶选育，并进行大肠杆菌抑菌性试验。综合各项分离选育指标。最终分 离选育出Ｉ一６９和Ｉ－１５２菌株，作为优良饲料添加剂研发的开发菌株。 关键词：ｆｆ猪；乳酸杆菌；益生菌；分离 中图分类号：￥８５２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７４—１ １６１（２０１ １）ｌ １－００２７－０３ 现代集约化养猪的饲养条件不利于肠道正常菌 ３３０４７２全自动菌落快速计数仪、ＣＫＸ３１奥林巴斯倒 群的建立，外界环境条件变化时容易导致仔猪胃肠道 置显微镜。 、 微生物菌群失衡，降低病原菌抵抗力，从而致使仔猪 １．３试验方法 断奶时发生腹泻。从断奶到肥育前期，仔猪断奶腹泻 １．３．１乳酸杆菌的分离鉴定 剖杀仔猪，无菌取胃、肠道 造成的损失约占全部损失的７５％。益生素是以活微 （十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠）粘膜，用无菌生 生物为主，菌株可在胃肠道特定部位粘附、定植和生 理盐水洗掉粘膜上的食糜；将粘膜浸入装有１５ ｍＬ 长，通过改善胃肠道的微生态平衡，对动物生长和健 ＨＥＰＥＳ缓冲液的烧杯中，用镊子来回摇动粘膜５ 康起到有益作用的制剂。益生素主要通过改善胃肠道 ｍｉｎ；用无菌注射器吸取０．２ ｍＬ上清液．注入Ｈｕｎｇａｔｅ 的微生物菌群平衡来提高动物的健康水平，进而提高 滚管培养基，３７℃培养７２ ｈ后，于４ ｏＣ贮藏．备用。乳 动物抵抗病原菌的能力和促进动物生长。 酸杆菌初步鉴定按《常见细菌系统鉴定手册》进行。 本试验通过对猪源益生乳酸杆菌的分离选育，研 １．３．２乳酸杆菌的耐酸性选育将胃乳杆菌和肠乳杆菌 发一种具有高度抗逆性，能耐受胃酸、胆盐和高铜，且 ２４ ｈ培养物按５￣（ｖ／ｖ）的接种量接种于ｐＨ ３．０的 产乳酸水平高、抑制大肠杆菌能力强的益生乳酸杆菌 ＭＲＳ培养基，置３７℃恒温摇床中培养８ ｈ后。取０．１ 制剂．旨在为绿色饲料添加剂的开发研制开辟新途 ｍＬ菌悬液进行菌落计数，计算存活率。同时以ｐＨ 径。 ６．０的ＭＲＳ培养基为对照。存活率计算公式为：Ｓ＝ｎｓ／ １材料与方法 ｎｏ。式中：ｎｏ为处理前活菌数，ＣＦＵ／ｍＬ；ｎ８为ｐＨ ２．５ １．１材料与试剂 的ＭＲＳ培养基培养８ ｈ后活菌数，ＣＦＵ／ｍＬ。 健康仔猪６头，平均体重８．９±１．１ ｋｇ。大肠杆菌 １．３．３耐胆盐的选育在ＭＲＳ液体培养基中分别添加 Ｏ１３９、Ｋ８８、Ｆ４１由江苏食品职业技术学院实验室保 ０．１％、０．２％、０．３％（Ｖ／Ｖ）的牛胆盐。取筛选出的耐酸 存。 肠乳杆菌２４ ｈ培养物，按５％（ｖ／ｖ）的接种量接种于 革兰氏染色液、牛胆盐、乳酸、醋酸、盐酸、胃蛋白 ＭＲＳ液体培养基，并于３７ 恒温摇床中培养８ ｈ后， 酶（Ｓｉｇｍａ）、无水硫酸铜、生理盐水、ＭＲＳ培养基、ＰＹＧ 取０．１ ｍＬ菌悬液进行菌落计数。 琼脂平板。 １．３．４耐高铜的选育取经２４ ｈ培养的耐酸胃乳杆菌 １．２仪器与设备 和耐酸、胆盐的肠乳杆菌培养物，按５％（ｖ／ｖ）的接种 ＰＨＳ一３Ｃ酸度计、ＨＳ一２１１Ｃ恒温摇床、ＪＬＪ一 量接种于厌氧ＭＲＳ液体培养基（含铜２５０ ｍｇ／ｋｇ）， 培养７２ ｈ，观察其耐受情况。 收稿日期：２０１１－０２—１２ １．３．５胃蛋白酶耐受性试验将经２４ ｈ培养的耐高铜乳 基金项目：淮安市科技支撑计划（农业）项目（ＳＮ０８７４）；江苏 酸杆菌培养物按５％（ｖ／ｖ）的接种量，接种于ｐＨ ３．０ 省科技型企业创新资金（ＢＣ２０１０１４２） 且添加了５ ｍｇ／ｍＬ胃蛋白酶（３ｏｏｏ ＮＦＵ／ｍｇ）的液体 作者简介：袁书林（１９７７一），男，副教授，博士，从事动物营养 ＭＲＳ培养基，于３７ ｃｃ恒温摇床中培养８ ｈ。同时，以 方面的研究。 ｐＨ ６．０且不添加胃蛋白酶的液体ＭＲＳ培养基为对 农业科技与装备 ２０１１年１１月 照。取Ｏ １ ｍＬ菌悬液进行菌落计数，计算存活率。 １．３．６抑菌性试验将大肠杆菌０１３９、Ｋ８８、Ｆ４１分别 均匀涂布于ＰＹＧ琼脂平板上，用直径６ ｍｍ的无菌 打孔器打孔并封底。将经２４ ｈ培养的耐胃蛋白酶乳 酸杆菌培养物在５ ０００ ｒ／ｍｉｎ下离心３ ｍｉｎ，取上清 液７０ Ｌ注入孔中，置３７ ｃＣ培养２８ ｈ，测量抑菌圈 直径。同时，以空白培养液为对照。 ２绩累与分析 ２．１ 乳酸拇菌的分离和初步鉴定 ２．２乳酸杆菌耐酸性选育结果 经检测，有１３株胃乳酸杆菌和８７株肠乳酸杆菌 的存活率在２０％～６０％之间。这与Ｃｏｎｗａｙ等报道的结 果接近。胃乳酸杆菌必须能在低ｐＨ条件下生长，才 能在胃中生长繁殖，而肠乳酸杆菌只要以较高的存活 率耐过胃酸性环境。保证有足够的活菌数到达胃以下 的肠段即可。王传彬等的研究表明，动物源乳酸杆菌 对ｐＨ ２．５肉汤处理很敏感。而在ｐＨ ３．０肉汤中的存 活率达７０％以上。本试验分离得到的乳酸杆菌耐酸 从胃部分离出的菌落中，经鉴定有７０株具有典 能力比较强。 型的乳酸杆菌特征（命名为Ｓ—ｌ—Ｓ一７Ｏ）；从肠道分离 ２．３乳酸杆菌耐胆盐选育结果 出的菌落中，经鉴定有３４５株具有典型的乳酸杆菌特 在８７株耐酸肠乳酸杆菌中，共有ｌ４株肠乳杆菌 征（命名为Ｉ一１—Ｉ一３４５）。和从食糜中分离乳酸杆菌相 生长出菌落，这说明只有１６．０９％的耐酸肠乳杆菌能 比，从粘膜上分离的效果更好，因为食糜中的乳酸杆 够耐受体积浓度为０．１％～０．３％的胆盐。表明胆盐是肠 菌可能是由食物带进消化道的，也可能是不适应某一 乳酸杆菌在动物胃肠道内遇到的比胃酸更不利的因 粘膜部位的生长而从粘膜上脱落下来的．而从粘膜上 素。１４株肠乳杆菌在不同胆盐浓度下的存活率见表 分离到的乳酸杆菌本质上能在胃肠道粘膜上粘附定 ｌ。 植 ’Ｃｈｏｕ和Ｗｅｉｍｅｒ的研究发现。用胆盐选择性驯化 表１ １４株肠乳杆菌在不同胆盐浓度下的存活率 Ｔａｂｌｅ １ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｏｆ１４ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅｓ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｅｔｉｃｕｍ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ￣ｈｏｌａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ／％ 对提高乳酸杆菌的胆盐耐受力是有效的。经过几代胆 白酶的耐受力相对较差。存活率不到２０％。 盐驯化后，乳酸杆菌的耐胆盐能力大大高于亲代。乳 ２．６抑菌性试验 酸杆菌容易对胆盐产生耐受性。且具有一定的遗传 在１２个菌株中，共有６株乳杆菌２８ ｈ的代谢产 性，因此选育耐胆盐的菌种对生产具有重要意义。 物对３株致病性大肠杆菌均能产生明显的抑菌圈 ２．４乳酸杆菌耐高铜选育结果 （见表３），其抑菌环直径在ｌ １．０～１８．０ ｍｍ之间，其中 如果肉汤变浑浊，则说明乳酸杆菌能够在高铜环 Ｉ一６９和Ｉ—ｌ５抑菌能力较强。 境中生长。本试验中，共有６株胃乳酸杆菌（Ｓ一２、ｓ一 通过耐消化道环境的筛选。结合存活率和活菌 ８、Ｓ一１９、Ｓ一２３、Ｓ一４７、Ｓ－６０）和６株肠乳酸杆菌（Ｉ—ｌ４、 数，筛选得到２株（Ｉ一６９和Ｉ一１５）对大肠杆菌具有明 Ｉ—ｌ５、Ｉ一６５、Ｉ一６９、Ｉ一７６、Ｉ一９５）可以在含２５０ ｍｇ／ｋｇ铜 显抑制作用的乳酸菌。刘文华等的研究显示，乳酸菌 的ＭＲＳ肉汤中生长。 对大肠杆菌形成的抑菌圈直径为１６ ｍｍ。张素辉等的 ２．５胃蛋白酶耐受性 试验表明。从仔猪粪便分离到的乳酸菌对大肠杆菌有 胃蛋白酶耐受性试验结果见表２。 较明显的抑制作用。温建新等对附着在鸡盲肠上的乳 由表２可见．与对照组相比，１２个菌株的生长都 酸菌进行分离，抑菌试验表明，乳酸菌对禽致病性大 受到胃蛋白酶的抑制。处理８ ｈ后的活菌数均有所减 肠杆菌表现出一定的拈抗作用。一般认为乳酸菌抗菌 少。Ｉ一６９和Ｉ一７６耐受性较强，存活率可以达到 作用主要是通过产生有机酸及细菌素等物质实现。 ７６．５４％和７１．２８％：Ｉ—ｌ４和Ｉ一９５的存活率也在５０％ ３结论 以上。Ｓ一２、Ｓ一８和ｓ一２３的生长受到明显抑制，对胃蛋 从仔猪胃部分离出７０株乳酸杆菌、肠道分离出 ２０１１年第１１期 袁书林等：猪源益生乳酸杆菌的分离选育 ２９ 抑菌圈直径／ｍｍ Ｓ一１９ Ｉ－１４ Ｉ一１５ Ｉ－６９ Ｉ－７６ Ｉ一９５ ３４５株乳酸杆菌。经耐酸、耐胆盐、耐高铜和耐胃蛋白 抑菌环直径在１ １．０—１８．０ ｍｍ之间。其中Ｉ一６９和Ｉ一１５ 酶选育，筛选出Ｉ一１４、Ｉ一１５、Ｉ一６９、Ｉ一７６、Ｉ一９５、ｓ一１９共 抑菌能力较强。综合各项分离选育指标。确定Ｉ一６９和 ６株优良菌株。这６株乳杆菌２８ ｈ的代谢产物对大 ｌ一１５作为优良饲料添加剂研发的开发菌株。 肠杆菌（０１３９、Ｋ８８和Ｆ４１）均能产生明显的抑菌圈， 参考文献 ［１］东秀珠，蔡妙英．常见细菌系统鉴定手册［Ｍ］．北京：科学出版社，２００１． ［２］ＣＯＮＷＡＹ，Ｐ．Ｌ．，Ｓ．Ｌ．ＧＯＲＢＡＣＨ，Ｂ．Ｒ．ＧＯＬＤＩＮ．Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｓｔｏｍａｃｈ ａｎｄ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｔｏ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ，１９８７（７０）：１－１２． ［３］王传彬，王永坤，朱国强，等．动物源乳杆菌筛选及生物特性参数测定［Ｊ］．江苏农学院学报，１９９７，１８（１）：１—５． ［４］ＣＨＯＵ，Ｌ．，Ｂ．ＷＥＩＭＥＲ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｉｄ ａｎｄ ｂｉｌｅ－ｔｏｌｅｒａｎｔ ｉｓｏｌａｔｅ ｆｒｏｍ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｌｕｓ［Ｊ］ Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ，１９９９（８２）：２３－３１． ［５］刘文华，任慧英，邹玲，等．一株优良乳酸菌的分离鉴定与特性研究［Ｊ］．中国畜牧兽，２００８，３５（２）：１５２—１５５． ［６］张素辉，曹国文，徐登峰，等．仔猪粪便中乳酸菌的：分离、鉴定及其抑菌特性的研究［Ｊ］．饲料工业，２００７，２８（１４）：３１—３３． ［７］温建新，刘兴彩，单虎．商品鸡盲肠内容物乳酸菌的分离与鉴定［Ｊ］．中国微生态学杂志，２００８，２０（３）：２３４—２３８． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ｆｒｏｍ Ｐｉｇｌｅｔｓ ＹＵＡＮ Ｓｈｕｌｉｎ。・２ ＫＯＮＧ Ｑｉｎｇｘｉｎ ，ＪＩＮ Ｆｅｎｇ ，ＧＵＯ Ｘｉａｏｈｕａ２ （１．Ｊｉａｎｇｓｕ Ｆｏｏｄ Ｖｏｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈｕａｉ＇ａｎ Ｊｉａｎｇｓｕ ２２３００３，Ｃｈｉｎａ；２．Ｈｕａｉ＇ａｎ ＨＩＴＥＫ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌ－ ｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｈｕａｉ＇ａｎ Ｊｉａｎｇｓｕ ２２３００３，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＳＳｅｖｅｎｔｙ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｌ＇￣ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｉｇｌｅｔ ｓｔｏｍａｃｈ．Ｔｈｒｅｅ ｈｕｎｄｒｅｄ ａｎｄ ｆｏｒｔｙ－ｆｉｖｅ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｉｇｌｅｔｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｎ ｔｈｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｔｈｅ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ａｃｉｄ、ｂｉｌｅ ｓａｌｔ、ｈ Ｊ ｓｈ ｃｏｐｐｅｒ ａｎｄ ｐｅｐｓｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ，ａｎｄ ａｎ－ ｔｉ－Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｗｅｒｅ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｔｏ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｗｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ Ｉ－６９ ａｎｄ １－１５ ａｓ ａ ｇｏｏｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｆｅｅｄ ａｄｄｉｔｉｖｅｓ ｒｅ－ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ｃｏｎｓｉｄｅｒｉｎｇ ｖａｒｉｏｕｓ ｓｅｐａｒａｔｅ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｉｎｄｅｘ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｐｉｇｌｅｔｓ；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ；ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
