植物脂氧合酶研究进展

第一章 植物脂氧合酶的研究进展

缩写

LOX lipoxygenase 脂氧合酶; 9-H(P)OD (10E,12Z)-9-hydro(pero)xy-10,12-octadecadienoic acid AOS allene oxide synthase 氧化丙二烯合酶; (10E,12Z)-9-(过氧)羟基-10,12-十八碳二烯酸;

AOC allene oxide cyclase 氧化丙二烯环化酶; 9-H(P)OT (10E,12Z,15Z)-9-hydro(pero)xy-10,12,15-octadecatrienoic acid HPL hydroperoxide lyase 过氧化氢裂解酶; (10E,12Z,15Z)-9-(过氧)羟基-10,12,15-十八碳三烯酸; DES divinyl ether synthase 联乙烯醚合酶; 13-H(P)OD (9Z,11E)-13-hydro(pero)xy-9,11-octadecadienoic acid POX peroxygenase 过氧酶; (9Z,11E)-13- (过氧)羟基-9,11-十八碳二烯酸;

HPLC high performance liquid chromatography 13-H(P)OT (9Z,11E,15Z)-13-hydro(pero)xy-9,11,15-octadecatrienoic acid

高效液相; (9Z,11E,15Z)-13- (过氧)羟基-9,11,15-十八碳三烯酸; CP-HPLC chiral-phase HPLC 手性-HPLC 13-HPOT(γ) (6Z,9Z,11E)-13- hydroperoxy-6,9,11- octadecatrienoic acid RP-HPLC reversed-phase HPLC 反相-HPLC (6Z,9Z,11E)-13-过氧基-6,9,11-十八碳三烯酸; SP-HPLC straight-phase HPLC 正相-HPLC 9,16-diH(P)OT

LC/MS liquid chromatography mass spectrometry (10E,12Z,14E)-9,16-dihydro(pero)xy-10,12,14-octadecatrienoic acid 液相色谱质谱联用计 (10E,12Z,14E)-9,16-二(过氧)羟基-10,12,14-十八碳三烯酸; GC/MS gas chromatography mass spectrometry 15-HPETE

气相色谱质谱联用计 (5Z,8Z,11Z,13E)-15-hydroperoxy-5,8,11,13-eicosatetraenoic acid 12-oxo-PDA 12-oxo-10,15-phytodienoic acid (5Z,8Z,11Z,13E)-15-过氧基-5,8,11,13-二十碳四烯酸; 12-氧-10,15-植二烯酸; 8,15-diHPETE

12,13(S)-EOD (5Z,9E,11Z,13E)-8,15-dihydroperoxy-5,9,11,13-eicosatetraenoic acid (9Z,13S)-12,13-epoxy-9,11-octadecadienoic acid (5Z,9E,11Z,13E)-8,15-二过氧基-5,9,11,13-二十碳四烯酸. (9Z,13S)-12,13-环氧-9,11-十八碳二烯酸; 12,13(S)-EOT (9Z,13S,15Z)-12,13-epoxy-9,11,15-octadecatrienoic acid (9Z,13S,15Z)-12,13-环氧-9,11,15-十八碳三烯酸;

一 前言

脂氧合酶(LOX；EC 1.13.11.12)是含有非血红素离子的双加氧酶，广泛存在于需氧生物中，包括植物、动物和低等水生生物（Hartmut KÜhn & Astrid Borchert，2002）。最近发现，在真菌(Bisakowski et al，1997；Su & Oliw，1998)-和细菌(Porta & Rocha-Sosa，2001)中也存在脂氧合酶。根据酶学分类，将LOX定义为亚油酸根：氧 氧化还原酶，它催化含（Z,Z）-1,4戊二烯结构单元的不饱和脂肪酸的加氧反应，产生不饱和脂肪酸的过氧化物（Alexander Grechkin，1998）。LOX启动合成的一系列环状或脂肪族化合物，统称为氧脂（oxylipins），它们在植物的生长发育过程中以及在植物对环境胁迫反应中起着重要的作用（Helena Porta & Mario Rocha-Sosa，2002），一般将此代谢过程称之谓LOX途

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乳突果组培苗中脂氧合酶基因的诱导及克隆

径或十八碳酸途径。

每个LOX蛋白分子含有一个非血红素铁原子(Fe-LOX)。对大豆（soybean）LOX-1的研究发现，只有含三价铁离子（Ⅲ）的LOX有催化活性，化合价由无活性的二价铁离子（Ⅱ）变为有活性的三价铁离子（Ⅲ）的过程是过氧化物依赖的（Alexander Grechkin，1998）。最近发现，一种小麦根的病原真菌（Gaeumannomyces graminis）分泌Mn-LOX。与Fe-LOX相比, Mn-LOX具有以下特征：糖基化的Mn-LOX结合于凝集素；具有广泛的pH值范围；对热稳定；相对于Fe2+而言，Mn2+在化学反应中更加稳定；Mn-LOX可将亚油酸和亚麻酸氧化为两种产物——11S-和13R-过氧基脂肪酸(Su & Oliw，1998)。

在植物中，亚油酸和亚麻酸是LOX最常见的底物（siedow，1991）。氧可加在亚油酸碳氢链的第九位碳原子上，也可加在第十三位碳原子上，因此将植物LOX分为9-LOX和13-LOX（Brash，1999）。后来，又提出了一种更为全面的分类方法，即根据它们的一级结构将其分为两类：І类LOX总序列相似性为～70％，其编码的酶缺少一段叶绿体运输肽。大多数的植物LOX可归为这一类。Ⅱ类LOX总序列相似性为～40％，一般认为在其N端带有一段叶绿体运输肽。Shibata等 （1994)从拟南芥、水稻、小麦、大麦、土豆、番茄和烟草中分离了此种类型LOX的cDNAs。

植物脂氧合酶是一个多基因家族,存在着同工酶，不同的发育阶段及不同的胁迫作用可诱导相应基因的表达。例如，在土豆中，LOX多基因家族编码9-和13-LOX，根据它们的序列同源性可分为不同的类型(Cornelia Göbel et al ,2002):类型І包括编码块茎和根特异性表达的9-LOX基因(Geerts et al，1994；Casey，1995；Royo et al，1996)，在受病原菌感染的叶片中也检测到了9-LOX基因的转录(Fidantsef & Bostock，1998)；类型Ⅱ和Ⅲ为伤、茉莉酮酸酯和脱落酸诱导的在叶片中特异表达的13-LOX(Royo et al，1996)；另外，有报道从红皮土豆块茎中克隆了5-LOX基因(Xiaoyan Chen et al，1998)。

近年来，由于众多研究群体的努力，我们对LOX和氧脂的作用了解的越来越多。许多植物的LOX基因已被克隆，这为研究它们之间的系统进化关系，阐明基因序列、结构以及位置特异性和活性之间的关系提供了可能。同时，在过去的二十年中，有关LOX途径的生化研究也取得了很大进展。本文将对脂氧合酶基因的

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表达调节及其参与的代谢途径作一简单概括。

二 植物脂氧合酶基因的表达

可以说，LOX基因的表达贯穿于植物生活史的整个过程。一方面，在植物生长发育的各个阶段，包括种子的萌发、块茎的形成、结节的发育、果实的成熟以及植物体的衰老，都存在着相应LOX基因的表达(Helena Porta & Mario Rocha-Sosa ，2002)；另一方面，在自然生长环境中，植物体要面临许多环境胁迫因素，如机械刺激、虫咬、缺水、病原感染、高温或低温、氧胁迫和紫外辐射等都可诱导单个或多个LOX基因的表达（Alexander Grechkin，1998）。其次，外源诱导子，如几丁质、水杨酸、茉莉酸甲酯等也可诱导LOX基因的表达，这些诱导子，多为病原体的组成成分或者是LOX代谢途径的组分。

植物具有感知特异信号的能力，对外界信号的特异识别可引发植物产生“免疫反应”。那么，这种信号是如何“传递”到植物体，又如何诱导特异LOX基因表达的呢？现在已经初步了解，细胞中确实存在一些机制，能将不同的信号传导分子有机的组织起来，使之参与不同的刺激反应。这些机制一方面将信号分子限定在特定的胞质区域以形成特定的信号网络来有效、精确的对刺激作出反应；另一方面靠各个信号在转导途径中的相互衔接，发生级联反应的信号分子之间的相互作用来特异激活下游的转录因子，进而特异基因的表达(孙大业等，2001)。

下面以病原体诱发的植物防御反应为例，来说明植物是如何识别外界信号并保持信号转导途径的特异性的。对于高等植物而言，病原包括真菌、细菌和病毒。当病原侵染宿主植物体时会分泌一些水解酶来消化植物细胞壁，这样病原菌就可以进入植物组织中，从而引发植物细胞的防御反应(Salmond，1994；Walton，1994)。这些降解细胞的酶和来源于宿主或病原菌的细胞壁成分也可诱发抗病基因的表达，抵抗病原的侵袭(Davis & Hahlbrock，1987)。病原菌诱导的特异的防御反应，可用基因对基因假说进行解释(Flor，1971)。一般认为是宿主植物的R基因（resistance gene）编码的受体与病原体对应的avr基因（avirulcent gene）直接或间接编码的配体作用的结果(孙大业等，2001)。植物识别病毒、细菌病原体和真菌病原体存在基本机制上的不同：病毒通过植物伤口侵入，并通过胞间连丝运输有毒组分；细菌通过第三种类型的分泌途径把avr产物直接运输到植物细胞内，并同胞内R基因产物作用；而真菌avr基因编码的激发子却是和宿主细胞

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表面的受体样结构相互作用，再引起胞内的信号转导，诱发防御反应(Baker,1997)。

同时，植物脂氧合酶基因的表达也受到发育信号的调节。特异的LOX基因在大麦、黄瓜和大豆种子萌发的早期阶段被诱导（Alexander Grechkin，1998）。在豆类植物的结节中，也有关于LOX蛋白和mRNA的报道。在P. Vulgaris结节中，主要在生长阶段检测到LOX的 mRNA和蛋白质，而当结节达到最大后，mRNA和蛋白水平降低。在结节的软组织及组织的未感染细胞中发现了LOX抗原，推测这种方式的积累可能同结节的发育有关（Porta et al.,1999）。在番茄中存在与果实成熟相关的三种LOX mRNA，对应于核基因编码的TomloxA，TomloxB，TomloxC。在果实成熟过程中，这些基因受不同的调节，它们的表达受乙烯及一些未知的发育因子的影响（Griffiths et al.,1999）。

脂氧合酶基因的表达属于信号转导途径中的早期事件，能对外界以及胞内信号迅速作出反应。在番茄叶片中，伤诱导的LOX mRNA 在0.5小时可以检测到，在诱导后2-4小时达到最大，然后开始降低(Clarence，2000)。

三 LOX途径的初级代谢

一直以来,都认为脂质的过氧化作用是一个有害的过程,可破坏生物膜的结构,导致细胞功能紊乱。事实上,脂质的氧化对生物体来说,具有双重的影响。一方面,由于过氧基的存在,扰乱了疏水性脂质之间以及脂质与蛋白质之间的相互作用,导致生物膜和脂蛋白结构的改变；同时过氧基脂容易产生自由基,可诱导对其它生物膜和脂蛋白的修饰。当生物膜的脂双层被氧化,就丧失了它的屏障作用,使得亚细胞结构甚至整个细胞处于一种危险的状态。另一方面当脂质的氧化在一定的作用下行,并且被在特定的细胞空间,那么它可能对细胞甚至整个生物体产生有利的影响。例如脂质的氧化可促进类二十烷酸的合成,同时它参与了细胞的分化、成熟以及脂质的动员（Hartmut KÜhn & Astrid Borchert，2002）。下面将从以下三个方面详细介绍脂氧合酶参与的脂代谢反应。

（一）自由多烯脂肪酸的氧化

植物LOX可将自由多不饱和脂肪酸氧化成不饱和脂肪酸的过氧化物。一般认为是在脂酶的作用下，水解膜脂和贮存脂中的三酰甘油，释放出自由脂肪酸作为

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LOX的底物。LOX的催化主要包括三个步骤：⑴具立体专一性的脱氢过程，即对两个双键之间的亚甲基进行脱氢；⑵异丙烯基重排；⑶氧结合到2（E），4（Z）－戊二烯基上。第一步被认为是LOX反应的限速步骤。几乎所有植物的LOX都作用于亚油酸和亚麻酸的前手性中心C-11，形成的双-烯丙位基经过（n+2）或（n－2）异构化变成丙烯基，异构化过程依赖于LOX的特异性。大多数报道的LOX表现出很强的位置特异性，专一性的将亚油酸和亚麻酸转化为13－或9－过氧化物（Alexander Grechkin，1998）。总的来说，绿色植物主要具有13－LOX活性，合成(S)－过氧化物作为主要的差向异构体。

LOX作用的位置特异性随pH和氧浓度的改变而改变。在pH 6.0,大豆LOX－1氧化亚油酸产生12％的9(S)-HPOD,但在pH 9.0时，只产生13(S)-HPOD(Gardner，19)。由此，可得出以下结论：⑴ 9(S)-过氧化物由未解离的羧酸形成；⑵ 羧酸形式的底物可从任何一个方向进入活性部位，但是羧酸根阴离子仅在甲基端被识别。目前研究表明：在低氧浓度下大豆LOX丧失了位置特异性，产生相等量的9(S)-HPOD和13(S)-HPOD混合物，而在正常情况下，产生95％的13(S)-HPOD(Berry，1998)。

（二）LOX介导的膜脂及贮存脂的氧化

越来越多的实验数据表明：LOX具有氧化生物膜的能力，包括不同的细胞内膜和质膜。大豆的LOX-2在氧化膜脂中的脂酰基时比氧化非膜脂肪酸表现出更强的位置特异性。据此推测大豆LOX-2可能在体内膜重建过程中起着重要的作用(Maccarrone et al,1994)。

LOX同时参与了种子萌发过程中贮存脂的动员。各种植物种子的贮存脂中存在着酯化形式的脂肪酸氧化产物(Smith,1979；Gunstone et al,1986)。而且，LOX对贮存脂的氧化作用在种子萌发的早期被启动(Feussner & Kindl,1992)。在各种油料种子的幼苗（如黄瓜幼苗）的脂质体磷脂单层中，可检测到一种亚油酸盐特异的13-LOX(Feussner et al,1996)，可氧化亚油酸酯，而不需要脂酶的提前作用(Feussner et al,1997a)。在萌发的早期阶段，这种反应导致贮存脂中过氧化物含量的大幅度增加。氧化的脂肪酸主要含有(13S,9Z,11E)-13-(过氧)羟基-9,11-十八烷二烯酸[(13S)-H(P)OD]，这个化合物从脂质体上释放后进入

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β-氧化。因此推测贮存脂的动员是由特异的13-LOX而不是由脂酶起始的(Feussner et al,1995)。因此一种新的贮存脂降解机制被提出(Feussner et al,1997b)，在这种新的模式中，LOX催化的贮存脂的氧化先于三酰甘油的水解。

脂质体膜裂解后，13-LOX将贮存的甘油三酸酯氧化成相应的过氧基衍生物，然后在脂酶的作用下形成自由过氧基多烯脂肪酸，随即被还原为羟基化合物。

脂质体中这种特异的13-LOX的分子量（～100kD）高于І类LOX，可将甘油三亚油酸酯氧化为单--、双--或三--氧化的三酰甘油衍生物。萌发的含油种子中的这种新的脂质代谢方式表明13-LOX具有特殊的生理作用，这种酶似乎用来“标记”贮存脂，使得它们更容易被特异的三酰甘油脂酶降解。植物可通过这种方式区分在幼苗发育过程中脂质的稳定转化和萌发过程中成熟脂质的降解。

（三）厌氧性的脂氧合酶反应

在缺氧的条件下，LOX产生一系列自由基转化物，而不是产生正常条件下的过氧化物。这些产物，即脂肪酸二聚体、氧二烯、环氧乙醇，是由脂肪酸自由基或烷氧自由基形成的(Vick,1993；Gardner,1991)。一些LOX在有氧的条件下也产生这些化合物，例如，土豆块茎LOX产生9,10-环氧-11-羟基-12,15-十八碳二烯酸和9,10-环氧-11-羟基-12-十八碳单烯酸(Galliard et al,1975；Grechkin et al,1995)。

四 脂肪酸过氧化物的代谢

LOX反应产生的脂肪酸过氧化物在酶的作用下通过至少6条途径转化成不同的化合物,统称为氧脂（oxylipins），植物oxylipins对生物体来说,不只是产生负面的影响,许多实验数据表明,它们是有效的生物调节剂,在信号转导、植物的生长发育、衰老、器官的形成、体内平衡的保持等方面都具有重要的作用。参与代谢的酶包括过氧化氢裂解酶、氧化丙二烯合酶、联乙烯醚合酶、过氧酶以及还原酶等等。这里主要介绍脂肪酸过氧化物的三条主要代谢途径、代谢产物的生理作用及代谢途径的组织器官特异性。

(一) 三条主要代谢途径

1． 过氧化氢裂解酶(hydroperoxide lyase, HPL)途径

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过氧化氢裂解酶是植物脂肪酸过氧化物代谢中最重要的一个酶，它在植物中的含量非常丰富。它催化过氧基脂肪酸链在过氧化物碳原子和相邻的双键次甲基间断裂。通过这种方式，13－过氧化物被转化成六碳醛和十二碳酮脂酸；9－羟基过氧化物被转化成九碳醛和九碳酮脂酸。

Crombie等(1991)提出了该酶的作用机制,包含了环氧烯丙基碳正离子中间体，包括以下三步:⑴ 过氧化物的质子化-脱水作用,生成环氧烯丙基碳正离子中间体；⑵ 环氧烯丙基碳正离子经重排生成水合氢离子；⑶ 水合氢离子经羟基化,形成半缩醛；⑷ 半缩醛中间体降解成两个醛片段。 2． 氧化丙二烯合酶(allene oxide synthase, AOS)途径

氧化丙二烯合酶将脂肪酸过氧化物转化为不稳定的丙二烯氧化物，在无酶的条件下，形成12-氧-植二烯酸的外消旋衍生物或水解形成α-和γ-酮。在氧化丙二烯环化酶（allene oxide cyclase ，AOC）的作用下，生成(9S,13S)-12-氧-植二烯酸(Ziegler et al,2000)。

纯化的亚麻种子AOS产生丙二烯氧化物的同时,产生环氧乙醇。为了解释这种现象,Song等提出了AOS催化形成环氧乙醇的裂解机制,包括三个步骤:⑴ 氢过氧化物O-O键的同裂作用；⑵ 生成的烷氧自由基重排为环氧烯丙自由基；⑶ 羟自由基结合到环氧烯丙自由基上。作者推测,在AOS活性中心, 环氧烯丙自由基经过一次电子氧化生成环氧烯丙基正离子,然后脱质子生成丙二烯氧化物(Song et al ,1993)。

3． 联乙烯醚合酶(divinyl ether synthase, DES)途径

联乙烯醚合酶将脂肪酸过氧化物转化为具有细胞毒性的联乙烯醚(Weber, et

al, 1999)。联乙烯醚与一般的oxylipins不同,在它的碳氢链上具有醚氧。

Crombie等(1991)提出了联乙烯醚的合成机制,包含了一个环氧烯丙碳正离子中间体。包括以下两个步骤:⑴ 9(S)-HPOD经质子化-脱水作用,生成环氧烯丙基碳正离子中间体；⑵ 在酶的作用下, 环氧烯丙基碳正离子的C14位脱质子,并且伴随着环氧乙烷C-C键的断裂,生成colneleic acid。

除了上述三条主要代谢途径外，还存在着其它的过氧化物的代谢途径。第一条途径是过氧酶(peroxygenase, POX)途径,分子内发生氧转移，将脂肪酸的过氧

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化物转化为环氧-或过氧基多不饱和脂肪酸(Blee,1998; Hamberg,1995)。第二条是环氧乙醇合酶(epoxy alcohol synthase, EAS)途径(Hamberg,1999)。在EAS的催化下，脂肪酸过氧化物经分子内重排形成多羟基脂肪酸。最后一条是还原酶途径。在还原酶作用下生成羟基脂肪酸(Feussner et al,2002)。

(二) 代谢途径的组织器官特异性

在不同的植物组织中,有着其特异的LOX代谢途径,主要由两个方面决定:1、存在于植物组织中的LOX的位置特异性；2、参与脂肪酸过氧化物代谢的酶。从表一（Alexander Grechkin，1998）中可以看出:LOX代谢在叶片和非绿色组织中存在明显的差异。例如,在玉米和小麦叶片及种子中有着明显不同的LOX代谢途径。在豌豆的幼叶中,其产物具有很大的多样性,但随着年龄的增长而简化(Grechkin & Tarchevsky,1988)。大多数的植物叶片具有13-LOX活性，也存在着

表一 LOX途径中的酶在一些高等植物器官中的分布

Table 1 Distribution of LOX pathway enzymes between organs of some higher plant species Plant Origin LOX type Main enzymes of hydroperoxide metabolism (other than LOX)

Sunflower Seed Leaf

9 13

AOS HPL

Maize Seed Leaf

9 13

AOS and AOC AOS and AOC

Wheat Seed Leaf

9 9 and 13

No detected AOS

Tulip Bulb Leaf

9 9

AOS and AOC AOC

Tomato Cotyledons Root leaf

13 9 13

AOS

DES and AOS AOS

例外,如小麦叶片同时具有9-LOX和13-LOX活性，郁金香叶片,主要具有9-LOX活性,这是到目前为止,已知的两个例外。

LOX代谢途径的方向可随着植物的生长发育而改变。例如,LOX参与种子的萌发和果实的成熟过程,特异的LOX同工酶基因在萌发的种子和成熟的果实中表达。在不同的组织和器官中具有不同方向的LOX代谢途径,表明每一种路径有着

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其自身的生理作用。例如,一直以来,都认为AOS途径的唯一作用就是合成茉莉酮酸酯,但是,从表一（Alexander Grechkin，1998）中我们可以看到:在一些组织中存在AOS活性,如玉米种子和郁金香鳞茎,而这些组织中的LOX只具有9-LOX活性,而不具有13-LOX活性,在这些组织中,通过LOX途径合成的oxylipins主要是酮。这个例子以及LOX途径的总体多样性表明许多oxylipins的生理作用还有待于被揭示。

五 脂氧合酶初产物的色谱分析

脂肪酸过氧化物是脂氧合酶作用的初产物，它们是高反应活性的分子，能被迅速转化为具有生理活性的物质，即oxylipins。如上所述，在植物中，这些过氧化物在一系列酶的作用下，生成多样的具生物学功能的产物。尽管大多数的植物和动物的LOX催化生成的过氧化物具有S绝对构型，但是R构型的产物也是普遍存在的，尤其是在水生无脊椎动物和植物中(Gerwick,1994)。

LOX产物结构的阐明对于确立该酶的生理作用具有重要的意义。因为产生的过氧化物的生理活性与它们的位置特异性和立体选择性有关。例如，有一段序列参与了海星卵母细胞发育为成熟的卵，其转化过程是由8R-HETE起始的，它的对映体8S-HETE就没有这种活性(Meijers,1986)。

在七十年代早期，就已经提出了各种检测LOX产物位置特异性的方法。这里主要讨论利用层析方法(RP-,SP-,CP-HPLC,LC/MS和GC/MS)分析LOX初产物的位置特异性和立体专一性。

（一） HPLC

在分析LOX产物中，高效液相(HPLC)是最常用的一种技术，包括反相（RP-HPLC）和正相（SP-HPLC）。这种技术的普适性部分归功于大多数的LOX产物带有生色团，不需要经过衍生化就可通过光度测定法(包括光电二极管矩阵检测器)直接检测（Borgeat et al,1990）。RP-HPLC主要用于分离HPETEs和HETEs，SP-HPLC主要用于分析HPODs和HPOTs，对于用RP-HPLC不能分离的化合物，可用SP-HPLC做进一步的分离(Manuela Pérez Gilabert & Francisco Garc´ýa

Carmona, 2002)。

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（二）LC/MS

HPLC和质谱仪的联用为分离和分析完整LOX产物提供了新的可能。这些化合物通常是热不稳定、不挥发的，必须在温和的条件下将其转化为气相才能进行分析，而且，这些不稳定的分子需要在一定的条件下进行离子化，以防止大量内能的聚集，离子片断化和分子质量信息的丢失。几种LC/MS界面如热喷射（TSP），快原子轰击（FAB），电喷射（ES）以及气压流化学电离（APCI）已经用于分析LOX产物(Manuela Pérez Gilabert & Francisco Garc´ýa Carmona, 2002)。其中，ES离子化串联质谱联用计是报道最多的一种分析LOX产物的仪器，但是很多实验室还不能提供这种设备。

（三）GC/MS

气相色谱和质谱仪的联用在阐明LOX产物的结构方面起着重要的作用。现代分析型的气相色谱通常在一个长的毛细管中进行，柱子的内壁覆盖一层不挥发的液体，在分析不同的LOX产物时选用不同的柱子。许多化合物所具备的挥发性不足以使其在室温蒸发，因此大多数的气相色谱在高温下进行。但是，过氧化物通常热不稳定，这就了GC/MS的使用（Terao & Matsushita,1975）。为了避免这个问题，通常将过氧化物还原为相应的羟基类似物，再用于GC/MS分析。还原后产生的羟酸转化为挥发性的醚或酯衍生物。GC/MS包括阴离子电子俘获(CI)- GC/MS和电子碰撞(EI)- GC/MS。

CI- GC/MS是一种很灵敏的确定分子量的方法，用于分析脂肪酸过氧化物醚酯衍生物的分子量(Min et al,1980;Blair,1990)。但是这种方法不能鉴别出羟基脂肪酸位置异构体。EI- GC/MS虽然灵敏性不及CI- GC/MS，但是能产生结构特异的离子碎片，因此通常用于确定羟基取代基的位置(Johnstone & Rose,1996; Murphy et al,1994)。

六 脂氧合酶研究现状与展望

自从1932年首次在大豆(soybean)中发现脂氧合酶以来，对脂氧合酶的研究已有七十多年的历史,取得了很大的成绩。到目前为止，至少有35种植物的LOX基因被分离鉴定，有三种生物的LOX（大豆的LOX-1,LOX-3，兔网织红血球

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第一章 植物脂氧合酶的研究进展

LOX-1）晶体结构被弄清(Daisuke Shibata et al, 1987)。同时，许多分子生物学及分子遗传学方法的运用，如利用基因沉默、基因删除等手段开展转基因植物的研究，同时结合化学方法对LOX产物进行分析，大大推动了LOX途径及代谢产物生理作用的研究。现在我们对LOX途径，特别是JA信号途径已有了较清楚的认识，一些oxylipins生物合成途径、合成机制以及生理作用也得到了阐明。

同时，我们也应该注意到，由于对JA的研究几乎集中了所有研究LOX途径生物重要性的学者的注意力。对植物氧脂（oxylipins）的认识，除茉莉酸外，还知之甚少（Alexander Grechkin，1998）。毫无疑问, 茉莉酮酸酯是重要的生物调节剂,但是,它们不能代表目前已知的所有的植物LOX途径的产物。同时由于LOX是一个多基因家族，存在同工酶，这就为研究各种LOX具体的生理作用、作用机理及在信号途径中扮演的角色增添了难度。量变引起质变，相信随着对LOX越来越广泛和深入的研究，这些问题最终会得到阐明。当然，我们的最终目的是希望通过遗传工程获得抗病、抗虫及抗逆植株，更好的为工农业生产服务。

参考文献

孙大业，郭艳林，马力耕，崔素娟。细胞信号转导途径的多样性、网络化与专一性。细胞信号转导，2001，pp,158－176

A.Geerts, D. Feltkamp, S. Rosahl. Expression of lipoxygenase in wounded tubers of Solanum tuberosum L. Plant Physiol, 1994,105 : 269–277

A.L. Fidantsef, R.M. Bostock. Characterization of potato tuber lipoxygenase cDNAs and lipoxygenase expression in potato tubers and leaves. Plant Physiol, 1998,102: 257– 271.

Alexander Grechkin. Recent developments in biochemistry of the plant lipoxygenase pathway .Prog.Lipid Res.,1998,37(5)：317–352

B.H. Min, J. Pao, W.A. Garland, J.A.F. de Silva, M. Parsonnet. J. Chromatogr. 1980,183:411

Baker B,Zambryski P,Staskawicz B,et al.Signalling in plant-microbe interactions. Science,1997,276:726-732

11

乳突果组培苗中脂氧合酶基因的诱导及克隆

Berry,H.,Debat,H.,Garde,V.L. Oxygen Concentration Determines Regiospecificity in Soybean Lipoxygenase-1 Reaction Via a Branched Kinetic Scheme. J.Biol.Chem.,1998,273:2769-2776

Bisakowski, B., Perraud, X., Kermasha, S. Characterization of hydroperoxides and carbonyl compounds obtained by lipoxygenase extracts of selected microorganisms. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1997, 61:1262–1269

Blee, E. Phytooxylipins and plant defense reactions. Prog. Lipid Res. 1998,37:33–72 Brash AR. Lipoxygenases: occurrence,functions, catalysis, and acquisition of substrate. J. Biol. Chem.,1999,274：23679–23682

Clarence A.Ryan. The systemin signaling pathway:differential activation of plant defensive genes. Biochimica et Biophysica Acta, 2000, 1477:112-121

Cornelia Göbel, Ivo Feussner, Mats Hamberg, Sabine Rosahl. Oxylipin profiling in pathogen-infected potato leaves. Biochimica et Biophysica Acta, 2002,1584:55- Crombie,L.,Morgan,D.O.,Smith,E.H. An isotopic study (2Hand 18O) of the enzymic conversion of linoleic acid into colneleic acid with carbon chain fracture: The origin of shorter chain aldehydes. J.Chem.Soc.Perkin Trans.,1991,1:567-575 Daisuke Shibata, Janusz Steczkoli, Jack E. Dixon et al. Primary Structure of Soybean Lipoxygenase-1. J. Biol. Chem., 1987, 262(21): 10080-10085

Davis KR, Hahlbrock K.Induction of defense responses in culture parsley cells by plant cell wall fragments. Plant Physiol, 1987,84:1286–1290

Feussner I，Wasternack C.The lipoxygenase pathway. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol.Biol.，2002，53：275– 297

Feussner, I. et al. Lipid-body lipoxygenase is expressed in cotyledons during germination prior to other lipoxygenase forms. Planta, 1996,198: 288–293 Feussner, I. et al. Lipoxygenase catalyzed oxygenation of storage lipids is implicated in lipid mobilization during germination. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1995,92:11849–11853

Feussner, I. et al.Do specific linoleate 13- lipoxygenases initiate -oxidation? FEBS Lett., 1997b, 406:1–5

Feussner, I. et al.Structural elucidation of oxygenated storage lipids in cucumber

12

第一章 植物脂氧合酶的研究进展

cotyledons. J. Biol. Chem., 1997a, 272: 21635–211

Feussner,I.,Kindl,H. A lipoxygenase is the main lipid body protein in cucumber and soybean cotyledons during the stage of triglyceride mobilization.FEBS Lett.,1992,298：223-225

Flor HH .Current status of gene-for-gene concept. Annu Rev Phytopathol, 1971,9 : 275–296

Galliard,T.,Phillips,D.R.,Matthew,J.A. Enzymic reactions of fatty acid hydroperoxides in extracts of potato tuber. II. Conversion of 9- and 13-hydroperoxy -octadecadienoic acids to monohydroxydienoic acid, epoxyhydroxy- and trihydroxymonoenoic acid derivatives.Biochim.Biophys.Acta,1975,409:157-171 Gardner,H.W. Recent investigations into the lipoxygenase pathway of plants. Biochim.Biophys.Acta,1991,1084:221-239

Gardner,H.W. Oxygen radical chemistry of polyunsaturated fatty acids, Biochim.Biophys.Acta,19,1001:274-281

Gerwick, W.H. Structure and biosynthesis of marine algal oxylipins.Biochim. Biophys. Acta, 1994,1211:243-255

Grechkin,A.N.,Fazliyev,F.N.,Ilyasov,A.V. Formation of the new oxiranyl allylic alcohols by potato tuber lipoxygenase. Bioorgan. Khim.,1995,21:399-400

Grechkin,A.N.,Tarchevsky,I.A. Perspectives of search for eicosаnoid analogs in plants.Biokhimiya,1988,52:1563-1568

Griffiths A, Barry C, Alpuche-Solis AG, Grierson D. Ethylene and developmental signals regulate expression of lipoxygenase genes during tomato fruit ripening. J Exp Bot , 1999, 50: 793–798

Gunstone,F.D.,Harwood,J.L.,Padley,F.B.The Lipid Handbook,886pp.Chapman and Hall,London,New York,1986.

Hamberg, M. An epoxy alcohol synthase pathway in higher plants: biosynthesis of antifungal trihydroxy oxylipins in leaves of potato. Lipids.1999, 34:1131–1142

Hamberg, M. Hydroperoxide isomerases. J. Lipid Mediators Cell Signal. 1995,12:283–292

13

乳突果组培苗中脂氧合酶基因的诱导及克隆

Hartmut KÜhn , Astrid Borchert. Regulation of enzymatic lipid peroxidation:the interplay of peroxidizing and peroxide reducing enzymes. Free Radical Biology & Medicine, 2002,33(2):1–172

Helena Porta, Mario Rocha-Sosa. Plant lipoxygenases.Physiological and molecular features.Plant Physiology,2002,130：15–21

Helena Porta，Mario Rocha-Sosa . Plant lipoxygenases.Physiological and molecular features. Plant Physiology, 2002,130：15–21

I.A. Blair. Electron-capture negative-ion chemical ionization mass spectrometry of lipid mediators. Methods Enzymol. 1990,187 : 13-23

J. Royo, G. Vancanneyt, A.G. Perez, C. Sanz, K. Sto¨rmann, S. Rosahl, J. J.Sanchez-Serrano.Characterization of three potato lipoxygenases with distinct enzymatic activities and different organ-specific and wound-regulated expression patterns. J. Biol. Chem., 1996, 271:21012– 21019 J.Terao, K.Matsushita.Agric.Biol.Chem.,1975,39:2027

L. Meijers, A.R. Brash, R.W. Bryant, K. Ng, J. Maclouf,G. Sprecher.J. Biol. Chem. 1986,261:17040

Maccarrone,M.,van Aarle,P.G.,Veldink,G.A.,et al. In vitro oxygenation of soybean biomembranes by lipoxygenase-2. Biochim.Biophys. Acta,1994,1190:1-169 Manuela Pérez Gilabert, Francisco Garc´ýa Carmona. Chromatographic analysis of lipoxygenase products. Analytica Chimica Acta, 2002,465 : 319–335

P.Borgeat, S.Picard, P.Vallerand, et al. Automated on-line extraction and profiling of lipoxygenase products of arachidonic acid by high-performance liquid chromatography. Methods Enzymol.,1990,187:98-116.

Porta H, Rueda-Bený´tez P, Campos F, et al. Analysis of lipoxygenase mRNA accumulation in the common bean (Phaseolus vulgaris L.) during development and under stress conditions. Plant Cell Physiol, 1999, 40: 850–858

Porta, H., Rocha-Sosa, M. Lipoxygenase in bacteria: a horizontal transfer event? Microbiology, 2001,147:3199–3200

R. Casey.Sequence of a cDNA clone encoding a potato (Solanum tuberosum) tuber lipoxygenase. Plant Physiol, 1995, 107:265– 266

14

第一章 植物脂氧合酶的研究进展

R.A.W. Johnstone, M.E. Rose. Mass Spectrometry for Chemists and Biochemists, Cambridge University Press, New York, 1996, p. 1.

R.C. Murphy, J.A. Zirrolli, in: T. Matsuo, R.M. Caprioli, M.L. Gross, Y. Seyama (Eds.).Biological Mass Spectrometry:Present and Future, Wiley, Chichester, 1994, p. 463.

Salmond GPC. Secretion of extracellular virulence factors by plant pathogenic bacteria. Annu Rev Phytopathol, 1994,32:181–200

Shibata,D.et al. Lipoxygenases. Plant Mol.Biol.Rep.,1994,12:S41-S42.

Siedow JN.Plant lipoxygenase: structure and function. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Bio.l, 1991,42: 145–188

Smith,C.R. Occurrence of unusual fatty acids in plants, Progr.Chem.Fats Other Lipids,1971,11：137

Song,W.C.,Baertschi,S.W.,Boeglin,W.E.,Harris,T.M.,Brash,A.R. Formation of epoxyalcohols by a purified allene oxide synthase. Implications for the mechanism of allene oxide synthesis. J. Biol. Chem.,1993, 268:6293-6298

Su, C.,Oliw, E. H. Manganese lipoxygenase. Purification and characterization. J. Biol. Chem. 1998, 273:13072–13079

Vick B.A.,in Lipid Metabolism in plants.,ed.T.S.Moore,Jr.CRC Press,Boca Raton,1993,pp.167-191

Walton JD.Deconstructing the cell wall. Plant Physiol . 1994,104 :1113–1118 Weber, H. et al. Divinyl ether fatty acid synthesis in late blight-diseased potato leaves. Plant Cell ,1999,11:485–493

Xiaoyan chen, Pallu Reddanna, G.Ravindra Reddy,et al .Expression,Purification,and Characterization of a Recombinant 5-Lipoxygenase from Potato Tuber.Biochemical and Biophysical Research Communications,1998,243:438-443 Ziegler, J. et al. Molecular cloning of allene oxide cyclase. J. Biol. Chem. ,2000 ,275: 19132–19138

15