维普资讯 http://www.cqvip.com Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 犬瘟热病综合诊断一于２．５药敏试验结果 辉 ２７ 是一个普遍存在的病原。我们在动物感染试验中发现，所分离 的大肠埃希氏菌肉汤培养物腹腔感染小白鼠均能在ｌ２～２４ ｈ 内致小白鼠死亡。本属动物回归试验也能使２０日龄雏鸡腹腔 感染发病死亡，出现与自然病例相似的临床症状和病理变化。 药敏试验证明该菌对氟哌酸、丁胺卡那、妥布霉素、氯霉素 高度敏感；复合磺胺、呋喃妥因、万古霉素中度敏感；卡那霉素、 四环素、庆大霉索、羧苄青霉素、青霉素、头孢呋新、卡那霉素、 头孢唑啉、链霉素等不敏感。 ２．６动物致病性结果 这说明分离菌属于病原性大肠杆菌。 ３．２大肠杆菌容易对抗生索产生耐受性，给临床选用抗生索 带来较大的困难，因此应引起驼鸟养殖业的高度重视。所以药 敏试验选择敏感药物是临床用药防治大肠杆菌的最佳选择。另 外改善饲养环境，加强饲养管理，做到以防为主。以治为辅。 ３．３大肠埃希氏菌的血清型较多，在驼鸟上已经分离鉴定出 雏鸡腹腔感染后１２ ｈ 的大肠杆菌有０ｌ、０２、（）５、０６、（）８、０９、０３５、０５５、０７８，而国内以 Ｏｌ、０２、Ｏ７８、０３５血清型为常见【５ Ｊ。本试验分离的大肠杆菌血清 型为０ｌ。 ２．６．１分离菌对小白鼠致病性 小白鼠于感染后１２ ｈ开始 死亡，至２４ ｈ全部死亡。死后解剖，可见肠道有出血现象，并 从死亡小白鼠的心、肝、脾等内脏器官均能分离到感染菌。对 照组小白鼠未见异常。 ２．６．２分离菌对本属动物回归试验全部开始发病，表现为腹泻症状；至２４ ｈ时８只死亡。剩余２ 只精神沉郁，４８ ｈ后耐过恢复正常。对死亡的立即剖检，发现 肠道出血，尤其十二指肠出血严重，肠系膜淋巴结肿大。腹腔有 参考文献： ［１］ 袭孝良，陶茂辉．驼鸟大肠杆菌病的诊治及致病性大肠杆菌Ｏｌｏｌ 的分离鉴定［Ｊ］．中国兽药杂志，１９９７，２３（８）：３０—３３． ［２］蔡宝祥．家畜传染病［Ｍ］．北京：中国农业出版社，１９９８．５４—５５． 黄色渗出物。并从死亡小鸡的心、肝、脾等内脏器官均能分离 到感染菌。空白对照组未见异常。 ２．７血清型鉴定结果 该菌的血清型为０１。 ［３］廖延雄．兽医微生物实验诊断手册［Ｍ］．北京：中国农业大学出版 社，１９９５．８１一ｌｌ４． ３讨论 ３．１ 分离茵通过培养特性，菌体形态，菌落形态，染色特性，生 化试验等一系列的系统鉴定，确定该菌为驼鸟大肠埃希氏菌。 大肠埃希氏菌可感染包括驼鸟在内的各种年龄的家禽。但幼驼 鸟感染性很高，可引起不同程度的死亡。有关资料报道 大 肠杆菌病是驼鸟的一种主要疾病，大肠杆菌在新兴的养驼业中 【４］曹澎泽。郭玉瑛．兽医微生物学及免疫学技术［Ｍ］．北京：北京农 业大学出版社，１９９２．１—５３． ［５］张常印。芮兵．从病死驼鸟中分离鉴定出０３５血清型大肠杆菌【Ｊ ３． 动植物检疫。１９９９。２（２９）：２３—２５． ［６］ 崔保安。卢中华．驼鸟大肠杆菌病的诊断与防治［Ｊ］．黑龙江畜牧 兽医。２００１，４：３８． （００３） 犬瘟热病综合诊断 于 辉 （佛山科技学院农牧学院动科系，广东南海５２８２３１） 中图分类号：￥８５８．２９２ 文献标识码：Ｂ 文章编号：１００４—７０３４（２００２）１ｌ一００２７—０２ 性鼻液，堵塞鼻孔，张口呼吸呈腹式。肺部听诊，支气管音粗 厉。闻干性罗音或湿性罗音或捻发音。可视黏膜发绀，眼睑周 围有散性出血点。眼睑干燥，呈脓性眼结膜炎，角膜溃疡。甚至 穿孔。若以消化道炎症为主时，主要表现为食欲不振或废绝， 呕吐，腹泻，排出带有黏液的稀便，有时带有血液。在后期出现 非化脓性脑炎并导致神经症状。流涎，空嚼，有时全身肌肉振 颤。转圈，共济失调。口吐白沫，牙关紧闭，最后抽搐而死。 ｌ、３ Ｉ临床类症鉴别 犬瘟热是由副黏病毒科麻疹病毒属犬瘟热病毒（Ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ，ＣＤＶ）引起的犬科、鼬科、浣熊科等多种动物的 种急性、热性、高度接触性传染病。该病在临床上以双相热 性、卡他性鼻炎及随后引起的支气管炎、卡他性肺炎、严重的胃 一肠炎和神经症状为主要特征，少数病犬可见下腹部脓性皮疹及 足垫角化过度。发病率几乎达１００％，死亡率３０％～８０％不 等，素有“毁灭性传染病”之称…。由于本病经常引起混合感染 及继发感染，给经济动物养殖业造成巨大的经济损失。要减少 犬瘟热病造成的经济损失，尽早采取防治措施，因此对该病的 诊断尤为重要。 犬瘟热在临床上容易与感冒、呼吸道疾病、胃肠炎、犬细小 病毒性肠炎、传染性肝炎等相混淆，根据其临床特征与犬瘟热 进行初步鉴别诊断。单纯性胃肠炎时，无双相热型、无鼻、眼分 １临床诊断 临床诊断主要通过本病的流行特点、临床特征及类症病的 鉴别。 １．１流行特点 泌物等。传染性肝炎时，有黄疸等。犬细小病毒性肠炎呕吐剧 烈、频繁、饮水后立即发生呕吐，渴欲强烈，排出的番茄汁样血 便次数多、数量大。感冒时体温升高，无双相热型，鼻流清涕， 无流泪现象。而犬瘟热双相热型，眼、鼻有分泌物，严重时有脓 性分泌物；病犬饮水后较少发生呕吐，初便秘，后腹泻，粪便稀 薄、恶臭，有时混有气泡和血液；鼻、足垫过度角化；末期常出现 腹痛、肌肉振颤等神经症状，甚至惊厥直至死亡。 在自然条件下可感染多种犬科野生食肉兽，如小熊猫、貉、 貂、黄鼠狼，以及豺、狼、獾等。本病一年四季都可发生，冬春季 多发。６月龄以内的幼犬特别易感染，症状典型，死亡率极高。 世界各地都有流行。 １．２临床症状 ， ２实验室常规诊断 ２．１包涵体检查 体温呈双相热型。病初以呼吸道炎症为主，表现为流涕、 打喷嚏、咳嗽，常为干咳，严重时鼻镜龟裂，呼出恶臭气体，流脓 收稿日期：２００２—０９一Ｏ４ 包涵体主要存在于膀胱、胆管、胆囊、肾盂上皮细胞内。取 清洁载玻片，滴加生理盐水１滴，用小刀在膀胱黏膜上刮取上 皮细胞，与生理盐水混合研匀，制成涂片，置空气中自然干燥 后，用甲醇固定，苏木精一伊红染色后镜检。细胞核染成蓝紫 作者简介：于辉（１９７１～），男，黑龙江呼兰人，在读硕士。 维普资讯 http://www.cqvip.com ２８ Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖ＆ｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 色，细胞浆呈淡玫瑰色，包涵体被染成红色。包涵体大多在胞 浆内，１个细胞内可能含有１～１０个多形性包涵体，但一般呈 现圆形或椭圆形。程世鹏等分别对用强毒攻毒、注射犬瘟热疫 苗和正常狐貉进行检查，结果用强毒攻毒的狐貉发现了膀胱黏 膜涂片中有包涵体的存在，而注射犬瘟热疫苗组和正常对照组 则无包涵体的存在，对于临床发病动物检查同样可检查出包涵 体的存在【引。 ２．２ Ｄｏｔ—ＥＬＩＳＡ法诊断 金鑫等用建立的三抗体夹心法Ｄｏｔ—ＥＬＩＳＡ检测犬瘟热 病毒（ＣＤＶ）抗原，其抗原最低检出量为１．１ ５ ｎｇ／ｍＩ （０．５７６２５ ｎｇ／点），经与常规ＥＩ ＩＳＡ对１０４份自然感染犬的血 液白细胞样本，６０份眼结膜分泌物样本，７３份脾、肝、淋巴结等 脏器样本进行检测，检出的阳性率分别为９２．３１％，６６．６７％， ８３．５６％和９０．７２％，６３、２９％，８１．８６％；两种方法检出的总阳 性率分别为８３．５４％（１９８／２３７）和８０．１７％（１９０／２３７），总阳性 符合率为９５．９６％，表明两者呈高度正相关（ｒ＝０．９２，Ｐ＜ ０．０１）。经电子显微镜观察验证比较，三抗体夹心法Ｄｏｔ— ＥＬＩＳＡ检测的可信度为９４．７４％ Ｊ。 ２．３免疫组化法诊断 黑龙江畜牧兽医２００２年第ｌｌ期 通过电子显微镜检查、酶标ＳＰＡ染色和 ２．４．３病毒的鉴定琼脂扩散试验等方法进行病毒鉴定。 电镜下观察可见犬瘟热病毒粒子呈现多形性，多数为球 形，病毒粒子的直径为１１０－－５５０ ｎｍ之间。核衣壳呈螺旋状， 总长度为１ ０００ ｒｉｍ，螺旋直径１５～１９ ｒｌｌｎ，螺旋中心５ ｒｌｌｎ的孔， 螺距５－－６ ｎｍ，核衣壳由囊膜包裹，其内部为Ｍ，厚约５ ｎｍ，表面 为Ｈ和Ｆ两个糖蛋白组成的纤突，纤突长度为９ ｎｍ。 遇秀玲等应用酶标ＳＰＡ（葡萄球菌Ａ蛋白）染色法对接种 ＣＤＶ的Ｖｅｒｏ细胞后有相应ＣＤＶ抗原部位，同样滴加ＣＤＶ阳 性血清的对照细胞片，未见相应反应。ＣＤＶ ＭＤ一７７株感染 后３，６，９，１２ ｈ胞浆可见细小阳性颗粒（呈淡黄色至棕褐色着 染）；１ ｄ阳性反应明显增强，多见于胞浆，胞浆亦可见大空泡；２ ｄ坏死细胞呈强阳性反应，细胞问拉网；３～４ ｄ合胞体细胞呈 强阳性反应，坏死细胞呈棕褐色至黑褐色；５ ｄ阳性反应主要见 于新生细胞胞浆；６ ｄ合胞体细胞呈大圆形，阳性反应主要见于 胞浆；７ ｄ整个合胞体细胞呈一棕褐色大团块；８ ｄ大部分细胞 脱落，残留细胞呈强阳性反应【４】。 任文上等利用犬瘟热鸡胚成纤维细胞弱毒疫苗免疫制备 了琼脂扩散抗体，并对患犬瘟热病貉肝脏中的抗原进行检测， 与电镜结果相比较，阳性符合率达８５．７％，阴性符合率为 ７５％，认为是一种较为特异、敏感、操作简便的方法【５】。 免疫组化技术是在抗原抗体特异反应存在的前提下，借助 免疫化学的手段，检测抗原（或抗体）在组织细胞内存在部位的 门新技术，目前已广泛应用于人及动物传染病的病原鉴定和 快速诊断，极大地提高了传染病的诊断和防治水平。 Ｇａｔｈｕｍｂｉ等研究证实，从脑、脊髓、肺、肠、膀胱、脾和淋巴 结中均可检出ＣＤＶ抗原，其中中枢神经系统和肺是诊断的最 一３分子生物学诊断 近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，尤其是分子遗 传学的进步，大大提高了病毒的诊断水平，特别是核酸杂交、 ＰＣＲ技术的应用，大大提高了疾病诊断的准确性、敏感性和特 异性。 佳组织，脱髓鞘性脑炎和肺炎是犬瘟热的主要病变。Ｍｉｒｙ等 采用过氧化物酶法（ＰＡＰ）技术检查患犬瘟热性肺炎的病犬组 织，认为有病变的脏器组织均可检出ＣＤＶ抗原，且敏感性明显 高于包涵体检查。Ｍｉｔｅｈｅｌｌ等采用ＰＡＰ和单抗技术证实了实 验性感染ＣＤＶ脱髓鞘性脑炎病犬的脑组织中，不论是脱髓鞘 部位还是未见明显病变的白髓的神经胶质细胞中均可见到病 毒抗原。阳性细胞包括星状细胞、神经元细胞、室管膜细胞、脉 络丛细胞、脑膜细胞和血管周围的炎性细胞。 李金中等直接从死亡大熊猫肝脏提取ＲＮＡ，经反转录后 用犬瘟热病毒的１对引物扩增出了约３２０ ｂｐ的片段。此产物 经纯化、序列分析表明，其片段２个引物问长度为２８１ ｂｐ，与预 计片段大小相同。此毒株在核苷酸和氨基酸水平与北京犬野 毒株、哈尔滨犬野毒株、某疫苗弱毒株、Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ弱毒株和 海豹瘟热病毒２型毒株的同源性分别为９２．２％和９８．９％， ９２．５％和９８．９％，９１．５％和９４．６％，９２．９％和９８．９％，９８．２％ Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ等采用免疫荧光（ＩＦ）技术研究了息犬瘟热性脑 炎病犬的ＣＤＶ分布情况，结果从全部病犬的脑组织中均检出 ＣＤＶ抗原，在灰质和白质中均可见到病变。在灰质中，抗原主 要分布于神经元细胞中，包涵体呈成堆的大的颗粒样或细小颗 粒状或粉尘样聚集在胞浆中；在白质中主要存在于星状细胞 中。Ｉ ｉｕ等采用ＩＦ技术证实，在人工感染ＣＤＶ后３～４ ｄ，即可 从循环血单核细胞中检出ＣＤＶ抗原，病犬第一次发热时最具 传染性。 和１００％。这样就进一步确定了大熊猫的犬瘟热病毒感染【６】。 Ｚｕｒｂｒｉｇｇｅｎ等用地高辛标记Ｎ基因互补的特异性ＲＮＡ探 针具有高度敏感性，可查证单个感染细胞中存在的目的核酸序 列，特异性较强，不产生背景。Ｓｈｉｎ等运用ＲＴ—ＰＣＲ已能检 测出患狗外周血单核细胞中的犬瘟热病毒的核衣壳蛋白基因 （Ｎ）及运用ｐＲＶＳＶ载体成功表达了ＣＤＶ的Ｎ基因。 目前，在兽医临床工作中，犬瘟热的诊断多采用临床诊断、 包涵体检查和ＥＩ ＩＳＡ法。对于病毒的分离、鉴定，免疫组化法 和分子生物学等诊断方法，由于实验条件的限制，尚未推广应 用。 ２．４犬瘟热病毒的分离和鉴定 ２、４．１ 病料的采集从病兽分离病毒，取决于疾病的类型和 病情的发展。在体温开始上升的病毒血症早期，淋巴组织的感 染最为严重，因此最好从淋巴细胞和淋巴组织分离病毒。对于 急性病兽或急性死亡动物，病毒分布于全身各器官，故应从脏 器中分离病毒。在慢性病例或疾病的中后期多从肾脏或脑组 织分离病毒。 参考文献： ［１］周庆国，张更利．犬瘟热与常见相似疾病临诊特征的比较［Ｊ］． 畜牧与兽医，２０００。３２（３）：３２—３３． ２．４．２病毒分离犬瘟热病毒能够适应鸡胚和多种组织细胞 ［２］程世鹏，吴威，同新华．等．狐貉犬瘟热病综合诊断技术研究 ［Ｊ］．特产研究，１９９９，２：４０—４１． ［３］金鑫，鲁承，吕相哲，等．Ｄｏｔ—ＥＬＩＳＡ检测犬瘟热病毒抗原的 研究［Ｊ］．中国兽医科技，２０００．３０（６）：２１—２３． ［４］遇秀玲，田志恭．吴娜，等．犬瘟热病毒ＭＤ一７７株在Ｖｅｒｏ细胞 上增殖规律的观察［Ｊ］．中国兽医杂志，１９９８，２４（５）：ｕ—ｌ２． ［５］ 任文上，陈秀芬．母连志．等．犬瘟热琼脂扩散试验方法的建立 及初步应用［Ｊ］．中国兽医学报，１９９４，１４（４）：３９８—４０１． ［６］李金中，夏成柱．基因序列分析确诊大熊猫的犬瘟热病毒感染 ［Ｊ］．中国兽医学报。１９９９、１９（５）：４４８—４５０． （００３） 培养物，但并非所有毒株都能生长良好。犬瘟热病毒通过绒毛 尿囊膜接种９～ｌ１日龄鸡胚．经３～１０代后，于接种后５～７ ｄ 绒毛尿囊膜增厚，有的可引起豆斑。有报道认为，分离犬瘟热 病毒最好方法是用犬和貂的巨噬细胞培养物，接种２～３ ｄ后 出现圆形多核巨细胞。巨细胞容易脱落，而且并非所有的细胞 都形成巨细胞，故应多次仔细观察。