Caspase-1及其相关炎症因子在二乙基亚硝胺诱导大鼠肝癌形成过程中的

文献标志码A 文章编号1000 -1492(2019)09 -1382 -05 doi： 10. 19405// cnki. issnlOOO - 1492. 2019. 09. 010及其相关炎症因子白细胞介素lp(ITGp)、ITG8、核因子甲B

(NF-cB)在二乙基亚硝胺(DEN)诱导大鼠肝癌形成过程中

的变化及意义。方法制备DEN诱导的大鼠肝炎-肝硬化 -肝癌模型，并分别于造模第0、6、13、20周取材，光镜下观

肝癌是目前临床常见难治的恶性肿瘤,其国内

察大鼠肝脏病理变化，采用生物化学法检测大鼠血清谷丙转 氨酶# ALT)、谷草转氨酶(AST)%)甲氨酰转肽酶(GGT)和

发病率与死亡率分别位居恶性肿瘤第四位和第二 位［1］。肝癌发病机制非常复杂，但促进肿瘤的炎症 是目前公认的肿瘤十大特征之一⑵，慢性肝脏炎症

在肝癌的发生发展及转移过程中具有至关重要的推 动作用［3\"4］O Caspase-1是第一个在哺乳动物中被

%甲-岩藻糖昔酶(AFU)及肝癌组织中的CaspaseO活性，酶

联免疫吸附实验(ELISA法)检测血清炎症因子ITOp、IT- 18、NFpB含量的变化。结果 模型组大鼠在造模后第20

发现的半胱氨酸-天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteine

coneainingaspaoeaeespeciiicpooeease， Caspase)，

周均形成肝癌。在DEN诱导肝癌形成过程中，大鼠肝脏指

数逐渐升高，胸腺指数则逐渐降低，且大鼠肝脏形态及病理

切片均发生相应的改变；血清ALT、AST、GGT、AFU、ITOp、

IT-18和NFpB含量以及肝癌组织中CaspaseO活性均随着

多种炎症反应中具有核心作用［5］。该研究采

用腹腔注射二乙基亚硝胺(diethylnitosamine，DEN) 的方式来诱导大鼠肝炎-肝硬化-肝癌模型，旨在 探讨Caspase-1及其相关炎症因子白细胞介素1 p

(inter/ukin-1 p，IL-1 p)、IFG8、核因子岩B ( nuclear iaceookB， NF-kB) DEN 导大鼠 癌 过程造模进程逐渐升高，且在造模第20周(肝癌期)达到最高。

结论 利用DEN成功制备大鼠肝炎-肝硬化-肝癌模型。 其中CaspaseO及其相关炎症因子ITO p、ILG8、NFpB可作 为DEN诱癌过程中肝细胞损伤的标志因子，在肝癌发生发 展过程中发挥重要作用。中的变化及意义。关键词 肝癌;CaspaseO&白细胞介素lp；白细胞介素18;核 因子kB1材料与方法1 -1实验动物 雄性SD大鼠42只，SPF级，体质

量(140±20) g，购于广西医科大学实验动物中心, 生产许可证号SCXK桂2014-0002,使用许可证号 SYXK 2014-0003'1.2 实验 DEN 自 国 Sigma ， 号N0756-10ML&谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,

中图分类号 R 735.72019 -04 -28 接收基金项目：国家自然科学基金(编号:81660775、81860824) 作者单位:广西中医药大学基础医学院，南宁530200

作者简介:杨琪，女,硕士研究生；卓少元，男，副教授，医学博士，硕士生导师，责任作者，E-mail: sheoin_zhuo@ 126- com

ALT)和谷草转氨酶(glutamic-cxalacetic transami­

milchondOal reverse transmission was obseoed- Annexin VLITC//I cell apoptosis assay results showed that the apoptosis rate of THP-1 cells l SC, LC goups were signbicantiy lower compared with MC goup ( P < 0. 01 ) , The apoptosis fate of goup LC was higher than that of group SC ( P < 0. 01 ) , and that of goup TC was signOicantiy higheoehan ehaeoigooup SCand gooup LC ( P <0.01 ) ， eheoewa0no0igniiicanediieoencein apopeo0ioaeebeeween goup TC and goup MC ( P > 0. 05 ) - The expression level of KIF5B l BM-MSCs was higher than that in THP-1

cells( P <0. 001) - Rotenone signOicantiy inhibbed the expression of KIF5B l BM-MSCs ( P < 0. 01) - ConclusionMbochondOv of BM-MSCs are unidioctionVly transmitted to THP-1 cells cC TNTs, which may induces apoptosis

resistance in THP-1 cells; intercellular mitochondOal transport may be associated with motor protein KIF5B.

Key worls acute monocytic leukemia ； human bone maoow mesenchymal stem cells; THP-1 cells; apoptosis安徽医科大学学报 Ada UpbersPotis MePicioolis Anhui 2019 Sep ； ( 9 )nase, AST）测定试剂盒购自长春汇力生物技术有限-1383 -统计分析,数据用>±s表示，符合 态分布资料

，货号分别为C002-J% C001-J； %甲二 糖昔酶 采用单

间差 2结果差分析（ANOVA）检；若为非正态分统计学意义。（a-L-fucosidase, AFU）和）谷氨酰转肽酶（）甲/-

tamyt transpeptidase, GGT）测定试剂盒购于南京建

布资料采用Mann-Whitneg U秩和检验来比较两组

成生物工程研究所，货号分别为E008% C017；大鼠

CaspaseY活性测定

索莱宝科 -自武汉

生物限公司，货号BC3810 ；大鼠IL-10、IL-18和NFoB

2.1 一般情况

量和 量

组大鼠在造 ，进食酶联免疫吸附测定

科

EL-T2426c、E-EL-R0674c。组相差不大，从造 5周 食限 ，货号分别为E-LL-R0012C%E-，萎活动量减少， 暴；9周

大鼠，至造模结 7只大1 - 3主要仪器 Chemray全自动生化分析仪购自

美国Rayta公司;Epoch Biotek 长酶标仪购自美国Biotek公司；DMI3000B研究型倒置显微镜购自

德国Leica公司；ST 16R 离心机购自美国Ther­

mo Fishar Soaall Scientific 公司。1 -4方法1 -4.1动物造模实验大鼠共42只，适应性饲养 1周后（温度为21~23°C, 50%）,随机分为正对照组（6只）和模型组（36只），中 组70 mg/kg体质量给予

注射DEN,每周1次，连续注射10周。1 -4-2标本采集及处理 造模第0周随机抽取正

组动物3只，及造

6%13%20周

1天随机取 组动物3只，分别用3%戊巴比妥 注射，腹主动脉取血，常规制 清并分 •于-80 C 存备用。

迅取

脏、脾脏和胸腺组织标本， ％脾和胸 数:脏器指数（% ）=脏器湿重（/）/体质量（g） X100%。1.4.3

组 学 在各组大鼠肝脏同一部位取组织一块,4%多聚 固定， 埋,,HE染色，

， 。1 -4.4

检测采用 分

检测各组大鼠血清中ALT、AST、GGT和AFU的含量;采 用ELISA法检测血清炎 子ILY0、ILY8和NF-

kB水平。

步 相关 书操作。1.4.5 肝脏（或肝癌）组织Caspase-1活〉性检测 组织加裂解液匀浆后离心取上清液,用Bradford法

测定蛋白浓度，使蛋白浓度达到1 ~3 mg/ml。按照

Caspase-1 活性测定

书操作， 405 nm长 检 测 （ opeicaidensiey， OD ） ，Caspasv-1活性，Caspase-1活性百分比=实验组0D

值/对照组0D值X 100%。1.6 统计学处理 采用SPSS 17. 0 far Windows进鼠，解剖

胃 ，其余大鼠20周 已致癌。 组（第0周）大鼠肝脏形态 ，颜色鲜红，

，表 滑无任何 ，图1A；造 6周大鼠肝脏与第0周比较，除颜色稍深之外,无明显的异常表现，见图1B；造模第13 周大鼠肝脏表面逐渐，出数量不等、大小不一

的灰白色

，直大多1mm ，呈分布，见图1C；造模20周时,大鼠肝脏表面非常粗

，出 多个大小 的灰白色结节，部分大鼠腹腔黄色

，肝脏与周围器官 重， 出 和,图1D。在造过程中，大鼠体质量呈逐渐

。与

组（第0周）大鼠比较，造

6周大鼠肝脏、脾脏和胸 数 ；随着造 :程，肝脏 数和脾脏指数逐渐增加;而胸

数逐渐，与

组比较差

统计学意义（P<0.01）,表明DEN对脏器

定的毒性，大鼠免疫功能被抑制。见表1'图1 DEN诱导癌过程中大鼠肝脏形态变化A、B、C、D：造模第0、6、13、20周肝脏・ 1384 -表1安徽医科大学学报 Acta UnCefitatis MeeCinalv Anhui 2019 Sep ； ( 9 )造模不同时期大鼠体质量及脏器指数比较（n = 3，>±s ）脏数296.69 ±9.25271.07 ±8.388.26±12.12552.65 ±17.41 \"2.3 大鼠血清生化指标含量变化血清ALT、时间点-体量# g）0周6周13 周脾脏数32.39 ±4.9117.66±2.68胸 数20.12±10.37163 ±16AST、GGT、AFU的含量均随着造模进程逐渐升高。

与正常组（第0周）比较，血清ALT、AST和GGT含

338 ±27420 ±3910.15±6.236.67 ±4.7627.12 ±4.09\"43.53 ±6.61量在造 13周差 统计学意义（P<0.01），第

20周表现则更

20 周428 ±443.06 ±2.18\"\"&血清AFU含量在造 20与第0周比较：\"*P<0.01周差 统计学意义（P<0.01 ）o 表2 o 示大

鼠肝功 造模过程中逐渐恶化。2.2肝脏组织病理学比较正常组（第0周）大鼠 2.4 大鼠血清IL-1 p%IL-18和NF-kB含量变化血清ILGp、ILG8和NF-B含量均随着造

细胞，小中 脉周

造

，部分肝细胞

放射状排列。，程逐6周大鼠肝细胞 ，表为 性肝细胞渐。与 组（第0周）比，造 6周大鼠性变;肝小 结 步加重，

清IL-1 p含量 ，差 统计学意义（P <0. 05），NF-pB含量 ，但差 无统计学意义（P>0.05）；造 13 周大鼠 清 TL-1p、NF-kB 量

（P <0.01）；造 20 周鼠 清 TL-1p、TL-18小

性

性 伴炎性细胞浸润。造 13周大鼠肝细胞 同程度的小细胞增生灶，可见变性；出 性

典 小 。造 20周大鼠肝细胞可见不 和 NF-pB 含量 2.5

（P<0.01 ）o 表 3。同程度的 变性，肝癌细胞 块状，部分有出血肝脏（或肝癌）组织中Cashase-1活性变

和 ，并伴 细胞增生灶和结节。见图2。化 大鼠肝脏组织中Caspase-1活性随着造 程

表2造模不同时期大鼠血清生化指标含量变化（n = 3,> 士 s）ALT( U/L)AST( U/L)功0周6周13 周157.98 ±0.94 \"\"20 周71.00 ±0.3378.32 ±0.41321.46 ±0.72\"\"84 083.14736 809.37070.08 ±0.5336.05 ±0.699.58 ±1.56\"P<0. 05, \"\" P<0. 01GGT( U/L)AFU( U/)95.53 ±0.85 \"42.87 ±0.4010.42±1.93149.37 ±0.90 \"\"62. 56 ±0.67\"\"15.00±1.84310.78 ±0.42\"\"80.21 ±0.59 \"\"23.12 ±1.26 \"\"2 193.829.406与0周比：表3炎性因子IT-1p( pg/mi)大鼠血清中九-队九-囲和NF-B含量变化（n=3，> ± s )6周151.34 ±3.08 \"13 周0周128.53 ±2.4520 周?值163.086176. 24 ±5.36\"\"20.59 ±0.49\"12 277.78 ±968.39 \"272.21 ±2.25 \"\"22. 87 ±0.34 \"\"IT-18 (pg/ml)NF-pB( pg/ml)19.91 ±0.113 391.68 ±66.4120.71 ±0.20 \"3958.13±47.1531.833.28316 668. 92 ±3 030.44 \"\"与第 0 周比较：\"P<0. 05, \"\" P<0. 01图2造模不同时期大鼠肝脏组织病理学比较A、B、C、D：造模第 0、6、13、20 周肝脏切片；1:HEx200；2：HE x400安徽医科大学学报 Ado Uniersitatis Mekicinalts Anhui 2019 Sep；(9)-1385 -逐渐升高’与正常组（第0周）比较,造模第6周大

鼠肝组织中Caspase-1活性升高（P < 0. 05），造模第 13周差异有统计学意义（P<0.01 ）,至造模第20周

and oligomeyzation domain-lika receptors 1, NLRP1 ）、 NLRP3和黑色素瘤缺乏因子等多种炎性小体感受

器蛋白，及衔接分子凋亡相关斑点样蛋白ASC（ ap-

opeosis-asociaeed speck- iike peoeein coneaining a CARD）的作用被激活，成为paOL-10和paOL-18

活性达到最高（P<0.01）。造模第20周时,与大鼠

肝脏（含肝癌）组织比较,癌旁正常肝组织中

CaspaseY活性几乎没有差别；但肝癌组织内 CaspaseY活性却显著降低，甚至低于造模第6周的

成熟的工具酶NFoB是炎症致癌过程中主要的 调节因子，研究［7］表明NFoB在原发性肝细胞癌组

肝组织。见表4°表4大鼠肝脏组织中Caspase-1活性变化（n = 3,> 士s ）织中表达增强，且与癌组织的分化程度、有无淋巴结 转移、患者甲胎蛋白水平等呈正相关。除此之外,

prv-Faspase-1可以利用其半胱天冬酶募集结构域直

时间点组织来源活性百分比（%）F0周肝脏组织-76.76周肝脏组织6. 62 ±0.05 \"13 周脏组织9.80±1-11 \"\"20 周肝脏（含肝癌）组织13.49 ±0. \"\"20 周癌旁正常肝组织13.58 ±1.03 \"\"20 周癌组织5.61 ±0.20 \"与第 0 周比较：\"P<0. 05, \"\" P<0. 013讨论人类原发性肝癌的发生是一个多种诱因、多阶

段的过程，要经历肝炎-肝硬化-肝癌的过程。而

现代研究证实,DEN是一种具有遗传毒性的化学物

质，具有肝毒性，可致基因突变、畸形,还可诱导肺、

肝、血液系统多种肿瘤的形成,应用DEN制作肝癌 前病变模型具有阶段性特征。汤靓［6］的研究表明 DEN诱导大鼠肝癌模型有明显的三个病程:炎症期

（1 ~8周）、硬化期（9 ~15周）及肝癌期（16-20

周），与人类原发性肝癌的发展过程及病理形态学 变化等均非常相似。通过一般观察、肝脏组织病理

学比较，以及血清生化指标分析等结果，证实本实验 成功复制了该肝癌模型。本研究分别选取了第0周（正常）、第6周（炎

症期）、第13周（硬化期）和第20周（肝癌期）进行

相关炎症因子研究。结果显示，血清IL-10、IL-18、 NFoB含量均随着造模进程逐渐升高，且在造模第

20周（肝癌期）达到最高，提示这些炎症因子在

DEN诱导大鼠肝癌形成过程中可能发挥着非常重

要的作用，可作为反映DEN诱导肝癌发生发展过程

肝细胞损伤程度的标志因子。ILY0和IL-18在细胞内主要由Caspasv-1切割

白细胞介素 10 前体（pacu/or of intermukin-10 , pa- IL-10）和pmOLY8产生；当危险彳号来临时，pa-

Caspasa-1通过核昔酸结合寡聚化结构域核昔酸结

合寡聚化结构域样受体蛋白1 （ nucmo/ng binging接与受体相互作用蛋白2（ receptor-interacting protein 2,RIP2）相互作用，诱导RIP2依赖的NFoB激活;

与pmOLY0、prvOL-18成熟不同，NFoB的激活不 需要依赖CaspaseY酶的裂解活性⑷，而且活化后的

IL-1还可利用其受体IL-1R1激活NFoB⑼。这表

明IL-10、IL-18和NFoB均可作为Caspasv-1的效

应分子在炎症反应中发挥重要作用。本研究也证实

大鼠 脏组织中 Caspase-1 活性随着造 程逐渐升高，其表达趋势与血清IL-10、IL-18、NFoB含量

致。值得注意的是,造模第20周肝癌形成后, Caspase-1 活性 大鼠 脏（ 癌） 组织和癌旁

组织中 差别， 癌组织 却降低，甚至低于造模第6周的肝组织，提示造模第

20 周大鼠 脏（

癌） 组织中 Caspase-1 活性主要源于癌旁正常肝组织。这一结果与Wai el al［10］对

临床肝炎、肝硬化、肝癌患者的研究类似：Caspase-1

及其相关炎性小体组分在正常肝组织表达水平相对 较低,肝损伤（如肝炎、肝硬化）时表达量明显上调;

与癌旁 组织相比， 癌 细胞中的表达明显下调。其原因可能在于:在肝癌发生发展过

程中,一方面，以Caspase-1为核心的炎性小体在细

胞内激活，通过诱导细胞死亡以消除有癌变倾向的

细胞;另一方面，炎性小体效应分子ILY0、ILY8等

的裂解与释放可能在肿瘤微环境中引发炎症循环, 导致无菌性炎症和癌症发生［5,11］。刘钱［12］的研究也表明当肝脏存在炎症时，肝实

质细胞内Caspase-1的表达会增强；但在相同条件 , Caspase-1 癌细胞 的

要正常肝细胞。Caspase-1作为一种重要的炎症相关 分子，可以通过多种方式参与肿瘤炎症微环境, 其在肿瘤中的作用正如Zitvogel el al［11］所述：“在恶 性肿瘤细胞与其微环境相互作用过程中,Caspase-1 的激活扮演着双面角色:积极诱导肿瘤细胞程序性

・ 1386 -安徽医科大学学报 Acta UnCersitatis Meeicinalis Anhui 2019 Sep；(9)第二军医大学，2010： 14-36.[7]黄 勇，窦科峰，蒋建利-原发性肝细胞癌中核转录因子LB

死亡和抗肿瘤的免疫监视，但同时也通过刺激自分

泌或旁分泌，促进致癌性炎症及肿瘤的生长与转

移”。参考文献[1] 陈万青,孙可欣，郑荣寿，等.2014年中国分地区恶性肿瘤发

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diethylnitrosamine-induced heratocarcinogenesis in SD ratsYang Qi, Zhuo Shaoyuan(School of Basic Medical Sccncc, Guangxi UnCersita of Chinese MedCCe, Nanning 530200 )Abstract Objective To investigate the changes and significances of Caspase-1 l liver and seom interleukin 1 p(IL-1 p ) , interleukin 18( IL-18 ) , nuc/ar factor kB ( NF・ pB ) duOng diethylnitrosamine ( DEN ) -induced hepa/car- cinogenesis l SD rats. Methods Healthy male SD rats were administered with DEN by inRap—toneal injection ac­

cording to 70 mg/kg, once a week for 10 weeks. The rats were sacrificed at the 0, 6th, 13th and 20th week o-

spect/e/- Aber the blood was collected, the liver, thymus and spleen were removed and weighed- The liver path-

o/gical changes were obseoed under light microscopy- The activity of Caspase-1 l hepatocellular carcinoma and the levels of seom alanine transaminase( ALT) , aspvtate transaminase( AST) , )-glutamyt transpeptidase( GGT),

%-L-Jicosidase( AFU) , and were measured with biochemical method. ELISA was used to detect the la—s of IF- 1 p, IF-18 and NF-pB. Results DuOng DEN-induced hepatocarcinogenesis, the liver index of rats increased andeheehymusindeidecoeased goaduaay.Simiaaoay， HEseainingshowed seoiousinouoy.TheaceieieyoiCaspase-1 in

liver cancer tissue and the levels of serum ALT, AST, GGT, AFU, IL-1 p, IF-18 , NF-pB increased goduVly dur­ing hepatocarcinogenesis- Compared with the noonai goup, Vl were the highest l the 20th week( P < 0. 01) - Con­

clusion POmao hepatocarcinoma rat model was successfully established with DEN. IL-1 p, IF-18, NF-pB and

Caspase-1 weoesymboaiciniaammaeooyiaceoosoihepaeocyeedamageduoinghepaeocaocinogenesis, and maypaayim- pooeaneooaesin ehepoogoesoihepaeocaocinoma.Key worls hepatocarcinoma ； Caspase-1; inter/ukin-1 p ； interleukin 18 ; nuclear factor kB