水稻愈伤组织质量评价方法[发明专利]

*CN102081031A*

(10)申请公布号 CN 102081031 A(43)申请公布日 2011.06.01

(12)发明专利申请

(21)申请号 200910272963.6(22)申请日 2009.11.27

(71)申请人武汉大学

地址430072 湖北省武汉市武昌珞珈山(72)发明人李阳 李阳生

(74)专利代理机构武汉宇晨专利事务所 42001

代理人王敏锋(51)Int.Cl.

G01N 15/02(2006.01)G01N 21/00(2006.01)G01N 33/02(2006.01)

权利要求书 2 页 说明书 8 页 附图 5 页

()发明名称

水稻愈伤组织质量评价方法(57)摘要

本发明公开了一种水稻愈伤组织质量评价方法，其步骤是：1)本评估系统以愈伤组织颗粒；2)颗粒指标；3)所描述颗粒散碎；4)愈伤组织色泽指标；5)所描述的5个颜色指标；6)愈伤组织水化；7)愈伤组织有分化趋势；8)颗粒指标的权重系数Pc＝15；9)颗粒系数的状态；10)愈伤组织色泽指标的得分系数；11)愈伤组织水化指标的得分系数；12)愈伤组织分化指标的得分系数：13)愈伤组织质量得分的计算；14)描述的CS值低于70以下愈伤组织质量较差，得分90分以上的愈伤组织适合农杆菌转化操作，有最高的分化率。建立了水稻愈伤组织的评价模型，评价结果和转基因效率一致，有利于实验和生产的评估，比较和质量控制。CN 102081031 ACN 102081031 ACN 102081036 A

权 利 要 求 书

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1.一种水稻愈伤组织质量评价方法，其步骤是：

1)、本评估系统以愈伤组织颗粒，愈伤组织色泽，愈伤组织是否水化，愈伤组织是否有分化趋势共四个指标做为评价指标；

2)、颗粒指标(P)：愈伤组织颗粒根据愈伤组织生长的具体情况分为：a、颗粒散碎，硬度低；b、颗粒致密，硬度高；

3)、如步骤2)所描述颗粒散碎定义为：愈伤组织的直径小于3mm，容易松散，不紧密，并且愈伤组织表面毛刺状不平滑，切片为愈伤组织断裂处多，愈伤组织边缘不清晰，切片观察，颗粒致密定义为：愈伤组织直径大于3mm的颗粒，颗粒致密硬度高，愈伤组织表面光滑状，切片观察为细胞致密，胞质密度高，愈伤组织边缘清晰，愈伤组织组织的顶层细胞结构明显；

4)、愈伤组织色泽指标(C)：根据愈伤组织生长的具体情况分为五个等级，a、苍白；b、黄白；c、黄；d、深黄；e、褐，一块愈伤组织上出现黑点，这块愈伤组织的整体色泽特征定义为褐，愈伤组织上有出现苍白特征，这块愈伤组织整体特征将定义为苍白，愈伤组织有苍白特征则往往和水化特征相连，愈伤组织质地变软，细胞死亡；

5)、如步骤4)所描述的5个颜色指标，以R，G，B颜色系统定义如下表：观察光源为日光灯管，色温：6500度，亮度500lux；

6)、愈伤组织水化(H)：a、愈伤组织水化：愈伤组织出现发白，发软，惨白死亡的现象；切片特征为愈伤组织的表面层愈伤组织糜散；b、愈伤组织无水化：愈伤组织坚硬没有出现水软的现象，切片观察可见愈伤组织表层细胞层清晰，有明显的表层致密层结构；

7)、愈伤组织有分化趋势(D)：a、愈伤组织有长出根状分化的特征，切片观察为愈伤组织表层愈伤组织的致密层变薄或消失，愈伤组织内部有跟源基发生；b、愈伤组织正常无分化趋势：切片观察愈伤组织表层有明显的致密层愈伤组织，愈伤组织内部细胞大小和结构均匀，没有明显的区域结构，愈伤组织分化趋势使得下一步的继始容易褐化，有分化趋势的愈伤组织转基因没有效率，侵染后很快死亡；

8)、颗粒指标(P)的权重系数Pc＝15；愈伤组织色泽(C)的权重系数Cc＝25；愈伤组织水化(H)的权重系数Hc＝40；愈伤组织分化趋势(D)的权重系数Dc＝20；Pc+Cc+Hc+Dc＝100；

9)、颗粒系数(P)的状态，颗粒散碎的得分系数P1＝0；颗粒致密的得分系数P2＝1，散碎颗粒所占的比值P1p，致密颗粒所占的比值P2p；P1p+P2p＝1；

10)、愈伤组织色泽指标(C)的得分系数定义为：C1＝-1；C2＝0.75；C3＝1；C4＝0，75；C5＝-1；C1到C5分别代表苍白，黄白，黄，深黄，褐五种状态的得分系数，这5种状态所占的比例分别定义为：C1p，C2p，C3p，C4p，C5p。C 1p+C2p+C3p+C4p+C5p＝1；

11)、愈伤组织水化指标(H)的得分系数：H1＝-1；H2＝1，H1为水化愈伤组织的得分系数，H2为未水化愈伤组织的得分系数。这两种状态的愈伤组织所占比例分别定义为H1p，H2p；H1p+H2p＝1；

12)、愈伤组织分化指标(D)的得分系数：D1＝-1；D2＝1，D1为有分化趋势的愈伤组织的得分系数，H2为未出现分化趋势的愈伤组织的得分系数，这两种状态的愈伤组织所占比例分别定义为：D1p，D2p。D1p+D2p＝1；

13)、愈伤组织质量得分的计算：

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权 利 要 求 书

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CS＝(P1*P1p+P2*P2p)*Pc+(C1*C1p+C2*C2p+C3*C3p+C4*C4p+C5*C5p)*Cc+(H1*H1p+H2*H2p)*Hc+(D1*D1p+D2*D2p)*Dc；

14)步骤13)描述的CS值低于70以下愈伤组织质量较差，分化率不高，很难进行转基因操作；得分在70-90之间的愈伤组织已经适合分化，得到高的分化率，得不到高的转化率，很难转化成功，得分90分以上的愈伤组织适合农杆菌转化操作，也有最高的分化率。

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说 明 书

水稻愈伤组织质量评价方法

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技术领域

[0001]

本发明涉及水稻质量评价技术领域，更具体涉及水稻愈伤组织质量评价方法。该方法适用于所有水稻。

背景技术

[0002] 在水稻组织培养以及其他物种的组织培养研究过程中，我们要进行培养基对愈伤组织的生长率和生长质量进行评估，为培养基筛选和设计提供依据，对生长率进行评价很容易进行，只要计算愈伤继代前后的重量比值即可，但是对愈伤质量进行评价就要有相应的模型，在此之前还没有这种模型被建立。这就给培养基的综合评估带来了问题。所以本发明是建立了愈伤组织评价的模型，主要对愈伤组织质量相关的四个形状进行评估、统计，将愈伤组织的质量进行量化，这样就有利于对愈伤组织的质量进行量化评比，使得我们对培养基的研究更为严谨，方便。发明内容

[0003] 本发明的目的是在于提供了一种水稻愈伤组织质量评价方法，该方法首次建立了水稻愈伤组织的评价模型，评价结果和转基因效率基本一致，模型的建立有利于实验和生产的评估，比较和质量控制。本评价模型得分低于70以下愈伤组织质量较差，分化率不高，也很难进行转基因操作；得分在70-90之间的愈伤组织已经适合分化，可以得到较高的分化率，仍得不到较高的转化率，很难转化成功，得分大于90的愈伤组织适合农杆菌转化操作，也有最高的分化率。

[0004] 为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：[0005] 一种水稻愈伤组织质量评价方法，其步骤是：[0006] 1)、本评估系统以愈伤组织颗粒，愈伤组织色泽，愈伤组织是否水化，愈伤组织是否有分化趋势共四个指标做为评价指标。[0007] 2)、颗粒指标(P)：愈伤组织颗粒根据愈伤组织生长的具体情况分为：1，颗粒散碎，硬度低；2，颗粒致密，硬度高。[0008] 3)、如步骤2)所描述颗粒散碎定义为：愈伤组织的直径小于3mm，容易松散，不紧密，并且愈伤组织表面毛刺状不平滑，切片特征为愈伤组织断裂处较多，愈伤组织边缘不清晰，切片观察如图.11。颗粒致密定义为：愈伤组织直径大于3mm的颗粒，颗粒致密硬度高不宜松散，愈伤组织表面光滑状，切片观察为细胞致密，胞质密度高，愈伤组织边缘清晰，愈伤组织组织的外层细胞结构明显。[0009] 4)、愈伤组织色泽指标(C)：根据愈伤组织生长的具体情况分为五个等级，1，苍白；2，黄白；3，黄；4，深黄；5，褐。如果一块愈伤组织上有一点出现黑(褐)点，则这块愈伤组织的整体色泽特征定义为”褐”，如果愈伤组织上有一点出现苍白特征，这块愈伤组织整体特征将定义为”苍白”。愈伤组织具有苍白特征则往往和水化特征相连，愈伤组织质地变软，细胞死亡。

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CN 102081031 ACN 102081036 A[0010] [0011]

说 明 书

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5)、如步骤4)所描述的5个颜色指标，以R，G，B颜色系统定义如下表：观察光源为日光灯管，色温：6500度，亮度500lux；

6)、愈伤组织水化(H)：1，愈伤组织水化：愈伤组织出现发白，发软，惨白死亡的现象；切片特征为愈伤组织的表面层愈伤组织糜散，如图.15：2，愈伤组织无水化：愈伤组织坚硬没有出现水软的现象。切片观察可见愈伤组织表层细胞层清晰。有明显的表层致密层结构，如图.12。

[0012]

7)、愈伤组织有分化趋势(D)：1，愈伤组织有长出根状分化的特征，切片观察为愈伤组织表层愈伤组织的致密层变薄或消失，愈伤组织内部有跟源基发生，如图.1，图.16；2，愈伤组织正常无分化趋势：切片观察愈伤组织表层有明显的致密层愈伤组织，愈伤组织内部细胞大小和结构较均匀，没有明显的区域结构。愈伤组织分化趋势使得下一步的继始容易褐化，而且有分化趋势的愈伤组织转基因没有效率。侵染后很快死亡。[0014] 8)、颗粒指标(P)的权重系数Pc＝15；愈伤组织色泽(C)的权重系数Cc＝25；愈伤组织水化(H)的权重系数Hc＝40；愈伤组织分化趋势(D)的权重系数Dc＝20；Pc+Cc+Hc+Dc＝100。[0015] 9)、颗粒系数(P)的状态1，颗粒散碎的得分系数P1＝0；P2＝1。P1所占的比值P1p，P2所占的比值P2p；P1p+P2p＝1。[0016] 10)、愈伤组织色泽指标(C)的得分系数定义为：C1＝-1；C2＝0.75；C3＝1；C4＝0。75；C5＝-1。C1的比例分数C1p；C2的比例分数C2p；C3的比例分数C3p；C4的比例分数C4p；C5的比例分数C5p；C1p+C2p+C3p+C4p+C5p＝1。[0017] 11)、愈伤组织水化指标(H)的得分系数：H1＝-1；H2＝1。H1的比例分数H1p；H2的比例分数H2p；H1p+H2p＝1。[0018] 12)、愈伤组织分化指标(D)的得分系数：D1＝-1；D2＝1。D1的比例分数D1p；D2的比例分数D2p；D1p+D2p＝1。[0019] 13)、愈伤组织质量得分的计算方法是：

[0020] CS＝(P1*P1p+P2*P2p)*Pc+(G1*C1p+C2*C2p+C3*C3p+C4*C4p+C5*C5p)*Cc+(H1*H1p+H2*H2p)*Hc+(D1*D1p+D2*D2p)*Dc。

[0021] 14)步骤13)描述的CS值低于70以下愈伤组织质量较差，分化率不高，也很难进行转基因操作；得分在70-90之间的愈伤组织已经适合分化，可以得到较高的分化率，然而得不到较高的转化率，很难转化成功，得分90分以上的愈伤组织适合农杆菌转化操作，也有最高的分化率。[0022] 使用说明：

[0013]

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说 明 书

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1，在色温：6500度，亮度500lux的光源条件下考察水稻愈伤组织；[0024] 2，对愈伤组织的颗粒指标进行评估，统计细碎颗粒和致密颗粒各占总愈伤组织量的百分比(P1p，P2p)；[0025] 3，对愈伤组织色泽指标进行评估，根据发明内容中的对苍白，黄白，黄，深黄，褐色愈伤的定义，统计出苍白，黄白，黄，深黄，褐色愈伤组织各自占有的百分比(C1p，C2p，C3p，C4p，C5p)；[0026] 4，对愈伤组织的水化指标进行评估，统计水化和未水化的愈伤组织各占有的百分比(H1p，H2p)(一旦一块愈伤组织有任何点有水化趋势，此块愈伤组织算整体具有水化趋势)。

[0027] 5，对愈伤组织的分化指标进行评估，统计出具有分化趋势的愈伤组织和正常愈伤组织各占有的百分比(D1p，D2p)(一旦一块愈伤组织有任何点有分化趋势，此块愈伤组织算整体具有分化趋势)。[0028] 6，愈伤组织质量得分(CS)的计算

[0029] CS＝(P1*P1p+P2*P2p)*Pc+(C1*C1p+C2*C2p+C3*C3p+C4*C4p+C5*C5p)*Cc+(H1*H1p+H2*H2p)*Hc+(D1*D1p+D2*D2p)*Dc[0030] P1，P2，C1，C2，C3，C4，C5，H1，H2，D1，D2各指标的不同状态的得分系数，Pc，Cc，Hc，Dc为各指标的权重系数。

[0031] 本发明提供了一种水稻愈伤组织质量评价模型，主要对愈伤组织质量相关的四个形状进行评估、统计，将愈伤组织的质量进行量化，这样就有利于对愈伤组织的质量进行量化评比，使得我们对培养基的研究更为严谨，方便。附图说明

[0032] 图1：具有分化倾向的愈伤组织。此种愈伤组织不适合继代，分化，转化操作[0033] 图2：优良的愈伤组织。适合转化分化操作。[0034] 图3：籼稻gd-1s的筛选结果。具有较高的转化效率。[0035] 图4：籼稻江-s的筛选结果。具有较高的转化效率[0036] 图5：籼稻94d-2的转基因筛选结果。具有较高的转化效率。[0037] 图6：籼稻71994的转基因筛选结果。转化失败，愈伤组织变褐死亡。[0038] 图7：得分.5的籼稻9311的筛选结果。愈伤组织质量最差农杆菌生长严重。[0039] 图8：得分79.4的籼稻9311愈伤组织筛选结果。愈伤组织质量较差不能转化成功。

[0040] 图9：得分93.6的籼稻9311愈伤组织筛选结果，愈伤组织质量不太理想转化成功率不高。

[0041] 图10：得分97.8的籼稻9311愈伤组织筛选结果。愈伤组织理想状态，转化率最高。

[0042] 图11：深黄色，较松散的愈伤组织切片(松散，色深黄的愈伤组织)。愈伤组织特征有较厚的表层致密层结构黑色箭头所指向，但是在致密成外围往往还有一层非致密层细胞结构红色箭头所指。这种因致密层结构不能接触外源DNA而导致转化活性降低。10倍物镜观察。

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说 明 书

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图12：致密黄色的愈伤组织切片。细胞体积小，细胞质浓，核的体积大(此为10×物镜观察分辨不出)，有明显的外层致密层结构(箭头所示)。10倍物镜观察。[0044] 图13：色泽浅黄的愈伤组织切片。细胞体积较大，细胞质密度低，没有明显的愈伤组织致密外层结构。10倍物镜观察。[0045] 图14：褐化的愈伤组织切片，细胞特征为大的空泡细胞无核，已死亡，细胞间隙有色素沉着箭头所指。10倍物镜观察。[0046] 图15：水化的愈伤组织切片，特征为愈伤组织的顶层致密层结构解离散开，呈弥散状，如箭头所指。10倍物镜观察。[0047] 图16：具有分化趋势的愈伤组织，特征为没有外层致密层结构，愈伤组织团内部有致密团块的形成：箭头所指，这是跟源基的发生处，此种愈伤组织失去继代培养的能力，也因没有表层致密层结构使得失去转化的能力。10倍物镜观察。

具体实施方式

[0048] 实施例1：

[0049] 一种水稻愈伤组织质量评价方法，其步骤是：[0050] 1，在色温：6500度，亮度500lux的光源条件下考察水稻愈伤组织；[0051] 2，对愈伤组织的颗粒指标进行评估，统计细碎颗粒和致密颗粒各占总愈伤组织量的百分比(P1p，P2p)；散碎颗粒所占的比值P1p，致密颗粒所占的比值P2p；P1p+P2p＝1；[0052] 3，对愈伤组织色泽指标进行评估，统计出苍白，黄白，黄，深黄，褐色愈伤组织各自占有的百分比(C1p，C2pC3p，C4p，C5p)；C1p为色泽苍白的愈伤组织所占的比例，C2p为色泽白黄色的愈伤组织所占的比例，C3p为色泽黄色的愈伤组织所占的比例，C4p为色泽深黄色的愈伤组织所占的比例，C1p为色泽褐色的愈伤组织所占的比例。[0053] 4，对愈伤组织的水化指标进行评估，统计水化和未水化的愈伤组织各占有的百分比(H1p，H2p)(一旦一块愈伤组织有任何点有水化趋势，此块愈伤组织算整体具有水化趋势)。

[00] 5，对愈伤组织的分化指标进行评估，统计出具有分化趋势的愈伤组织和正常愈伤组织各占有的百分比(D1p，D2p)(一旦一块愈伤组织有任何点有分化趋势，此块愈伤组织算整体具有分化趋势)。D1p表示有分化趋势的愈伤组织占有的比例，D2p表示没有分化趋势的愈伤组织占有的比例，[0055] 6，愈伤组织质量得分(CS)的计算

[0056] CS＝(P1*P1p+P2*P2p)*Pc+(C1*C1p+C2*C2p+C3*C3p+C4*C4p+C5*C5p)*Cc+(H1*H1p+H2*H2p)*Hc+(D1*D1p+D2*D2p)*Dc(Pc＝15，Cc＝25，Hc＝40，Dc＝20)。[0057] 实施例2：

[0058] 以下为根据模型设计的程序，通过统计颗粒状况，色泽，水化情况，分化状况等指标的值，输入程序，程序根据预设的计算模型算出愈伤组织的得分为98.5

[0059]

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说 明 书

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此愈伤组织的质量较好能够有较高的转化效率和分化效率。愈伤组织特征为：有少许细碎颗粒，颜色黄色，无水化和分化愈伤组织。[0061] 实施例3：

[0062] 统计愈伤组织的颗粒状况，色泽，水化情况，分化状况等指标的值，输入程序，程序根据预设的计算模型算出愈伤组织的得分为74

[0060] [0063]

评价：此愈伤组织的质量不好，很难转化成功，可以进行成功分化但分化效率不

高。愈伤组织特征为：有20％的细碎颗粒，色泽不均匀，有40％的为黄色，30％的为白黄色，10％的为深黄色，而且有少量的愈伤组织出现了水化的现象，愈伤组织总体状态不好。[0065] 实施例4：[0066] 按照实施例2，3的方法和步骤对9311，ya等10种籼稻愈伤组织进行评估[0067] 和转化实验，转化结果和评估得分吻合，数据如下。[0068] 愈伤组织的分和转化效率之间的关系：

[00] [0069]

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说 明 书

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[0070]

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说 明 书

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说明：P1(0.3)P2(0.7)表示颗粒状况中颗粒指标1占30％，颗粒指标2占70；[0072] C2(0.3)C3(0.4)C4(0.1)C5(0.2)色泽指标中色泽指标2占30％，色泽指标3占40％，色泽指标4占10％，色泽指标5占20％；。

[0071]

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说 明 书

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H1(0.2)H2(0.8)分化指标中分化指标1占20％，分化指标2占80％[0074] D2(1)水化指标中水化指标2占100％；[0075] 下面类似的表示其含义以此类推。

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说 明 书 附 图

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图1

图2

图3图4

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说 明 书 附 图

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图5

图6

图7图8

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说 明 书 附 图

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图9

图10

图11

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说 明 书 附 图

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说 明 书 附 图

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