原子力显微镜在植物学研究中的应用

原子力显微镜在植物学研究中的应用

祖元刚＊，张宇亮，刘志国，王延兵，梁慧丽，刘红梅

东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室, 哈尔滨 150040

摘要 原子力显微镜(AFM)是一种探测样品表面信息的有力工具, 它可以在空气和接近样品生理条件下成像, 同时也可以在皮牛(pico-Newton, 10－12 N)至微牛(micro-Newton, 10－6 N)水平上测量力的大小。本文主要介绍了自AFM发明以来, 其在植物大分子、细胞器、细胞、叶片等方面的应用, 并列举了目前AFM存在的几点不足。

关键词 原子力显微镜, 植物, 表面结构, 形貌图

Application of Atomic Force Microscope in Plant

Biology Research

Yuangang Zu*, Yuliang Zhang, Zhiguo Liu, Yanbing Wang, Huili Liang, Hongmei Liu

Key Laboratory of Forest Plant Ecology of Ministry of Education, Northeast Forestry

University, Harbin 150040, China

Abstract Atomic force microscope (AFM) is a powerful tool for high-resolution imaging of the surface ofsamples under air or physiological conditions in measurements ranging from pico-Newtons (10－12 N) to micro-Newtons (10－6 N). In this paper, we discuss the potential application of AFM in plant biology research of, forexample, macromolecules, organelles, cells, and leaves, and summarize the current limitations of the technique.Key words atomic force microscope, plant, surface structure, topography

1986年, Binnig等在扫描隧道显微镜(STM)的基础上发明了世界第一台原子力显微镜(atomic force microscope, AFM) (Binnig et al.,1986)。历经20年的发展, AFM已成为力学显微镜家族中重要的一员, 被广泛地应用于生命科学领域, 充当了人们认识微观世界“眼”(观察表面信息)和“手”(纳米加工和操纵)的双重角色。STM因依靠隧道电流成像, 所以要求样品必须导电。AFM则克服了这一缺点, 制样简单, 不需要任何导电、喷金、包埋和荧光染料染色等繁琐且技术性要求较高的样品处理过程,

节省了大量的时间和经费, 分辨率可以达到1 Å,远高于环境扫描电子显微镜(ESEM), 略高于透射电子显微镜(TEM)。可直接将样品黏附于云母、石墨、硅片和玻片等平整的基底表面进行扫描, 还可以在接近生理条件下成像, 符合生命科学的实验要求。AFM在植物学研究中的应用虽然仅局限在几个方面, 但表现出了独特的优势。目前关于AFM在植物学领域的应用缺少系统的介绍。基于此, 本文结合国内外的研究成果概述介绍AFM及其应用, 希望给从事植物学研究的科研人员在解决实际问题时提供一

收稿日期: 2006-06-13; 接受日期: 2006-08-26

基金项目: 国家重点基础研究发展规划项目(No. 2004CB418505)和教育部重点项目(No. 104191)* Author for correspondence. E-mail: zygorl@public.hr.hl.cn

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些新的思路。１　　AFM简介

AFM是利用光杠杆原理产生的光束偏转技术研制而成的。在一个对形变极为敏感的微悬臂 (cantilever)的一端安装纳米级的针尖, 扫描时样品和针尖存在力的相互作用, 使微悬臂产生形变, 导致从针尖背面反射到四象限检测器的激光束发生微弱变化, 继而产生电压差, 最后将这些电压信号转换为图像。AFM共由偏转检测系统、探针、扫描系统(压电陶瓷)、反馈系统和显示系统五部分组成。用于分析的模式有接触模式(contact mode)和振荡模式(oscillating mode)两种成像模式和一种力模式(force mode)。 使用接触模式进行扫描时, 针尖与样品相互接触, 所成的图像具有较高的分辨率, 通常用来检测样品的物理属性, 由于剪切力的存在, 对样品有一定损伤, 很少用于探测生物样品。振荡模式是靠声学(tapping mode)或磁力(magneticalty)驱动, 针尖和样品只有短暂接触, 作用力较小, 常用于生物样品成像。与前两种模式不同, 力模式不能用于成像, 而是用来测量针尖与样品表面之间相互作用力。探针是AFM的重要部件, 探针的好坏直接决定着实验的成败。探针因生产厂家而异, 主要有Si针尖、Si3N4针尖和最近几年发展起来的碳纳米管针尖(国立秋等, 2003)等几种类型。因为探针的形状、力常数、固有频率等参数不同, 适合的工作范围也不同, 应根据实验需要甄选。至于更详尽的AFM原理国内已有相关介绍(朱杰和孙润广, 2005)。

２　　AFM在植物生物大分子研究中的

应用

2.1 DNA

DNA是生命体的主要遗传物质, 研究它的结构和功能, 有利于了解生命过程中遗传信息的储存和传递过程。Lindsay等(19)率先用

AFM对DNA分子进行了观察。随后, 科研人员对 DNA 的AFM成像进行了大量的研究(Weisenhorn et al., 1990; Hansma et al., 1991)。现在关于DNA的实验日臻完善, 刘志国等(2005)运用了二价阳离子和3-aminopropylt-riethoxysilane (APTES)修饰的云母来固定 DNA分子, 给出了用于DNA 分子成像的合适的 DNA浓度和二价离子浓度, 在不同的APTES修饰云母的方法中, 液相溶液修饰的方法能获得较好的效果; 当使用较高浓度的 DNA 分子成像时, 观察到了 DNA 的网络; 展示了一种简单的伸展长链 DNA 分子的方法; 讨论了最佳的成像条件和AFM的操作技术并对各种固定DNA 的方法进行了比较和评估。更多的理论和应用参见国内有关文献(郑伟民和蔡继业, 2006)。2.2 蛋白质

植物细胞中含有成百上千种蛋白质, 占细胞干重的比例仅次于纤维素, 是植物细胞的重要组成部分。蛋白质通过结构的改变——构象的变化来行使功能, 人们采用很多手段分析蛋白质的结构和功能。而AFM在蛋白质研究中的应用成为电子显微镜(EM)、X射线结晶学(X-ray crystallography)和核磁共振(nuclear mag-netic resonance, NMR)技术的有力补充。

膜蛋白的晶体结构解析是国际公认的难题,而光合作用相关蛋白历来是植物学家们关注的焦点。如2004年, 我国科学家成功解析了菠菜(Spinacia oleracea)主要捕光复合物LH-CⅡ晶体结构, 这项成果引起了国内外学者的普遍关注(Liu et al., 2004)。利用AFM最早实现了对单个光系统Ⅱ颗粒及光系统Ⅱ衍生物的观测(Lyon et al., 1993; Shao et al., 1997)。Kernen 等(1998)采用Langmui-Blodgett (LB) 技术分离捕光复合物, 借助AFM了解到在单分子蛋白质和蛋白质脂质混合膜上存在类似环形的结构。然而Trudel等(2001)利用AFM和近场光学显微镜(SNOM)观察吸附在二氯苯脲膜上的光系统Ⅱ中心复合物(PSⅡ CC)呈圆球状, 推断前人所得

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环形结果的原因可能是由于力过大对样品造成了一定的损伤。ATP合酶为较大的蛋白复合体, 它磷酸化ADP生成ATP。Seelert等(2000)

PIN-a与二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)相互作用的研究结果表明, DPPC单层膜较亮处为液体压缩相(liquid condensed phase, LC), 较暗处为液在25 mmol.L－1 MgCl2、10 mmol.L－1 Tris-HCl、体扩展相(liquid expanded phase, LE), 加入PIN-pH 7.8、室温条件下对菠菜叶绿体ATP合酶亚基Ⅲ低聚物进行AFM成像, 结果表明这种低聚物形状为两种不同外径的圆环, 较窄的为(5.9 ±0.3) nm, 较宽的为(7.4 ± 0.3) nm, 而内径均为(3.5± 0.3) nm, 并且都存在14个亚基。他们又在脂双分子膜片段上重建亚基Ⅲ低聚物, 测得脂双分子层的厚度为(4.1 ± 0.2) nm, 蛋白质的厚度为(7.6 ± 0.2) nm, 低聚物圆环尺寸与以前的实验结果一致(Seelert et al., 2003)。在室温下, 接触模式观察到完整的菠菜叶绿体ATP合酶的最大外径同样为(7.4 ± 0.3) nm, 不完整的ATP合酶为(7.3 ± 0.3) nm, 出现不完整的ATP合酶可能是由于使用SDS凝胶所致(Muller et al., 2001)。水通过脂双层膜所需的活化能大于细胞膜表面的活化能, 由此产生了水通道假说。Fotiadis等(2001)借助扫描透射电子显微镜(STEM)和AFM观察PM28A和PM28C两种水通道蛋白亚型晶体, 发现了两种不同的类型, 一种是P4212对称,晶格矢量为a=b=(9.76±0.06) nm; 一种是紧密堆积的四聚体六方晶格, 晶胞的尺寸规格为a=b=(8.58±0.18) nm。对于其它蛋白质的AFM实验也相继进行。Leite等(2002)在液相下得到了Schizolobium parahyba种子中的胰凝乳蛋白酶抑制剂低聚物的六角形、椭圆形、Z字型、彗星形、金字塔形共5种结构; Bittencourt等(2003)对一种植物胞浆蛋白Enterolobin的分子模型和AFM图像进行比较, 取得一致的结果; 在亲水表面测量玉米醇溶蛋白(zein)高度为40 nm, 粗糙度为6.97 nm; 疏水表面的蛋白高度均一, 粗糙度为1.88 nm(Wang et al., 2004);McIntire等(2005)采用非接触模式分析了六倍体转基因小麦(Triticum aestivum)高分子量麦谷蛋白亚基的结构(high-molecular-weight gluteninsubunits, HMW-GS); 关于嘌呤吲哚蛋白基因

a后LE与LC相发生颠倒, 其中LE相有大量浓厚的网状聚集, LC相出现众多球形凸起(Dubreilet al., 2003)。分子识别力学显微镜(MRFM)是一种特殊的AFM, 应用MRFM对豌豆(Pisumsativum)血凝素 (Pisum sativum lectin, PSL)、甘露醇结合血凝素(mannan-binding lectin, MBL)和麦胚素 (wheat-germ agglutinin, WGA) 3种植物血凝素的识别已获得成功(Klein et al., 2003)。2.3 细胞壁

细胞壁是由多糖、蛋白质、芳香族化合物组成的复合体, 是植物的重要组成部分, 也是区别于动物的特征之一。它主要起支撑作用,同时参与细胞识别、保护植物细胞免受外界

病菌的侵扰等。1665年, 罗伯特.胡克首先用显微镜发现了植物细胞壁的微观结构。随着实验手段的改进, 包括各种染色技术和显微镜技术的发展, 使人们对细胞壁的结构有了进一步的认识。近几年, AFM逐渐应用到细胞壁的相关研究中。

2.3.1 细胞壁多糖 纤维素以微纤丝(microfibril)的形式存在, 光学显微镜无法看到微纤丝的结构。1996年, Kirby 等用AFM分别观察了苹果(Malus pumila)、 荸荠(Eleocharis dulcis)、马铃薯(Solanum tuberosum)和胡萝卜(Daucuscarota) 几种植物软组织细胞壁的超级结构(Kirby et al., 1996)。他们将样品分为冻融和鲜样两组, 测得微纤丝的直径为25 nm。单个细胞壁多糖分子(Morris et al., 1997)、洋葱 (Alliumcepa)和拟南芥初生壁的结构(Davies and Harris,2003)、细胞壁多糖复合物鼠李半乳糖醛酸聚糖(RG-Ⅱ)分子(Perez et al., 2003)的AFM成像相继获得成功; Yan等(2004)对原始细胞壁进行观察, 发现细胞壁表面覆盖一层蜡质, 初生壁和次生壁的纤维素和半纤维素呈网状排列, 木质素

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位于网络表面, 次生壁中有单晶和三晶的纤维素晶体结构存在, 同时对相图(phase)进行了分析。与以往的提取方式不同, Ding和Himmel(2006)直接观察玉米(Zea mays)初生壁微纤丝,提出了纤维网络理论及其合成过程。一些针对细胞壁结构和功能相关的化学、物理处理先后展开。分析纤维素酶对棉花纤维的作用时, AFM图像提供了最直观的证据。CBH I纤维素酶单独作用6小时, 沿微纤丝伸展方向出现明显的缝隙; EGⅡ纤维素酶单独作用6小时, 纤维表面剥落且光滑; EG Ⅱ先作用6小时, 然后CBHⅠ作用6小时, 纤维膨胀且光滑, 无缝隙, 可能是由于吸附EG Ⅱ后影响了CBHⅠ的作用;而CBHⅠ和EGⅡ同时加入作用6小时, 无法辨认出微纤丝的轮廓, 推断两种纤维素酶同时存在时才会使棉花纤维降解(Lee et al., 2000)。Thimm等(2000)对芹菜(Apium graveolens)软组织细胞的研究表明, 在脱水过程中微纤丝的直径增加, 冻干后微纤丝的直径大于空气干燥的直径。Yoshino等(2000)利用AFM观察经过氙气处理过的大麦(Hordeum vulgare)胚芽鞘细胞, 与对照相比, 在空气中经0.1 MPa氙气处理, 细胞壁变得粗糙, 120 nm宽、5 nm高的纤维结构分布于初生壁中; 而在溶液中经0.38 MPa氙气处理后的细胞壁局部粗糙, 局部平滑; 0.48 MPa处理的则变得光滑。经紫外线处理后, 葡萄(Vitisvinifera)细胞壁表面出现了果胶分子链, 证明细胞壁具有抵抗紫外线的能力(Lesniewska et al.,2004)。由黑云杉(Picea mariana) 制成的牛皮纸纸浆样品经过过氧化氢 (H2O2)漂白后, 纤维表面出现球状的木质素分子堆积, 证明了H2O2能够氧化纤维素和木质素两种生物大分子(Poggi et al., 2005)。

2.3.2 木质素 木质素是高度复杂的酚类大分子, 通常与纤维素、细胞壁多糖相结合, 具体结构还不十分清楚(Taiz and Zeiger, 2002)。木质素主要用于抵抗机械胁迫和重力影响。结合功能化AFM和环境扫描电镜技术(ESEM),

Micic等(2001)对于光化学木质素模型化合物作力曲线分析, 表明其中分子不存在主客体的相互作用, 推测这些分子可能在地球表面存在过多紫外线照射的条件下行使功能。他们随后应用SNOM和AFM对木质素模型化合物的物理化学属性和组装形式进行研究(Micic et al.,2004)。Radotic等(2005)通过实验在木质素圆球直径上获得具有3个峰值 (cohesion peaks)的力曲线, 结合ESEM判断可能有水或气体充斥在木质素的亲水和疏水区域, 这种结构可以减少质量, 同时减轻外界环境对细胞的胁迫。2.4 淀粉

淀粉是植物细胞内的主要贮存多糖, 是人类的主要食物来源, 在植物生长期间以淀粉粒形式存在。利用低压扫描电镜(LVSEM)和AFM对小麦和马铃薯淀粉粒表面进行观察, 发现表面

有100~300 nm的凸起, 20~50 nm宽的平面, 而小麦表面凸起较少, 仅有20 nm的平面(Baldwinet al., 1997)。在水稻淀粉粒上则有30 nm左右的颗粒存在, 偶尔伴有支链结构排列(Ohtani etal., 2000)。在空气中干燥后的马铃薯椭圆形淀粉颗粒表面出现不均一的波纹; 烘干的淀粉颗粒出现孔洞; 经过烘干再冰冻处理, 淀粉颗粒表面无变化, 而空气干燥再冰冻后可见到40~70 nm的类似于墙壁的环型凸起, 这种变化在液相下观察烘干的冰冻处理样品更为明显; 而处于潮湿环境中的样品表面有折叠现象(Szymonska et al.,2000)。Nordmark和 Ziegler(2002)对玉米的直链淀粉非球形颗粒进行分析, 发现放射状的晶体片层结构。直链淀粉和支链淀粉的研究显示淀粉表面覆盖15~35 nm宽, 1~4 nm高的凸起(Rindlav-Westling and Gatenholm, 2003)。淀粉粒的超微结构有簇结构和止水塞两种模型。其中止水塞(blocklet)指的是生长环的结晶层与非结晶层中类似球状的结构, 大小和形态因其存在的位置不同有很大的差异, AFM为止水塞模型提供了证据(Gallant et al., 1997; Ridout et al.,2003; Szymonska and Krok, 2003)。

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３　　AFM在植物细胞及亚细胞结构研究中的应用

染色体的结构与功能的研究一直是细胞学和遗传学中的重大课题。Winfield 等(1995)首薄, 可以见到表皮微纤丝结构。van der Wel等(1996)用5%戊二醛固定玉米原生质体, 气相下获得了清晰的AFM图像, 液相下样品易碎导致成像困难, 而未固定的样品则无法成像, 可能是因为扫描时原生质体已经涨破或针尖对原生质次报道了应用AFM观察植物染色体的研究。体有一定的损伤; 他们又将新鲜的长寿花

他们采用常规方法分离小麦染色体, 没有经过染色和喷金处理而直接进行观察, 并测量了染色体表面的高度, 发现C带高135 nm, 且成对存在。Schaper等(2000)将场发射扫描电镜 (FESEM)和AFM联用, 分析有丝时期的大麦染色体形态变化。液相下, AFM图像显示前中期染色表面凝聚, 后期出现染色单体裂隙, 末期着丝粒区域清晰可见; 气相下, 经过蛋白激酶K作用后的染色体表面出现网状结构。其他研究人员利用SNOM与AFM测量经荧光原位杂交 (FISH)处理的大麦染色体的高度和荧光强度, 取得了良好的效果(Ohtani et al., 2002; Yoshino et al., 2002;Fukushi et al., 2003; Shichiri et al., 2003)。Liu等(2003)用2 mol.L－1 NaCl从大麦染色质中提取分子量为4和20 kD的两个非组蛋白后, 由AFM的图像了解到染色质的粗糙度增加, 高度减小,为研究非组蛋白与DNA的关系提供了新思路。通过用15%、30%、45%三种浓度的乙酸处理大麦染色体, 结果表明, 30%浓度处理可以得到清晰的染色体形貌, 为研究染色体有序结构创造了条件(Sugiyama et al., 2004)。在染色体结构中, 着丝粒与其它区域完全不同, 并且这个区域的染色质纤维结合紧密, 不易观察。为了解决这个问题, 引入了一种利用显微操作技术(micromanipulation technique)机械伸长着丝粒的方法, 实现了对着丝粒区域内染色质纤维的成像(Otobe et al., 2002)。

Butt等(1990)首先将AFM用于植物细胞的观察。他们获得了南紫薇(Lagerstroemiasubcostata)的叶片表皮及气孔的图像, 由于表皮较厚, 没能展示200 nm以下的更多细节; 而水生植物香睡莲(Nymphaea odorata)表皮相对较

(Kalanchoe blossfeldiana)和玉米花粉粘在双面胶带上, 直接进行AFM扫描, 所得图像与FESEM一致。邢树平等(2000)将AFM应用到

裸子植物雪松(Cedrus deodara)和水杉(Metasequoia glyptostroboides)花粉外壁结构的研究中, 发现雪松花粉外壁有很多球状和短棒状结构: 而云杉表面则存在许多颗粒状亚单位, 支持了Southworth提出的网络状模型, 即花粉外壁是颗粒状结构在三维空间的一种无方向性的网状连接。扫描Lacandonia schismatica和银杏 (Ginkgo biloba)细胞核的半薄切片分别得到核膜、核孔、染色质、核仁等结构的AFM图像(Jimenez-Garcia and Fragoso-Soriano,2000)。随后研究发现细胞核内存在32 nm左右的颗粒, 推断G期的银杏细胞核为网状, 存在Lacandonia颗粒(Jimenez-Ramirez et al., 2002)。Yamada等(2002)获得了白色体和叶绿体的形貌图, 并在生理缓冲液中测量表面物理弹性。在见光转换为叶绿体之前, 白色体表面比较光滑坚硬, 转换后表面变得粗糙柔软, 白色体的粗糙度为叶绿体的20倍。Gradinaru 等(2004)把AFM和双光子共聚焦显微镜(confocal two-photonfluorescence microscope)组装成多元显微镜(multiplex microscope), 解决了AFM专一性不强、定位与鉴定困难的问题, 也克服了光学显微镜分辨率不高的缺点。他们从新鲜的菠菜叶片中提取叶绿体, 置于多元显微镜上, 观察到未垛叠的叶绿体基粒呈规则的圆形, 直径在200~1 000 nm之间, 同时记录了对应部位的荧光强度。Kirchhoff 等(2004)从形貌图上测量菠菜类囊体内膜脂双层的高度为5.5 nm, 高于PSⅡ三聚体(4.8 nm), 这种差异是由于膜蛋白的存在

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造成的。Fukumoto等(2005)使用显微操作技术分选日本落叶松(Larix leptolepis)原生质体中新形成的纤维, 经AFM测得束状纤丝(fibiril)和亚５　　AFM存在问题及应用展望

AFM发展至今, 已经在很多领域得到了广纤丝(subfibril)直径分别为700和170 nm。泛的应用。同其它技术一样, AFM仍然有许多

Marga 等(2005)通过实验证明细胞壁的伸长导致微纤丝的分离, 符合多网络生长假说(multi-netgrowth hypothesis)。

４　 AFM在植物学其它研究中的应用

植物叶片是感受外界环境变化的敏感器官,以往的研究多是从宏观角度出发。而电镜的样品处理过程在一定程度上破坏了叶片表面的真实形态, AFM的出现使接近活体状态的研究成为可能。对大果越橘(Vacciniummacrocarpon)的观察展示了叶面生境的异质性,和新叶相比, 老叶皱缩, 表面粗糙度增加(Mechaber et al., 1996)。定量分析叶表面疏水结构时, 观察到天南星科植物海芋(Alocasiamacrorrhiza)叶表面具有很多凸起(Wagner et al.,2003)。Perkins等(2005)在研究月桂樱桃(Prunus laurocerasus)叶表面机械及化学属性时, 测量了叶表面的粗糙部分的平均粗糙度为5.6 nm, 平滑部分的粗糙度为1.4 nm。AFM还可以用来做动态分析。Benitez 等(2004b)最早利用AFM对角质的化学合成作了辅助分析, 然后结合红外光谱(FT-IR)描述了角质的分子特征(Benitez et al., 2004a)。根据DLVO理论, Liou等(2002)在人工合成的脂双层膜上获得了磷酸化的图形, 并对磷酸化和去磷酸化动力学特征进行分析; Gunning等(2004)记录了多聚物在分子水平上的吸附和解吸附的过程。Shankar等(2004)观察种子萌芽过程时发现有三角形纳米颗粒形成, 颗粒的厚度为14 nm, 边长440 nm。AFM在低等植物中也有应用, Callow等(2000)通过实验测得缘管浒苔(Enteromorpha linza)糖蛋白黏附力平均为(173 ± 1.7) nN.m－1, 最大为

458 nN.m－1。

地方需要改进。(1)垂直高度, AFM依靠针尖与样品的相互作用成像, 对样品的高度有一定, 如果样品垂直高度超过8~10 µm时成像较难。(2)针尖污染, 在气相下, 存在各种污染物, 针尖极易污染。可以采用扫描粗糙碳膜的方法加以解决; 液相下则无此, 针尖本身振动, 可以自动清除污染。另外加工工艺和仪器自身的改进, 使这种影响逐渐减小。(3)增宽效应, 所谓的增宽效应是指当粒子尺寸比AFM的针尖曲率半径小很多的时候, 由于卷积作用产生的。当扫描2 nm的样品时, 得到的图像可能会超过10 nm。(4)样品的弹性形变, 由于力学显微镜的性质, 在扫描时样品或多或少会产生一定的形变。(5)最大扫描范围, 这个范围一直局限在微米级, 毫米级的扫描头还处在研发阶段。(6)实时成像的, 通常扫描一张图需要几分钟的时间, 对于瞬间的生物化学反应无法捕捉。(7)制样技术仍需改进, 与较硬的固体材料相比, 生物样品的AFM实验技术难度较大, 制样过程中,吸附力通常会导致样品失去活性; 对于活体原位观察, 在液相中进行小范围扫描时, 溶液中的物质容易沉淀, 产生背景干扰颗粒, 因此优化制样方法至关重要。

植物世界蕴含着千差万别的结构, 而对于结构的研究将有助于深入了解其特殊的功能。AFM作为一种表面检测工具, 可以实现这一目标。目前的研究主要集中在光合作用蛋白和细胞壁等几个方面, 仅发挥着“眼”的作用,才刚刚起步, 亟待解决的问题是对各种实验方法进行不断的改进和创新。随着科技的进步,AFM将与其它显微技术及生物技术有机地结合起来, 其应用前景会更为广阔, 并在植物学研

“手”的功能还没有体现。更为深入的研究

714究中发挥更大的作用。参考文献

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(责任编辑: 白羽红)