JOURNALOFANALYTICALSCIENCE2009年4月Apr.2009
文章编号:100626144(2009)0220211203
反相高效液相色谱法测定磷酸果糖激酶的活性
管玉霞31,张洪秀2,邢莉丽1
(1.福州大学生物科学与工程学院,福建福州350002;2.山东省环境保护科学研究设计院,山东济南250013)摘 要:采用反相高效液相法(RP2HPLC)测定磷酸果糖激酶的活性。将磷酸果糖激酶与含有果糖262磷酸和ATP的反应体系混合,置于30℃水浴中,反应20min后,沸水浴3min终止反应。通过RP2HPLC测定酶反应前后产物二磷酸腺苷(ADP)量的变化来分析酶的活性。ADP的生成量在5～400mg/L范围内具有良好的线性关系,方法的精密度良好(RSD<5%)。本方法与通常所用的酶偶联法(ECM)相比准确度高,且简便易行。
关键词:反相高效液相色谱法;磷酸果糖激酶;活性测定中图分类号:O657.7+2 文献标识码:A
磷酸果糖激酶(Phosphofructokinase,PFK,EC2.7.1.11)是糖酵解途径(EMP途径)中的限速酶,它
催化果糖262磷酸和ATP反应生成果糖21,62二磷酸和二磷酸腺苷(ADP)[1]。文献报道的PFK酶活性测定方法主要是酶偶联法[2-4],但这种方法需要通过其它三种酶相偶联,操作复杂,分析成本高。而磷酸果糖激酶ELISA试剂盒也价格不菲,且检测范围有限。
本文利用反相高效液相色谱(RP2HPLC)法对生成物ADP进行检测,通过检测ADP含量的方法来测定PFK的活性,建立了一种简便、快速、准确、廉价的检测PFK活性的新方法。本方法尚未见文献报道。
1 实验部分
1.1 仪器和试剂
BeckmanGoldenSystem高效液相色谱工作站,ABI112A柱恒温和自动进样系统,Eurobond2C18色
谱柱,HH24数显恒温水浴锅。
2,5′2三磷酸腺苷二钠(ATPNa)、2,5′2二磷酸腺苷二钠(ADPNa)购自Amresco公司;D2果糖262磷酸、磷酸果糖激酶(来源于Bacillusstearothermophilus,51U/mgprotein)购自美国Sigma公司;磷酸二氢钾、氢氧化钠、氯化镁、EDTA、Tris为国产分析纯;本实验用水为MilliQ超纯水。1.2 色谱柱条件
色谱柱为Eurobond2C18柱(250×4.6mm,5μm);流动相是50mmol/L的磷酸钾缓冲液(pH6.5);流速0.7mL/min;柱温为室温;检测波长254nm;进样量20μL。1.3 实验方法
1.3.1 分离效果 在上述色谱条件下以ATP、ADP混合标准品溶液进样进行色谱分析。
1.3.2 精密度试验 在日内将0.10mg/mL的ADP、0.12mg/mL的ATP标准溶液每隔30min进样1
次,每次20μL,平行测定5次,得日内误差;在不同日将0.10mg/mL的ADP、0.12mg/mL的ATP标准溶液每天同一时间进样1次,每次20μL,连续测定5d,得日间误差。
1.3.3 酶活性测定 测定体系参照文献[5],并加以改进:50mmol/LTris2HCl,pH8.0;5mmol/L
收稿日期:2008204216 修回日期:2008209219
3
通讯联系人:管玉霞,女,博士,硕士研究生导师,从事生化与微生物制药研究.
211
第2期管玉霞等:反相高效液相色谱法测定磷酸果糖激酶的活性第25卷
MgCl2,1mmol/LEDTA,1mmol/L果糖262磷酸(F262P),0.2mmol/LATP,加酶启动反应,总体积1mL。置于30℃水浴中,反应20min后,沸水浴3min终止反应。
2 结果与讨论
2.1 ATP、ADP分离效果
在探索能将ATP和ADP在短时间内达到较好分离效果的方法中,流动相的选择较为重要,先后试验了浓度由50～220mmol/L、pH5.8～7.0的磷酸盐缓冲液,并在其中添加了不同比例的甲醇。结果发现样品对有机溶剂比较敏感,含有甲醇时流动相极性变小,ATP、ADP的保留时间接近而得不到理想分离,故流动相中不含有机溶剂。缓冲液pH对二者的分离影响较大,pH<6.0时,ATP和ADP不能分开;pH>6.8时,二者的峰ADP标准品混合物色谱图
形有拖尾现象,因此选用pH为6.5。当缓冲液浓度较图1 ATP、
Fig.1 RP2HPLCChromatogramsofATPandADP
大时,组分的保留时间随之延长。于是,选用50mmol/mixtureL的磷酸钾缓冲液(pH6.5)做为洗脱的流动相,效果理想。取20μLATP、ADP混合标准品溶液进行色谱分析,其色谱图如图1。
2.2 ADP的工作曲线与检出限
配制一系列浓度的ADP标准溶液(0.005、0.050、0.100、0.200、0.400mg/mL),按照所建立的方法处理后进行分析。记录ADP的峰面积,以峰面积对浓度进行线性回归得回归方程,以信噪比S/N=3计算检出限。每一个浓度水平的标准液各进样3次。计算得ADP的线性回归方程为:y=47644x+206.89,相关系数为0.9994,在5～400mg/L范围内具有良好的线性关系,检出限为16ng。2.3 精密度试验
对0.1mg/mL的ADP和0.12mg/mL的ATP分别进行日内、日间精密度测定,结果见表1。
表1 ADP、ATP精密度试验结果(n=5)
Table1 PrecisionofADPandATP(n=5)
Added
(mg/mL)
ADPATP
0.100.12
Intra2day
Peakarea
-(×106, x±S)4.8895±0.09135.3904±0.0976
RSD
(%)1.871.81
Inter2day
Peakarea
-(×106, x±S)4.8892±0.12355.3902±0.1242
RSD
(%)2.532.30
2.4 酶促反应时间的确定
恒定酶量为4μg,在不同时间终止反应,取样检测结果如图2所示。由图2可知,PFK活力反应时间在20min以前。从酶促反应开始,随着保温时间的延长,PFK的活性呈线性上升;而20min后,酶活力基本稳定,说明酶促反应已完成,处于稳定状态,故选用保温20min作为PFK活力测定的保温时间。2.5 酶促反应中PFK酶量的测定
分别在相同的反应体系中加入不同量的酶,30℃孵育20min,反应终止后,取样检测,结果显示,随着酶量的增加,PFK活性呈线性的趋势增强。酶的活性(y)与酶量(x)的线
图2 酶促反应时间与酶活性的关系
Fig.2 Theincubationtimevsactivityofenzyme
性方程为:y=0.0437x+0.0159,相关系数为0.9992。2.6 RP2HPLC与酶偶联法的比较
用RP2HPLC检测方法和酶偶联法对同一样品(2μgPFK)进行酶活测定,结果见表2。由表2可知,
212
第2期分析科学学报第25卷
RP2HPLC检测结果为0.0972U/2μg,即48.6U/mg;酶偶联法(ECM)的检测结果为0.0966U/2μg,即48.3U/mg。RP2HPLC的相对误差为4.71%,酶偶联法的相对误差为5.29%。RP2HPLC较普通的酶
偶联法(ECM)误差小,更准确。两种方法测定PFK酶活结果较标准低,分析其原因可能是酶在运输或保藏的过程中失去了部分活力,或检测过程中的误差等。但两种检测方法结果相近,而RP2HPLC法检测结果比酶偶联法(ECM)更准确,故RP2HPLC测定PFK活性可靠,体现了其优势。
表2 两种方法测定PFK结果的比较
Table2 ComparisonofPFKresultdeterminedbytwomethods
Sample
12345RP2HPLC(U/2μg)
0.0990.0970.0970.0950.099ECM(U/2μg)
0.0960.0970.0950.0970.098Sample678910RP2HPLC(U/2μg)
0.0960.0980.0940.0990.098ECM(U/2μg)
0.0960.0980.0990.0960.094RP2HPLC法在酶反应终止后15min内即可检测出PFK活性,可消除因ATP、ADP不稳定造成的
影响。RP2HPLC法与酶偶联法和ELISA相比成本低、原料获取方便、效率高,简便易行。因此,RP2HPLC法检测PFK活性是一种样品使用量少、低成本,更准确、更便捷的测定方法。反相高效液相色谱法(RP2HPLC)测定磷酸果糖激酶的活性可应用于医疗、生理、生化等研究中,特别是应用于微生物代谢控制发酵研究中,具有重要意义。
参考文献:
[1] WANGJing2yan(王镜岩),ZHUSheng2geng(朱圣庚),XUChang2fa(徐长法).Biochemistry,3rdEd.(生物化学(第三
版))[M].ThelastVolume(下册):2002:71.
[2] KotlarzD,BucH.EnzymologyMethods[M].1982,90:60.
[3] ThrasherJamesR,CooperMorrisD,DunawayGeorgeA.JournalofBiologicalChemistry[J],1981,256(15):7844.[4] TuiningaJudithE,VerheesCorneH,JohnvanderOost,KengenServeWM,StamsAlfonsJM,deVosWillemM.
JournalofBiologicalChemistry[J],1999,274(30):21023.
[5] WANGYue2hao(王岳浩).TheExperimentalManualinModernPlantPhysiology(现代植物生理学实验指南)[M].
2004:186.
DeterminationofPhosphofructokinaseActivitybyReversed2PhaseHighPerformanceLiquidChromatography
GUANYu2xia31,ZHANGHong2xiu2,XINGLi2li1
(1.CollegeofBiologicalScienceandTechnology,FuzhouUniversity,Fuzhou
350002;2.AcademyofEnvironmentalScience,Jinan250013)
Abstract:Phosphofructokinase(PFK,EC2.7.1.11)activitywasdeterminedbyreversed2phasehighperformanceliquidchromatography(RP2PHLC)inthispaper.AfterPFK,Fructo262phosphoandATPweremixedinthereactionsystem,themixturewasincubatedat30℃for30min,andthereactionwasstoppedintheboilingwaterfor3min.ThequantityofproductADPbeforeandafterreactionwhichwasdeterminedbyRP2PHLCwasdependentonthePFKactivity.TheproductADPhadgoodlinearrelationshipat5～400mg/Lwithagoodprecision(RSD<5%).RP2PHLCwasmoreaccuratthantheconventionalenzymecouplingmethod(ECM),anditsoperationwasmoreconvenient.
Keywords:Reversed2phasehighperformanceliquidchromatography;Phosphofructokinase;Activityde2termination
213
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容