CAR慢病毒包装

1）在10cm培养皿中培养293T细胞,培养基为：DMEM高糖培养基+10％FBS（胎牛血清）+1%双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液）；

2）待150mm培养皿中的293T细胞密度达80-90%时，更换培养基：DMEM高糖培养基+1％FBS+1%双抗;

3）更换培养基培养2-6小时后,用PEI分别将pWPXLd—CAR-EGFP质粒或空白对照质粒pWPXLd—EGFP分别与慢病毒包装辅助质粒pMD2。G、psPAX2共同转导入293T细胞，加入试剂及剂量如下:

试剂 pWPXLd—CAR-EGFP六种质粒或对照质粒pWPXLd—GFP pMD2.G辅助质粒 psPAX2 PEI 3μg 12μg 72μg 剂量 9μg 4）分别于转化后24、48和72小时，收集培养基上清，并加入新鲜培养基（DMEM高糖培养基+1%FBS+1%双抗)；

5)培养基上清收集完毕，将上清2500g离心0.5小时后（可选步骤）；

6）取离心上清，用0.45um过滤器过滤后，备用. T细胞激活和CAR慢病毒感染 1）T细胞的分离纯化：通过Ficoll密度梯度法分离出血液中的单个核细胞，经红细胞裂解液裂解去除红细胞后，再通过MACS Pan—T磁珠分选出T细胞；

2）分选出来的T细胞用培养基(10培养基+10％FBS+青霉素100U/ml+链霉素0。1mg/ml）稀释至细胞浓度2。5×106个/ml待用；

3)通过包被CD2、CD3、CD28抗体的磁珠(产品来源：德国美天旎）刺激T细胞,即包被磁珠与T细胞以1：2比例混合,T细胞最终密度应为5×106个/ml/cm2.混合后，置于37℃、5％ CO2培养箱培养刺激48小时。

4）慢病毒转染T细胞：将激活的T细胞—磁珠混合液中的磁珠通过磁场作用去除，300g离心5min，去上清，用新鲜培养基重悬,分别加入表达CAR和GFP（空白对照）慢病毒后,加入8μg/ml的polybrene和300IU/ml IL-2。置于37℃，5％ CO2培养箱培养24h后，300g离心5min，去上清，用含300IU/ml IL—2的新鲜培养基重悬，即得过表达CAR质粒的T细胞。