(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 107118763 A(43)申请公布日 2017.09.01
(21)申请号 201710359143.5(22)申请日 2017.05.19
(71)申请人 浙江工业大学
地址 310014 浙江省杭州市下城区潮王路
18号(72)发明人 汪晶 彭晓 陈爱民 胡军 (74)专利代理机构 杭州天正专利事务所有限公
司 33201
代理人 黄美娟 李世玉(51)Int.Cl.
C09K 11/54(2006.01)C01B 19/04(2006.01)G01N 21/64(2006.01)
权利要求书2页 说明书6页 附图3页
(54)发明名称
一种双发射比率型荧光探针及其制备与应用
(57)摘要
本发明公开了一种双发射比率型荧光探针及其制备与应用，所述荧光探针以绿色量子点为核心并包埋于二氧化硅纳米微球中，再对二氧化硅纳米微球表面进行氨基化修饰，然后再在氨基化修饰后的表面共价偶联上红色量子点，得到该比率荧光探针。本发明比率荧光探针用来检测抗坏血酸，具有很好的特异性。并且稳定性好、制备简单、价格便宜等优点，对抗坏血酸的检出限低至45nM，对快速可视化检测提供了方便。
CN 107118763 ACN 107118763 A
权 利 要 求 书
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1.一种双发射比率型荧光探针，其特征在于所述荧光探针以绿色量子点为核心并包埋于二氧化硅纳米微球中，再对二氧化硅纳米微球表面进行氨基化修饰，然后在氨基化修饰后的表面共价偶联上红色量子点，得到双发射比率型荧光探针；所述绿色量子点为硒化镉量子点，所述红色量子点为谷胱甘肽修饰的碲化镉量子点。
2.如权利要求1所述双发射比率型荧光探针，其特征在于包埋绿色量子点后表面氨基化的二氧化硅纳米微球的粒径为40～100nm。
3.如权利要求1所述双发射比率型荧光探针，其特征在于二氧化硅纳米微球包埋绿色量子点并在表面进行氨基化修饰的方法为：将绿色量子点分散于乙醇中，5～45℃搅拌5～30min，形成均一混合液；所述乙醇体积用量以绿色量子点重量计为10-80ml/mg；将氨水，正硅酸四乙酯加入混合液中，5～45℃搅拌12h；接着加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，5～45℃搅拌12h；离心，沉淀依次用无水乙醇、去离子水洗涤1～2次，得到包埋绿色量子点的表面氨基化修饰的二氧化硅纳米微球；所述氨水体积用量以绿色量子点重量计为0.1-1ml/mg；所述正硅酸四乙酯体积用量以绿色量子点重量计为0.1～1ml/mg；所述3-氨丙基三乙氧基硅烷体积用量以绿色量子点重量计为0.05-0.5ml/mg。
4.如权利要求1所述双发射比率型荧光探针，其特征在于所述红色量子点偶联的方法为：将红色量子点分散到去离子水中形成分散液，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，5-45℃黑暗搅拌活化10～30min，加入包埋绿色量子点的表面氨基化修饰的二氧化硅纳米微球，5-45℃黑暗搅拌8～12个小时，离心，沉淀用去离子水洗涤，获得所述双发射比率型荧光探针；所述红色量子点与包埋绿色量子点的表面氨基化修饰的二氧化硅纳米微球质量比为1:1-20，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与红色量子点的质量比20-200:1。
5.一种权利要求1所述双发射比率型荧光探针的制备方法，其特征在于所述方法为：(1)将绿色量子点分散于乙醇中，5～45℃搅拌5～30min，形成均一混合液；所述乙醇体积用量以绿色量子点重量计为10-80ml/mg；(2)将氨水，正硅酸四乙酯加入步骤(1)混合液中，5～45℃搅拌12h；接着加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，5～45℃搅拌12h；离心，沉淀依次用无水乙醇、去离子水洗涤1～2次，得到包埋绿色量子点的表面氨基化修饰的二氧化硅纳米微球；所述氨水体积用量以绿色量子点重量计为0.1-1ml/mg；所述正硅酸四乙酯体积用量以绿色量子点重量计为0.1-1ml/mg；所述3-氨丙基三乙氧基硅烷体积用量以绿色量子点重量计为0.05-0.5ml/mg；(3)将红色量子点分散到去离子水中形成分散液，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，5-45℃黑暗搅拌活化10～30min，加入步骤(2)制备的包埋绿色量子点的表面氨基化修饰的二氧化硅纳米微球，5-45℃黑暗搅拌8～12个小时，离心，沉淀用去离子水洗涤，获得所述双发射比率型荧光探针；所述红色量子点与包埋绿色量子点的表面氨基化修饰的二氧化硅纳米微球质量比为1:1-20，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与红色量子点的质量比20-200:1。
6.如权利要求5所述双发射比率型荧光探针的制备方法，其特征在于步骤(1)所述所述乙醇体积用量以绿色量子点重量计为15-40ml/mg。
7.如权利要求5所述双发射比率型荧光探针的制备方法，其特征在于所述氨水体积用量以绿色量子点重量计为0.25-0.5ml/mg；所述正硅酸四乙酯体积用量以绿色量子点重量计为0.25-0.5ml/mg；所述3-氨丙基三乙氧基硅烷体积用量以绿色量子点重量计为0.05-2
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0.2ml/mg。
8.如权利要求5所述双发射比率型荧光探针的制备方法，其特征在于步骤(3)所述红色量子点与包埋绿色量子点的二氧化硅纳米微球质量比为1:3-10，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与红色量子点的质量比20-50:1。
9.一种权利要求1所述双发射比率型荧光探针在检测抗坏血酸中的应用。
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说 明 书
一种双发射比率型荧光探针及其制备与应用
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(一)技术领域
[0001]本发明涉及一种针对抗坏血酸检测的快速可视化比率荧光探针的制备与检测方法。
(二)背景技术
[0002]抗坏血酸即维生素C，是生命体中重要的抗氧化剂、辅酶因子及神经传递素相关酶的组成成分，其在细胞的电子传递过程中起着重要的作用。由于可以治愈因缺乏维生素会造成坏血病，所以命名为抗坏血酸，它主要来源新鲜水果和蔬菜，是高等灵长类动物与其他少数生物的必需营养素，由于抗坏血酸在常态下不稳定，具有生理功能，还原型和氧化型都有生理活性。[0003]目前，抗坏血酸的测定方法主要有电化学法、气相色谱法和高效液相色谱法等。这些方法具有前处理繁琐、分析时间较长等不足。因此，建立简单、快速、灵敏的抗坏血酸检测新方法逐渐引起人们的关注并成为研究重点。[0004]近年来，量子点作为一种新型荧光探针，引起多个研究领域的广泛关注。采用荧光的方法来检测重抗坏血酸具有简单方便、灵敏度高、响应时间短等优点，常常用于快速可视化检测。然而，目前大多数的荧光探针只用单一的化学信号来进行检测，检测时，容易受到入射光、探针浓度以及环境变化的影响，而造成结果失真，灵敏度下降。近年来，科学工作者们发展了比率型探针。比率探针拥有两个互相独立的信号，既提高了灵敏度，又实现了自我矫正和可视化识别分析物的功能。有机染料和量子点常常用来提供比率探针的荧光信号，相比于有机染料，量子点具有量子效率高、耐光性好、发射光谱窄而对称、吸收光谱宽、尺寸可控等优点。因此，在过去的几年中，基于量子点的比率探针得到了较快的发展，并常用于检测金属离子，有机分子等。[0005]截止目前，检测抗坏血酸的专利已有很多，如中国专利(CN102375008A)，该方法是采用电化学传感器来检测抗坏血酸，但该检出限为4.3μM，还是不能检测痕量抗坏血酸。针对以上问题，我们研究了一种利用半导体量子点荧光探针检测高锰酸钾和抗坏血酸的新方法，该方法操作简单、检测快速且灵敏度高，能进行溶液中高猛酸钾和抗坏血酸的高灵敏识别。
(三)发明内容
[0006]本发明目的是克服目前检测抗坏血酸探针的不足，提供一种制备简单，成本低廉，检测方便，选择性较好的检测抗坏血酸的比率荧光探针，实现对抗坏血酸的选择性、快速、可视化检测。
[0007]本发明采用的技术方案是：
[0008]本发明提供一种双发射比率型荧光探针，所述荧光探针以绿色量子点为核心并包埋于二氧化硅纳米微球中，再对二氧化硅纳米微球表面进行氨基化修饰(即获得包埋绿色量子点的表面氨基化的二氧化硅纳米微球)，然后再在氨基化修饰后的二氧化硅纳米微球
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表面共价偶联上红色量子点，得到双发射比率型荧光探针；所述绿色量子点为硒化镉量子点，所述红色量子点为谷胱甘肽修饰的碲化镉量子点。[0009]进一步，优选所述包埋绿色量子点后表面氨基化的二氧化硅纳米微球的粒径为40-100nm，优选40～60nm。[0010]进一步，所述绿色量子点包埋于二氧化硅纳米微球中并在二氧化硅纳米微球表面进行氨基化修饰的方法为：将绿色量子点分散于乙醇中，5～45℃(优选20℃)搅拌5～30min，形成均一混合液；所述乙醇体积用量以绿色量子点重量计为10-80ml/mg，优选15-40ml/mg；将氨水(质量浓度25-28％)，正硅酸四乙酯加入混合液中，5～45℃(优选20℃)搅拌12h；接着加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，5～45℃(优选20℃)搅拌12h；离心，沉淀依次用无水乙醇、去离子水洗涤1～2次，得到包埋绿色量子点的表面氨基化修饰的二氧化硅纳米微球；所述氨水体积用量以绿色量子点重量计为0.1-1ml/mg，优选0.25-0.5ml/mg；所述正硅酸四乙酯体积用量以绿色量子点重量计为0.1-1ml/mg，优选0.25-0.5ml/mg；所述3-氨丙基三乙氧基硅烷体积用量以绿色量子点重量计为0.05-0.5ml/mg，优选0.05-0.2ml/mg。[0011]进一步，所述红色量子点偶联的方法为：将红色量子点分散到去离子水中形成分散液，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，5-45℃(优选20-25℃)黑暗搅拌活化10～30min，加入包埋绿色量子点的表面氨基化修饰的二氧化硅纳米微球，5-45℃(优选20-25℃)黑暗搅拌8～12个小时，离心，沉淀用去离子水洗涤，获得所述双发射比率型荧光探针；所述红色量子点与包埋绿色量子点的表面氨基化修饰的二氧化硅纳米微球质量比为1:1-20，优选1：3～10，所述EDC与红色量子点的质量比20-200:1，优选50-150：1，更优选20-30:1；所述分散液中去离子水用量以红色量子点重量计为1-10ml/mg，优选1-3ml/mg。[0012]本发明还提供一种双发射比率型荧光探针的制备方法，所述方法为：(1)将绿色量子点分散于乙醇中，5～45℃搅拌5～30min，形成均一混合液；所述乙醇体积用量以绿色量子点重量计为10-80ml/mg；(2)将氨水(质量浓度25-28％)，正硅酸四乙酯加入步骤(1)混合液中，5～45℃搅拌12h；接着加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，5～45℃搅拌12h；离心，沉淀依次用无水乙醇、去离子水洗涤1～2次，得到包埋绿色量子点的表面氨基化修饰的二氧化硅纳米微球；所述氨水体积用量以绿色量子点重量计为0.1-1ml/mg；所述正硅酸四乙酯体积用量以绿色量子点重量计为0.1-1ml/mg；所述3-氨丙基三乙氧基硅烷体积用量以绿色量子点重量计为0.05-0.5ml/mg；(3)将红色量子点分散到去离子水中形成分散液，加入EDC，5-45℃黑暗搅拌活化10～30min，加入步骤(2)制备的包埋绿色量子点的表面氨基化修饰的二氧化硅纳米微球，5-45℃黑暗搅拌8～12个小时，离心，沉淀用去离子水洗涤，获得所述双发射比率型荧光探针；所述红色量子点与包埋绿色量子点的表面氨基化修饰的二氧化硅纳米微球质量比为1:1-20，所述EDC与红色量子点的质量比为20-200：1；所述分散液中去离子水用量以红色量子点重量计为1-10ml/mg，优选1-3ml/mg。[0013]进一步，步骤(1)所述所述乙醇体积用量以绿色量子点重量计为15-40ml/mg。[0014]进一步，所述氨水体积用量以绿色量子点重量计为0.25-0.5ml/mg；所述正硅酸四乙酯体积用量以绿色量子点重量计为0.25-0.5ml/mg；所述3-氨丙基三乙氧基硅烷体积用量以绿色量子点重量计为0.05-0.2ml/mg。[0015]进一步，步骤(3)所述红色量子点与包埋绿色量子点的二氧化硅纳米微球质量比为1:3-10，所述EDC与红色量子点的质量比为20-50：1。
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此外，本发明还提供一种所述双发射比率型荧光探针在检测抗坏血酸中的应用。
具体方法为：150μL浓度区间0～0.2g/ml的比例探针，pH为7.4的磷酸盐缓冲液150μL加入取样管中，加入一定浓度的高锰酸钾溶液静置后，加入含有浓度0～30μM的抗坏血酸的水样，最后用去离子水稀释到2mL，10分钟后在与上述相同的检测条件下进行荧光测试。[0017]为了进一步探究本发明所述比率荧光探针在检测中的选择性，我们在探针的分散液中加入一系列的金属离子和生物分子，包括Na+，Mg2+，Ca2+，K+，柠檬酸，尿素，色氨酸，组氨酸，多巴胺，葡萄糖，并进行荧光光谱检测，相比之下，Na+，Mg2+，Ca2+，尿素，色氨酸，多巴胺，葡萄糖，对荧光基本无影响，K+，柠檬酸，组氨酸还会造成荧光的猝灭，荧光颜色变成浅绿色。因此，我们合成的比率探针可以很好地选择性地检测Cd2+。[0018]与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：[0019]1、利用stober方法制备绿光发射的包埋量子点的二氧化硅纳米粒子，相比反相微乳法，合成用时短，且不需要正己烷，异丙醇等有机液体，既节约试剂，又能保护环境，是一种绿色合成方法。[0020]2、相比其它的比率探针，本探针在检测时，具有相当优秀的特异性。并且稳定性好、制备简单、价格便宜等优点，而且大大缩短了反应时间，对抗坏血酸的检测低至50nM，对快速可视化检测提供了方便。
(四)附图说明
[0021]图1为实施例1中绿光发射的包埋量子点的表面氨基化修饰的二氧化硅纳米微球的TEM图。
[0022]图2为实施例1中比率探针的TEM图。[0023]图3为实施1中a，b，c分别为绿色量子点，绿光发射的包埋量子点的表面氨基化修饰的二氧化硅纳米微球，红色量子点的荧光光谱图。
[0024]图4为实施例4中365nm紫外灯下相应的荧光照片，从左至右抗坏血酸浓度依次为0、0.1、0.3、0.8、1.2、1.6、2、3、4、5、6、7μM。[0025]图5为实施例4中探针的荧光光谱图。
[0026]图6为实施例6中365nm紫外灯下相应的荧光照片，从左至右依次为空白、抗坏血酸，Na+，Mg2+，Ca2+，K+，柠檬酸，尿素，色氨酸，组氨酸，多巴胺，葡萄糖，其中，抗坏血酸的浓度为7μM，其他物质的浓度依次是抗坏血酸的7000，70，140，1400，20，1400，36，14，14，2000倍。[0027]图7为实施例6中各物质对荧光恢复的柱状图。
(五)具体实施方式
[0028]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
[0029]本发明实施例氨水指质量浓度25-28％氨水。[0030]实施例1：[0031]1、绿色量子点的制备
[0032]将三口烧瓶中加入50mL去离子水，并开启搅拌，依次加入0.80mL浓度为0.20M的CdCl2水溶液，72.5mg六偏磷酸钠(SHMP，0.12mmol)和34.6μL3-巯基丙酸(MPA，0.32μmol)。
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接着用1.0M的NaOH水溶液将pH调至9.0，然后加入0.80mL浓度为0.020M的Na2SeO3水溶液，在100℃条件下回流10分钟后，加入3.70mL水合肼(N2H4·H2O，0.072mol)，继续回流9h后，停止加热，得到绿色荧光的CdSe量子点溶液(即绿色量子点溶液)，发射峰在511纳米，浓度为9.21×10-6mol/L。
[0033]取10mLCdSe量子点溶液，加入10mL无水乙醇，静置沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤1～2次，获得固相硒化镉量子点(CdSe，粒径3-5nm)2mg，即绿色量子点，荧光光谱图见图3中曲线a。[0034]2、包埋绿色量子点的二氧化硅纳米粒子
[0035]将上述所得绿色量子点2mg分散于40ml乙醇中，20℃搅拌10min，形成均一混合液；将氨水0.5ml，正硅酸四乙酯0.5ml加入混合液中，20℃搅拌12h；接着加入3-氨丙基三乙氧基硅烷100μL，20℃搅拌12h；离心，沉淀依次用无水乙醇、去离子水洗涤1～2次，得到包埋绿色量子点的表面氨基修饰的二氧化硅纳米微球(即CdSe@SiO2-NH2)0.045g，粒径40～60nm(形貌TEM图见图1，荧光光谱图见图3中曲线b)。将CdSe@SiO2-NH2分散在去离子水中，备用。[0036]3、红色量子点的制备[0037]将0.8ml、0.2M的氯化镉(CdCl2)水溶液加入到25ml的去离子水中，并开启搅拌；随后依次加入柠檬酸钠0.1g(0.34mmol)，谷胱甘肽0.05g(0.16mmol)，0.5ml、0.02M的亚碲酸钠水溶液，硼氢化钠0.05g(1.32mmol)，加热回流10h后，得到发射红色荧光的谷胱甘肽修饰的碲化镉(CdTe)量子点溶液(即谷胱甘肽修饰的红色量子点溶液)，荧光光谱图见图3中曲线c，发射峰在616纳米，浓度为4.98×10-6mol/L。[0038]4、比率荧光探针的制备
[0039]将步骤3制备的谷胱甘肽修饰的CdTe量子点溶液离心，取沉淀(即谷胱甘肽修饰的CdTe量子点)0.8mg，加入20mg EDC，再加入去离子水2ml，25℃黑暗下搅拌30min，接着加入步骤2制备的包埋绿色量子点的表面氨基化修饰的二氧化硅纳米微球3mg，在25℃黑暗条件下搅拌8h。反应结束后，离心，取沉淀并用去离子水洗涤3次，除去多余的量子点，得到CdSe@SiO2@CdTe比率探针固体9mg，加入9ml去离子水，得1mg/ml的CdSe@SiO2@CdTe比率探针分散液，365nm紫外灯下，荧光呈红色(形貌图见图2)。最后将得到的CdSe@SiO2@CdTe比率探针分散液保存在4℃的冰箱中，备用。[0040]实施例2：[0041]1、绿色量子点的制备
[0042]将三口烧瓶中加入25mL去离子水，并开启搅拌，依次加入0.40mL浓度为0.20M的CdCl2水溶液，36.5mg(0.06mmol)六偏磷酸钠(SHMP)和17.5μL(0.16μmol)MPA。接着用1.0M的NaOH水溶液将pH调至9.0，然后加入0.40mL浓度为0.020M的Na2SeO3水溶液，在100℃条件下回流10分钟后，加入1.85mL(0.036mol)水合肼(N2H4·H2O)，继续回流9h后，停止加热，得到绿色荧光的CdSe量子点溶液，发射峰在511纳米，浓度为9.21×10-6mol/L。[0043]取10mL绿色量子点溶液，加入10mL无水乙醇，静置沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤1～2次，获得固相碲化镉量子点2mg。[0044]2、包埋绿色量子点的二氧化硅纳米粒子
[0045]将上述所得2mg绿色量子点分散于40ml乙醇中，20℃搅拌30min，形成均一混合液；将氨水0.5ml，正硅酸四乙酯0.5ml加入混合液中，20℃搅拌12h；接着加入3-氨丙基三乙氧
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基硅烷100μL，20℃搅拌12h；离心，沉淀依次用无水乙醇、去离子水洗涤1～2次，得到包埋绿色量子点的表面氨基化修饰的二氧化硅纳米微球(即CdSe@SiO2-NH2)0.045g，粒径40～60nm，分散在去离子水中，备用。[0046]3、红色量子点的制备
[0047]谷胱甘肽修饰的CdTe量子点溶液制备同实施例1。[0048]4、比率荧光探针的制备
[0049]将步骤3制备的谷胱甘肽修饰的CdTe量子点溶液离心，取沉淀(即谷胱甘肽修饰的CdTe量子点)1mg，加入25mgEDC和2ml去离子水，20℃黑暗下搅拌20min，接着加入3mg步骤2制备的包埋绿色量子点的表面氨基化修饰的二氧化硅纳米微球，在20℃黑暗条件下搅拌10h。反应结束后，离心，取沉淀并用去离子水洗涤3次，除去多余的量子点，取沉淀(即CdSe@SiO2@CdTe比率探针)1mg加入去离子水1ml，得到1mg/ml的CdSe@SiO2@CdTe比率探针分散液，365nm紫外灯下，荧光呈红色。最后将得到的CdSe@SiO2@CdTe比率探针分散液保存在4℃的冰箱中，备用。[0050]实施例3[0051]1、绿色量子点的制备
[0052]固相碲化镉量子点(即绿色量子点)的制备同实施例1。[0053]2、包埋绿色量子点的二氧化硅纳米粒子[0054]将上述1mg绿色量子点分散于20ml乙醇中，20℃搅拌10min，形成均一混合液；将氨水0.25ml，正硅酸四乙酯0.25ml加入混合液中，20℃搅拌12h；接着加入3-氨丙基三乙氧基硅烷50μL，20℃搅拌12h；离心，沉淀依次用无水乙醇、去离子水洗涤1～2次，得到包埋绿色量子点的表面氨基化修饰的二氧化硅纳米微球(即CdSe@SiO2-NH2)0.02g，粒径40～60nm，分散在去离子水中，备用。[0055]3、红色量子点的制备
[0056]谷胱甘肽修饰的红色(CdTe)量子点溶液的制备同实施例1。[0057]4、比率荧光探针的制备
[0058]取谷胱甘肽修饰的CdTe量子点溶液离心，取沉淀(谷胱甘肽修饰的CdTe量子点)1.5mg，加入2ml去离子水和30mgEDC，20℃黑暗下搅拌30min，接着加入步骤2制备的包埋绿色量子点的表面氨基化修饰的二氧化硅纳米微球5mg，在20℃、黑暗条件下搅拌8h。反应结束后，离心，取沉淀并用去离子水洗涤3次，除去多余的量子点，取1mg沉淀(CdSe@SiO2@CdTe比率探针)加入1ml去离子水中得到1mg/ml的CdSe@SiO2@CdTe比率探针分散液，365nm紫外灯下，荧光呈红色。最后将得到的CdSe@SiO2@CdT比率探针分散液保存在4℃的冰箱中，备用。
[0059]实施例4：缓冲液中抗坏血酸的检测[0060]取样管12支，分别加入150μL浓度为1mg/mL的实施例1制备的比率探针分散液，150μL浓度为100mM、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液，以及210μM浓度为0.1mM的高锰酸钾水溶液，接着加入不同终浓度的抗坏血酸(0、0.1、0.3、0.8、1.2、1.6、2、3、4、5、6、7μM)，最后用去离子水稀释到3mL，并摇匀。10分钟后将混合液转移到4mL比色皿中进行荧光检测，根据取样管中颜色的对比，可以判断不同取样管中抗坏血酸的浓度，抗坏血酸的浓度越大，荧光越偏向于红色(荧光图见图4，365nm紫外灯下相应的荧光照片见图5)。所有的操作均在室温下进行，荧
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说 明 书
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光检测的条件如下：激发波长为380nm，激发光和发射光的狭缝宽度均为5nm，扫描范围从450nm到740nm。[0061]实施例5：实际果汁样品中抗坏血酸的检测[0062]为了评估比率探针的实用性，我们用某品牌橙汁来进行抗坏血酸的检测实验。在实验前用0.22μm滤头过滤2次，除去橙汁中的悬浮物。实际检测时，将150μL浓度为1mg/mL的实施例1制备的比率探针分散液，150μL、100mM、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液，以及210μL浓度为0.1mM的高锰酸钾水溶液加入到取样管中，然后加入1mL含有不同浓度的抗坏血酸的橙汁样品(橙汁样品在使用之前先过滤掉其中的固体悬浮物，然后各自加入一定量的抗坏血酸，使样品含抗坏血酸浓度为2.0、5.0和7.0μM)，最后用去离子水稀释到3mL，10分钟后在与实施例4相同的检测条件下进行荧光测试，根据取样管的荧光颜色，即可判断抗坏血酸的浓度，抗坏血酸的浓度越大，荧光越偏向于红色。[0063]实施例6荧光比率探针的选择性
[0064]为了进一步探究抗坏血酸荧光比率探针的选择性，我们在比率探针分散液中加入一系列的金属离子和生物分子，包括Na+，Mg2+，Ca2+，K+，柠檬酸，尿素，色氨酸，组氨酸，多巴胺，葡萄糖，并通过荧光光谱，记录下荧光比率的变化情况。[0065]取12只取样管，在取样管中分别加入150μL、1mg/mL的实施例1制备的比率探针分散液，0.01M、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液150μL和210μL浓度为0.1mM的高锰酸钾水溶液，接着以第一只取样管为空白对照(加入等量去离子水)，其他11只取样管中分别加入抗坏血酸，Na+，Mg2+，Ca2+，K+，柠檬酸，尿素，色氨酸，组氨酸，多巴胺，葡萄糖，其中抗坏血酸为7μL，其他物质的浓度依次是抗坏血酸的7000，70，140，1400，20，1400，36，14，14，2000倍，最后用去离子水稀释到3mL，并摇匀。10分钟后将混合液转移到4mL的比色皿中进行荧光检测(荧光光谱图见图6，365nm紫外灯下相应的荧光照片见图7)，通过相应的荧光照片，可以看出只有加了抗坏血酸的样品，荧光才由绿色变到红色，也相应证明了该荧光比率探针对抗坏血酸的选择性。
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