纳米粒子及其制备方法和应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 111840305 A(43)申请公布日 2020.10.30

(21)申请号 202010708342.4(22)申请日 2020.07.15

(71)申请人 天津医科大学

地址 300070 天津市和平区气象台路22号(72)发明人 孔德新　钟玉绪　赵宝全　张哲　

王营营　马谦　侯岚娇　(51)Int.Cl.

A61K 31/704(2006.01)A61K 31/7048(2006.01)A61K 9/51(2006.01)A61K 47/46(2006.01)A61P 35/00(2006.01)B82Y 5/00(2011.01)B82Y 40/00(2011.01)

权利要求书2页 说明书8页 附图4页

()发明名称

纳米粒子及其制备方法和应用(57)摘要

本发明提供了一种纳米粒子及其制备方法和应用，涉及药物制剂技术领域，该纳米粒子包括纳米自组装颗粒和同型肿瘤细胞膜；其中，所述纳米自组装颗粒主要由地高辛和阿霉素自组装制得，其制得的纳米自组装颗粒无需引入载体材料，能够实现载药量高的效果；同时本申请纳米自组装颗粒的表面包覆有同型肿瘤细胞膜，由于肿瘤细胞膜表面具有多种抗原，使得本申请纳米粒子与肿瘤细胞具有免疫逃逸和同型结合的特性，进而提高其肿瘤靶向性，逃避宿主免疫系统。因此，本申请制得的纳米粒子具有载药量高、肿瘤靶向性强的优点，在提高现有抗肿瘤治疗效果的同时，具有更强的靶向性，能够有效降低药物对正常组织的毒性。

CN 111840305 ACN 111840305 A

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1.一种纳米粒子，其特征在于，所述纳米粒子包括纳米自组装颗粒和同型肿瘤细胞膜；所述纳米自组装颗粒主要由地高辛和阿霉素制得；所述同型肿瘤细胞膜包覆于纳米自组装颗粒的表面。2.根据权利要求1所述的纳米粒子，其特征在于，所述纳米粒子的水合粒径为150～200nm；

优选地，所述纳米自组装颗粒的水合粒径为100～150nm。3.根据权利要求1所述的纳米粒子，其特征在于，所述同型肿瘤细胞膜包括非小细胞肺癌细胞膜，优选为A9肿瘤细胞膜。

4.一种根据权利要求1～3任一项所述纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(A)利用沉淀法制备纳米自组装颗粒；(B)提供同型肿瘤细胞膜，将同型肿瘤细胞膜与步骤(A)制得的纳米自组装颗粒混匀，随后分级挤出，得到纳米粒子。

5.根据权利要求4所述的纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述步骤(A)包括以下步骤：

(a)、将地高辛溶解于有机溶液中，得到地高辛溶液；(b)、将阿霉素溶解于去离子水中，得到阿霉素溶液；(c)、在搅拌条件下，先将步骤(a)得到的地高辛溶液匀速注入到去离子水中，得到溶液A；随后将步骤(b)得到的阿霉素溶液加入溶液A中混匀，得到纳米自组装颗粒。

6.根据权利要求5所述的纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中有机溶液包括无水乙醇、甲醇、异丙醇或正丁醇中的任意一种，优选为无水乙醇；

优选地，当步骤(a)中有机溶液为无水乙醇时，地高辛溶液的摩尔浓度为0.1～2mmol/L，优选为1mmol/L；

优选地，当步骤(c)中匀速注入地高辛溶液速度为20-30ml/h，优选为25ml/h；优选地，所述步骤(b)阿霉素溶液的摩尔浓度为0.1～10mmol/L，优选为1mmol/L。7.根据权利要求5所述的纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述步骤(c)溶液A中地高辛的摩尔浓度为0.1mmol/L；

优选地，所述步骤(c)中溶液A与阿霉素溶液的体积比为18～20∶1，优选为19∶1；优选地，所述步骤(c)搅拌的反应条件至少满足如下中的至少一个：搅拌转速为1000～1200r/min，搅拌的温度为48～52℃，地高辛溶液滴加速度为25ml/h，搅拌的时间为0.8～1.5h；

更优选地，所述步骤(c)搅拌的反应条件至少满足如下中的至少一个：搅拌转速为1000r/min，搅拌的温度为50℃，滴加速度为25ml/h，搅拌的时间为1h。8.根据权利要求4所述的纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述步骤(B)包括以下步骤：

(d)、提供含同型肿瘤细胞膜溶液，随后将同型肿瘤细胞膜与步骤(c)制得的纳米自组装颗粒混匀，得到溶液B；

(e)、利用脂质体挤出仪，将溶液B通过200～400nm孔径的滤膜分级挤出3～6个循环，得到纳米粒子；

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优选地，所述步骤(d)含同型肿瘤细胞膜溶液中同型肿瘤细胞膜的含量为0.1mg/mL；优选地，所述步骤(d)中含同型肿瘤细胞膜溶液与步骤(c)制得的纳米自组装颗粒的体积比为1～10∶100～500。

9.根据权利要求4所述的纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(a)、将地高辛溶解于无水乙醇中，得到摩尔浓度为0.1～2mmol/L的地高辛溶液；(b)、将阿霉素溶解于去离子水中，得到摩尔浓度为0.1～10mmol/L的阿霉素溶液；(c)、在搅拌转速为1000～1200r/min，温度为48～52℃的搅拌条件下，先将步骤(a)得到的地高辛溶液注入到去离子水中得到地高辛摩尔浓度为0.1mmol/L的溶液A；随后将步骤(b)得到的阿霉素溶液加入溶液A中搅拌0.8～1.5h，得到纳米自组装颗粒；所述溶液A与阿霉素溶液的体积比为18～20∶1；

(d)、提供浓度为0.1mg/mL的含同型肿瘤细胞膜溶液，随后将同型肿瘤细胞膜与步骤(c)制得的纳米自组装颗粒以1～10∶100～500的体积比混匀，得到溶液B；

(e)、利用脂质体挤出仪，将溶液B通过400nm孔径的滤膜挤出3～6个循环，随后通过200nm孔径的滤膜挤出3～6个循环，得到纳米粒子；

优选地，所述制备方法包括以下步骤：(a)、将地高辛溶解于无水乙醇中，得到摩尔浓度为1mmol/L的地高辛溶液；(b)、将阿霉素溶解于去离子水中，得到摩尔浓度为1mmol/L的阿霉素溶液；(c)、在搅拌转速为1000r/min，温度为50℃的搅拌条件下，先将步骤(a)得到的地高辛溶液注入到去离子水中得到地高辛摩尔浓度为0.1mmol/L的溶液A；随后将步骤(b)得到的阿霉素溶液加入溶液A中，搅拌1h，得到纳米自组装颗粒；所述溶液A与阿霉素溶液的体积比为19∶1；

(d)、提供浓度为0.1mg/mL的含同型肿瘤细胞膜溶液，随后将同型肿瘤细胞膜与步骤(c)制得的纳米自组装颗粒以1～10∶100～500的体积比混匀，得到溶液B；

(e)、利用脂质体挤出仪，将溶液B通过400nm孔径的滤膜挤出3个循环，随后通过200nm孔径的滤膜挤出3个循环，得到纳米粒子。

10.一种根据权利要求1～3任一项所述的纳米粒子在制备治疗肿瘤药物中的应用。

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纳米粒子及其制备方法和应用

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技术领域

[0001]本发明涉及药物制剂技术领域，尤其是涉及一种纳米粒子及其制备方法和应用。背景技术

[0002]癌症已成为全球最严重的公共健康问题之一。随着分子诊断与治疗的不断发展，近10年来癌症的诊断与治疗有很大的提升，目前的治疗方法主要有放化疗、手术治疗、基因靶向治疗等。

[0003]许多基因毒性抗癌药物，如阿霉素，通过攻击DNA，在肿瘤细胞上产生多种DNA损伤，发挥抗癌作用。然而，肿瘤细胞可以通过DNA损伤修复(DNA damage repair，DDR)途径来清除基因毒性抗癌药物引起的DNA损伤。因此抑制DNA损伤修复可能增强基因毒性抗癌药物的抗癌作用。有报道称，抑制DNA损伤修复可使肿瘤细胞对阿霉素敏感。地高辛作为两个多世纪以来心衰治疗的主要药物，已被证明具有抑制DNA双链断裂修复的作用。由于癌症化疗通常在治疗期间和之后受到快速DNA损伤修复(DDR)的阻碍，DDR靶向已成为常规化疗的有力补充。经研究证明，地高辛通过抑制DNA双链、单链断裂修复能够发挥抗肿瘤的作用。[0004]然而，地高辛在临床应用治疗方面浓度使用范围非常狭窄(0.5～2.0ng/mL)，超出治疗范围会引起毒性。另一方面，作为一种基因毒性抗癌药物，阿霉素缺乏肿瘤靶向性，同时阿霉素具有心脏毒性，使其临床应用受到一定。尽管前期的研究表明地高辛和阿霉素的联合应用在治疗癌症方面体内外均有协同作用，但其实际治疗效果并不理想。[0005]因此，研究开发出一种纳米粒子，该纳米粒子具有载药量高、肿瘤靶向性强的优势，进而有效改善现有地高辛治疗窗窄，以及阿霉素缺乏肿瘤靶向性的问题，提高癌症的治疗效果，变得十分必要和迫切，目前还未见报道。[0006]有鉴于此，特提出本发明。发明内容

[0007]本发明的目的在于提供一种纳米粒子，所述纳米粒子具有载药量高、肿瘤靶向性强的优点，在提高现有抗肿瘤治疗效果的同时，具有更强的靶向性，能够有效降低药物对正常组织的毒性；进而该纳米粒子可以广泛应用于治疗癌症药物的制备过程中。[0008]为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：[0009]第一方面，本发明提供一种纳米粒子，所述纳米粒子包括纳米自组装颗粒和同型肿瘤细胞膜；

[0010]所述纳米自组装颗粒主要由地高辛和阿霉素制得；[0011]所述同型肿瘤细胞膜包覆于纳米自组装颗粒的表面。[0012]第二方面，本发明提供了一种上述纳米粒子的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：[0013](A)、利用沉淀法制备纳米自组装颗粒；[0014](B)、提供同型肿瘤细胞膜，将同型肿瘤细胞膜与步骤(A)制得的纳米自组装颗粒

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混匀，随后分级挤出，得到纳米粒子。[0015]第三方面，本发明提供了一种上述纳米粒子在制备治疗癌症药物中的应用。[0016]优选地，所述癌症为非小细胞肺癌。[0017]与现有技术相比，本发明的有益效果为：[0018]本发明提供的纳米粒子，该纳米粒子包括纳米自组装颗粒和同型肿瘤细胞膜；其中，所述纳米自组装颗粒主要由地高辛和阿霉素自组装制得，其制得的纳米自组装颗粒无需引入载体材料(相当于达到100％的载药率)，能够实现载药量高的效果；同时本申请纳米自组装颗粒的表面包覆有同型肿瘤细胞膜，由于同型肿瘤细胞膜表面具有多种抗原，使得本申请纳米粒子与肿瘤细胞具有免疫逃逸和同型结合的特性，进而提高其肿瘤靶向性，逃避宿主免疫系统。因此，本申请制得的纳米粒子具有载药量高、肿瘤靶向性强的优点，在提高现有抗肿瘤治疗效果的同时，具有更强的靶向性，能够有效降低药物对正常组织的毒性。[0019]本发明提供的纳米粒子的制备方法，所述制备方法：先利用沉淀法制备纳米自组装颗粒；随后将同型肿瘤细胞膜与上述纳米自组装颗粒混匀，随后分级挤出，得到纳米粒子。上述制备方法具有制备工艺简单、易于操作的优势。

[0020]本发明提供的纳米粒子可以广泛应用于治疗癌症药物的制备过程中，特别是用于治疗非小细胞肺癌药物的制备过程中。

附图说明

[0021]为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0022]图1为本发明实施例4提供的本发明纳米粒子和纳米自组装颗粒的丁达尔效应图；[0023]图2为本发明实施例4提供的本发明纳米粒子和纳米自组装颗粒的透射电镜观察图；

[0024]图3为本发明实施例5提供的本发明纳米粒子和纳米自组装颗粒对A9细胞的增殖抑制作用图；

[0025]图4为本发明实施例5提供的本发明纳米粒子和纳米自组装颗粒对A9细胞的凋亡诱导率效果图；

[0026]图5为本发明实施例6提供的本发明纳米粒子和纳米自组装颗粒斑马鱼实验的荧光显微镜观察图；

[0027]图6为本发明实施例6提供的本发明纳米粒子和纳米自组装颗粒进行裸鼠实验的肿瘤增长观察图；

[0028]图7为本发明实施例6提供的本发明纳米粒子和纳米自组装颗粒进行裸鼠实验的肿瘤重量效果图；

[0029]图8为本发明实施例6提供的本发明纳米粒子和纳米自组装颗粒进行裸鼠实验的肿瘤体积效果图。

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具体实施方式

[0030]下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0031]根据本发明的一个方面，一种纳米粒子，所述纳米粒子包括纳米自组装颗粒和同型肿瘤细胞膜；

[0032]所述纳米自组装颗粒主要由地高辛和阿霉素制得；[0033]所述同型肿瘤细胞膜包覆于纳米自组装颗粒的表面。[0034]本发明提供的纳米粒子，该纳米粒子包括纳米自组装颗粒和同型肿瘤细胞膜；其中，所述纳米自组装颗粒主要由地高辛和阿霉素自组装制得，其制得的纳米自组装颗粒无需引入载体材料(相当于达到100％的载药率)，能够实现载药量高的效果；同时本申请纳米自组装颗粒的表面包覆有同型肿瘤细胞膜，由于同型肿瘤细胞膜表面具有多种抗原，使得本申请纳米粒子与肿瘤细胞具有免疫逃逸和同型结合的特性，进而提高其肿瘤靶向性，逃避宿主免疫系统。因此，本申请制得的纳米粒子具有载药量高、肿瘤靶向性强的优点，在提高现有抗肿瘤治疗效果的同时，具有更强的靶向性，能够有效降低药物对正常组织的毒性。[0035]在本发明的一种优选实施方式中，所述纳米粒子的水合粒径为150～200nm；所述纳米自组装颗粒的水合粒径为100～150nm。[0036]作为一种优选的实施方式，纳米技术作为一种高速发展的新兴研究领域，为特异性抗肿瘤免疫治疗方法的突破提供了契机。纳米载药系统本身具有靶向、缓控释、透皮、物理响应、自身长循环等特性，可以克服传统药物稳定性差、药理作用时间短、生物利用率低、毒副作用大等弊端。由于纳米粒子具有适宜大小的物理尺寸，其在肿瘤血管中会产生增强渗透与保留效应(简称为EPR效应)。将本申请药物制备为纳米级的纳米粒子具有减少纳米粒子到达正常组织，增加纳米粒子在肿瘤细胞病理部位积累的效果，进而有效提高了本申请纳米粒子的靶向功能。同时纳米粒子在体内通过主动或被动靶向作用蓄积于肿瘤部位可降低药物剂量同时降低药物对正常组织细胞的毒副作用。因此，本申请制得的水合粒径为150～200nm的纳米粒子以及水合粒径为100～150nm的纳米自组装颗粒，在具有更强的肿瘤靶向性的同时，还能够有效降低药物对正常组织的毒性。[0037]注：所述EPR效应，即实体瘤的高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effect)指的是，相对于正常组织，某些尺寸的分子或颗粒更趋向于聚集在肿瘤组织的性质。正常组织中的微血管内皮间隙致密、结构完整，大分子和脂质颗粒不易透过血管壁，而实体瘤组织中血管丰富、血管壁间隙较宽、结构完整性差，淋巴回流缺失，造成大分子类物质和脂质颗粒具有选择性高通透性和滞留性，这种现象被称作实体瘤组织的高通透性和滞留效应，简称EPR效应。

[0038]在本发明的一种优选实施方式中，所述同型肿瘤细胞膜包括非小细胞肺癌细胞膜，优选为A9肿瘤细胞膜。[0039]优选地，所述阿霉素为盐酸阿霉素。[0040]根据本发明的一个方面，一种上述纳米粒子的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

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(A)、利用沉淀法制备纳米自组装颗粒；

[0042](B)、提供同型肿瘤细胞膜，将同型肿瘤细胞膜与步骤(A)制得的纳米自组装颗粒混匀，随后分级挤出，得到纳米粒子。

[0043]本发明提供的纳米粒子的制备方法，所述制备方法：先利用沉淀法制备纳米自组装颗粒；随后将同型肿瘤细胞膜与步骤(A)制得的纳米自组装颗粒混匀，随后分级挤出，得到纳米粒子。上述制备方法具有制备工艺简单、易于操作的优势。[0044]在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(A)包括以下步骤：[0045](a)、将地高辛溶解于有机溶液中，得到地高辛溶液；[0046](b)、将阿霉素溶解于去离子水中，得到阿霉素溶液；[0047](c)、在搅拌条件下，先将步骤(a)得到的地高辛溶液注入到去离子水中，得到溶液A；随后将步骤(b)得到的阿霉素溶液加入溶液A中混匀，得到纳米自组装颗粒。[0048]在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(a)中有机溶液包括无水乙醇、甲醇、异丙醇或正丁醇中的任意一种，优选为无水乙醇；[0049]优选地，当步骤(a)中有机溶液为无水乙醇时，地高辛溶液的摩尔浓度为0.1～2mmol/L，优选为1mmol/L；[0050]优选地，所述步骤(b)阿霉素溶液的摩尔浓度为0.1～10mmol/L，优选为1mmol/L；[0051]在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(c)溶液A中地高辛的摩尔浓度为0.1mmol/L；

[0052]优选地，所述步骤(c)中溶液A与阿霉素溶液的体积比为18～20∶1，优选为19∶1；[0053]优选地，所述步骤(c)搅拌的反应条件至少满足如下中的至少一个：[00]搅拌转速为1000～1200r/min，搅拌的温度为48～52℃，搅拌的时间为0.8～1.5h；[0055]更优选地，所述步骤(c)搅拌的反应条件至少满足如下中的至少一个：[0056]搅拌转速为1000r/min，搅拌的温度为50℃，搅拌的时间为1h；[0057]在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(B)包括以下步骤：[0058](d)、提供含同型肿瘤细胞膜溶液，随后将同型肿瘤细胞膜与步骤(c)制得的纳米自组装颗粒混匀，得到溶液B；[0059](e)、利用脂质体挤出仪，将溶液B通过200～400nm孔径的滤膜分级挤出3～6个循环，得到纳米粒子；[0060]优选地，所述步骤(d)含同型肿瘤细胞膜溶液中同型肿瘤细胞膜的含量为0.1mg/mL；

[0061]优选地，所述步骤(d)中含同型肿瘤细胞膜溶液与步骤(c)制得的纳米自组装颗粒的体积比为1～10∶100～500。

[0062]在本发明的一种优选实施方式中，所述制备方法包括以下步骤：[0063](a)、将地高辛溶解于无水乙醇中，得到摩尔浓度为0.1～2mmol/L的地高辛溶液；[00](b)、将阿霉素溶解于去离子水中，得到摩尔浓度为0.1～10mmol/L的阿霉素溶液；[0065](c)、在搅拌转速为1000～1200r/min，温度为48～52℃的搅拌条件下，先将步骤(a)得到的地高辛溶液注入到去离子水中得到地高辛摩尔浓度为0.1mmol/L的溶液A；随后将步骤(b)得到的阿霉素溶液加入溶液A中搅拌0.8～1.5h，得到纳米自组装颗粒；所述溶液A与阿霉素溶液的体积比为18～20∶1；

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CN 111840305 A[0066]

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(d)、提供浓度为0.1mg/mL的含同型肿瘤细胞膜溶液，随后将同型肿瘤细胞膜与步

骤(c)制得的纳米自组装颗粒以1～10∶100～500的体积比混匀，得到溶液B；[0067](e)、利用脂质体挤出仪，将溶液B通过400nm孔径的滤膜挤出3～6个循环，随后通过200nm孔径的滤膜挤出3～6个循环，得到纳米粒子；[0068]优选地，所述制备方法包括以下步骤：[0069](a)、将地高辛溶解于无水乙醇中，得到摩尔浓度为1mmol/L的地高辛溶液；[0070](b)、将阿霉素溶解于去离子水中，得到摩尔浓度为1mmol/L的阿霉素溶液；[0071](c)、在搅拌转速为1000r/min，温度为50℃的搅拌条件下，先将步骤(a)得到的地高辛溶液注入到去离子水中得到地高辛摩尔浓度为0.1mmol/L的溶液A；随后将步骤(b)得到的阿霉素溶液加入溶液A中，搅拌1h，得到纳米自组装颗粒；所述溶液A与阿霉素溶液的体积比为19∶1；[0072](d)、提供浓度为0.1mg/mL的含同型肿瘤细胞膜溶液，随后将同型肿瘤细胞膜与步骤(c)制得的纳米自组装颗粒以1～10∶100～500的体积比混匀，得到溶液B；[0073](e)、利用脂质体挤出仪，将溶液B通过400nm孔径的滤膜挤出3个循环，随后通过200nm孔径的滤膜挤出3个循环，得到纳米粒子。[0074]根据本发明的一个方面，一种上述纳米粒子在制备治疗癌症药物中的应用。[0075]优选地，所述癌症为非小细胞肺癌。

[0076]本发明提供的纳米粒子可以广泛应用于治疗癌症药物的制备过程中，特别是用于治疗非小细胞肺癌药物的制备过程中。

[0077]下面将结合实施例对本发明的技术方案进行进一步地说明。[0078]实施例1 提取A9细胞膜

[0079]一种A9细胞膜的提取方法，包括以下步骤：[0080](1)、试剂的准备：将膜蛋白抽提试剂在室温下溶解，混匀，取适量膜蛋白抽提试剂置于冰上，使用前在膜蛋白抽提试剂中加入PMSF(苯甲基磺酰氟)，使得PMSF在膜蛋白抽提试剂中的终浓度为1mmol/L。[0081](2)、细胞的准备：选取处于对数生长期且状态良好的A9细胞，PBS清洗一遍，刮去细胞，离心收集细胞，弃掉上清，留下细胞沉淀备用。冰PBS清洗两遍细胞，计数。取1mL已加入PMSF的膜蛋白抽提试剂，加入2×107个细胞中，轻轻混匀，冰浴10～15min。[0082](3)、破碎细胞：采取冻融法破碎细胞，将步骤2中的样品反复在37℃水浴锅和液氮中冻融3次，取少量样品在显微镜下观察细胞状态，若破碎程度不够可增加冻融次数直至细胞破碎程度大于70％。[0083](4)、去除细胞核和未破碎的细胞：在4℃条件下700g离心10min，小心收集上清置于新离心管中，切勿触及沉淀。[0084](5)、沉淀细胞膜碎片：4℃条件下14000g离心30min，使得细胞膜碎片沉淀，加入20μL DW混匀备用，提取得到提取A9细胞膜。[0085]所述膜蛋白抽提试剂为：碧云天，P0033。[0086]实施例2 制备纳米自组装颗粒

[0087]一种纳米自组装颗粒的制备方法，包括以下步骤：[0088](a)、将地高辛溶解于无水乙醇中，制得地高辛终浓度为1mmol/L的溶液，随后0.22

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μM微孔滤膜过滤，得到1mmol/L的地高辛无水乙醇溶液；[00](b)、将17mL超纯水和搅拌子加入茄形瓶中，放置50℃水浴上预热；在1000r/min的磁力搅拌下，采用注射泵缓慢匀速滴加2mL充分溶解的1mmol/L地高辛无水乙醇溶液，开盖继续搅拌5min，得到溶液A；[0090](c)、将盐酸阿霉素溶解于去离子中，制备浓度为1mmol/L的盐酸阿霉素(ADR-HCl)水溶液，随后将1mL的1mmol/L的ADR-HCl水溶液加入溶液A中，关盖继续搅拌1h，得到纳米自组装颗粒。

[0091]实施例3 制备纳米粒子

[0092]一种纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：[0093](d)、用5mL离心管收集4mL实施例2制得的纳米自组装颗粒，随后加入12μL实施例1得到的A9细胞膜溶液，用移液吹匀，得到溶液B。[0094](e)、将脂质体挤出仪用超纯水清洗后，利用脂质体挤出仪将溶液B通过孔径为400nm滤膜挤出至少3个循环，并继续通过孔径为200nm的滤膜挤出至少3个循环，得到纳米粒子。

[0095]实施例4 纳米粒子的表征

[0096]本实施例对实施例2制备得到的纳米自组装颗粒以及实施例3制备得到的纳米粒子进行基本表征，具体方法如下：[0097](1)、丁达尔效应：将所制备的纳米自组装颗粒及纳米粒子放于吸收池，激光笔照射观察丁达尔效应；

[0098]丁达尔效应是胶体化学中的重要部分，纳米材料中的一些重要概念是建立在胶体化学经典理论以及成熟思想之上，胶体作为一种分散体系，包含分散剂和分散质两部分，当分散质粒径大小在1～100nm范围时，构成的分散体系称为胶体。当纳米微粒分散于液相体系时则形成液溶胶，且粒径大小小于可见波长(400～700nm)时，微粒高度分散于液溶胶中，具有明显散射作用即丁达尔效应。[0099]如图1所示，实施例2制备得到的纳米自组装颗粒(DANPs)、实施例3制备得到的纳米粒子(DAMNPs)均可见丁达尔现象，地高辛加盐酸阿霉素的方案(D+A)无光散射现象。[0100](2)、透射电镜(TEM)观察：实施例2制备得到的纳米自组装颗粒以及实施例3制备得到的纳米粒子利用透射电镜(TEM)进行观察，透射电镜(TEM)是观察纳米粒子尺寸和形态较为常用和直观的方法。[0101]如图2所示，通过透射电镜照片可以看出，DANPs、DAMNPs的分散性均比较好，实施例2制备得到的纳米自组装颗粒(DANPs)呈球形实体颗粒大小分布均匀，粒径约在100nm～150nm范围。而实施例3制备得到的纳米粒子(DAMNPS)的粒径较大，观察颗粒内部明显可见透光性较强的A9肿瘤细胞膜包裹了透光性较弱的DANPs。[0102]实施例5 纳米粒子的体外抗肿瘤实验[0103](一)、为了评估实施例3制备得到的纳米粒子(DAMNPS)对A9细胞的增殖抑制作用，我们采用MTT法检测细胞存活率。MTT法主要通过利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶，使得MTT还原为甲瓒(Formazan)，呈蓝紫色结晶状，不溶于水而沉积于细胞中，死细胞则不会发生这种反应。DMSO可溶解甲瓒，利用酶标仪测定光密度值可间接检测细胞增殖与存活情况。这种检测方法成本低、操作方便、灵敏度高。

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故我们采用MTT法检测地高辛加盐酸阿霉素(D+A)、DANPs、DAMNPs对A9细胞增殖

的影响。D+A、DANPs、DAMNPs三组按药物浓度梯度给药，地高辛(DIG)与阿霉素(ADR)浓度之比均为2∶1。

[0105]其结果如图3所示，给药后72h，DAMNPs对A9细胞的细胞毒性作用呈现剂量依赖性。药物浓度较低时，三组对A9细胞的增殖抑制作用无明显差异，但随着给药浓度的增加，DIG浓度为0.5μM、ADR浓度为0.25μM时DAMNPs的增殖抑制作用与其他两组相比有明显增强。结果表明DAMNPs对A9细胞的抑制作用呈现剂量依赖性。[0106](二)、细胞凋亡是指细胞为保证自身生命活动能够正常进行，通过基因的方式发生细胞自主而有序死亡。凋亡的发生是为更好适应生存环境而选择的主动死亡过程。许多研究表明，诱导肿瘤细胞凋亡可有效治疗癌症，并且多种药物通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥肿瘤细胞增殖抑制作用。[0107]为探讨D+A、DANPs、DAMNPs对A9细胞增殖的抑制作用是否由细胞凋亡引起，本实施例采用APC单一染色法检测D+A、DANPs、DAMNPs对A9细胞凋亡的影响。[0108]其结果如图4所示，D+A组、DANPs组、DAMNPs组中A9细胞的凋亡诱导率分别为9.4％、14.7％和17.2％，明显高于对照组的5.5％，其中DAMNPs诱导的细胞凋亡率最高。实验结果通过运用GraphPad Prism 7软件进行t检验，D+A组、DANPs组、DAMNPs组与对照组(control)的细胞凋亡数相比，具有显著性差异。[0109]实施例6 纳米粒子的体内抗肿瘤实验[0110](一)、斑马鱼实验：[0111](1)、斑马鱼饲养：实验使用品种为野生型AB系斑马鱼，所用的循环水水温为(28.5±0.5)℃，pH值约7.2，水质总硬度62mg/L(以CaCO3计)，电导率为485μS。光照时间为14h，黑夜处理10h。斑马鱼早晚各喂食丰年虫1次。[0112](2)斑马鱼肿瘤模型的建立[0113]1、获取斑马鱼胚胎：实验前一晚将成年AB系斑马鱼雌雄1∶1分开放入繁殖缸中，中间放抽板将雌雄鱼隔开。次日8：00am抽板，待产卵15min后及时收走鱼卵。使用E3培养液冲洗鱼卵，将已死亡的鱼卵除去以免影响健康鱼卵。随后放入10cm培养皿中，加入含0.2mmol/L PTU的培养液，放入32℃孵箱中培养48h。[0114]2、制备A9细胞悬液：选取细胞状态良好且处于对数生长期的A9细胞，PBS清洗、胰酶消化后用PBS制成细胞悬液。随后加入DIO染料37℃孵箱孵育20min，PBS清洗两边，制备成5×106/mL细胞悬液。[0115]3、斑马鱼胚胎显微注射：斑马鱼胚胎在48h时用1.2mmol/L的三卡因进行麻醉，随后将斑马鱼胚胎放到2％琼脂糖凝胶上。用显微注射器注射约20nL体积的细胞悬液于每个斑马鱼胚胎的卵黄囊内，其中包含100个左右的细胞。细胞注射后，用荧光显微镜对胚胎进行筛选。选取荧光强度以及细胞面积大小基本一致的胚胎进行后续实验。将胚胎转移置24孔板中，各孔加入2mL含不同药物的E3培养液，置于32℃孵箱中培养48h。[0116]4、分组及给药方式：胚胎被分为四组，分别为control组、1.4μM DIG+0.7μM ADR组、DANPs组(1.4μM DIG+0.7μM ADR)、DAMNPs组(1.4μM Digoxin+0.7μM ADR)，给药方式为药浸法，给药持续48h，48h后利用荧光显微镜观察斑马鱼体内A9细胞的荧光强度。[0117]其结果如图5所示，对照组和各给药组作用48h后荧光显微镜观察可以看出，D+A

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组、DANPs组以及DAMNPs与对照组比较斑马鱼体内肿瘤荧光强度均明显减小，说明三组均可有效抑制斑马鱼体内肿瘤细胞的增殖。而DAMNPs与D+A组、DANPs组相比，肿瘤荧光强度也有显著降低。其中，图5中横坐标分别为明场下拍照的斑马鱼(Bright field)，荧光下拍照DIO组(细胞膜染色)，将前两组重叠在一起，即相同的鱼相同的位置不同的光源下的荧光拍照(Merge)。由图5可以说明，同种浓度下DAMNPs作用于斑马鱼时，对肿瘤细胞的作用较D+A组、DANPs组效果增强，抑制效果更显著。[0118](一)、裸鼠实验：[0119](1)鼠皮下移植瘤模型的建立[0120]1、制备A9细胞悬液：选取细胞状态良好且处于对数生长期的A9细胞，PBS清洗后用胰酶消化，加入培基制成细胞悬液，计数。然后1000rpm离心5min，用PBS再清洗两遍，制成密度为1×107/mL的细胞悬液。[0121]2、培养移植瘤：在裸鼠右侧腹部皮下注射细胞悬液200μL，每只裸鼠大约注射2×106个细胞。[0122]3、移植瘤块，提前将手术剪、手术镊以及接种针高压灭菌。待肿瘤长至满足移植实验所需瘤块数量和大小时，将裸鼠体内的肿瘤组织取出，置于培养皿中，加入生理盐水，将组织剪成20～30mm3的大小均匀瘤块，再将瘤块用接种针移植入4-5周左右健康的BALB/c裸鼠体内。[0123]4、分组及给药方式：当裸鼠肿瘤面积长至80～100mm3时，随机分为4组，分别为control组、1mg/kg DIG+0.4mg/kg ADR组、DANPs(1mg/kg DIG+0.4mg/kg ADR)组、DAMNPs(1mg/kg DIG+0.4mg/kg ADR)组。各组均采用尾静脉注射方式给药，control组注射相应体积的生理盐水，每三天给药一次，称量体重并测量肿瘤体积(肿瘤体积＝肿瘤长度×肿瘤宽度2/2)。15天后处理裸鼠，取出肿瘤组织拍照并称重，统计肿瘤体积变化情况以及处死时各组平均瘤重。结束后将肿瘤、心、肝、脾、肺、肾各组织一半冻存于-80℃冰箱中，一半放入4％多聚甲醛中固定。

[0124]其结果如图6、图7和图8所示，给药过程中对照组随时间增长肿瘤体积增长很快，D+A组、DANPs组也随时间的增加有一定的增长趋势，而DAMNPs组与其他三组相比增长相对缓慢的多。各组在给药18天后处死，对各组肿瘤体积以及肿瘤重量进行统计学分析。D+A组、DANPs组在给药18天后，肿瘤体积以及肿瘤重量与对照组相比均减小，且具有统计学差异。而DAMNPs组不仅与对照组比较肿瘤体积明显减小，肿瘤重量也显著变小。与D+A组以及DANPs组相比肿瘤体积、瘤重也有明显下降趋势且具有统计学意义。[0125]综上所述，本申请制得的纳米粒子具有载药量高、肿瘤靶向性强的优点，在提高现有抗肿瘤治疗效果的同时，具有更强的靶向性，能够有效降低药物对正常组织的毒性。[0126]最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

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