细胞增殖实验(Brdu法)

1.将盖玻片放入到24孔板中，将长满的大盘细胞用胰酶消化后，按1-2万个细胞/孔加入到24孔板中。

2.待细胞长至50%-60%的密度后，更换培养液，导入相应质粒，4-6小时后更换培养液。 3.培养24h后，于每孔板加入10µm的Brdu，继续培养4h。 4. 4％冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。

5. 0.2％Triton X－100通透10分钟，PBS洗三遍。

6. 按1:1000稀释Brdu抗体，于每孔中加300µl，4度过夜后，PBS洗三遍。 7. 0.5ug/ml DAPI染核，然后直接照荧光片。

8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周。

细胞爬片

4%多聚甲醛固定20min

（固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮）

PBS漂洗3×5min

0.5%Triton 穿孔15min (丙酮固定法不用透化处理)

PBS漂洗3×5min

加入5%BSA稀释的Brdu，于4℃杂交过夜

PBS漂洗3×5min

10ug/ml DAPI染色2min

抗淬灭封片剂封片

1.将盖玻片放入到24孔板中，将长满的大盘细胞用胰酶消化后，按1-2万个细胞/孔加入到24孔板中。

2.待细胞长至50%-60%的密度后，取出细胞爬片， 3. 4％冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗两遍。

4. 2N HCL in PBS(1:5 用PBS稀释盐酸) 室温10分钟

5. neutralize by incubating the samples in borate buffer (0.1 M) for 10 min at room temperature. 硼酸中和， PBS 3次

4. Blocking buffer (5% BSA, PBS, Tween-20 0.2%)。 Goat serum 10% 5. Blocking buffer封闭（5%BSA）1 小时

6. BrdU(rat)/Cdk5(rabbit) 一抗4度过夜，PBS洗三遍。 7.二抗室温2小时（避光），或者37度1半小时，PBS洗三遍。 （一抗，二抗稀释到blocking buffer）

Dip the cover silp into DD-H20, and air-dry in filter-paper.

8. Anti-fade with DAPI,put the coversilp up-side down,然后直接照荧光片。 9.指甲油封片子的四周。