药物对映体HPLC分离测定研究新进展

药物对映体HPLC分离测定研究新进展

彭清涛　胡文祥3　谭生建

(国防科工委军事医药研究发展中心,北京100101)

　　手性是宇宙间普遍特征之一。药物的手性对生理活性的影响近年来为人们关注。许多药物对映体有不同的药动学和药效学,并且往往有药理作用的显著差异。多数情况下,只有一种药物对映体有显著的药理活性,而另一种对映体活性较低或没有活性,甚至活性相反或导致毒副反应。目前国际上临床用的1200多种化学药物中,有480种含手性因素,其中只有20%是单一对映体形式,其余80%是以外消旋

手性流动相添加剂法(CMPA)。两者的共同特

点是均以现代HPLC技术为基础,并引入不对称中心(或光活性分子);不同的是CDR法是将其引入分子(溶质)内,而CSP和CMPA则引入分子间。引入手性环境使药物对映体间呈现物理特征的差异是其HPLC拆分的基础。本文在吕湘林等综述[1]的基础上,进一步系统评述了近年来利用HPLC分离测定药物对映体的研究新进展。1　间接法间接法是药物对映体在用HPLC分离前,先与有高光学纯度的手性衍生化试剂(CDA)反应,形成非对映异构体,再以常规HPLC进行分离测定。常用的衍生化试剂有测定胺类和醇类药物的氯甲酸酯,测定含羧基药物的22丁醇和薄荷醇,测定含酮基药物的(+)2三氟甲基苄

(R,基肼,测定含羟基药物的(-)2樟脑酰氯、

R)2O,O2二乙酰酒石酸酐,含氨基的手性药物

体形式给药。在考察血药浓度与临床疗效关系时,须分别对单个对映体进行研究测定。此外,在研制含手性中心的新药过程中,也应分别评价单个对映体的效价、毒性及药动学性质。基

于此,美国国家食品与药品管理局(FDA)规定,今后凡研制有手性中心的药物,必须对其各个对映体进行测定和评价。由于许多手性药物各对映体的生物活性有显著差别,所以某些药物须以纯异构体供药,可见对映体的制备分离十分必要。为此,有必要发展快速、准确、灵敏、简便的药物对映体的拆分和测定方法。经典的方法如分级结晶、旋光法等的重现性或灵敏度欠佳。随着手性高效液相色谱(HPLC)的发展,为解决上述问题提供了有效的手段。从80年代初开始利用HPLC对药物对映体进行拆分和测定至今,进展十分迅速,文献增长量极大,成为新药研究和分析化学的前沿领域之一。

HPLC分离药物对映体的方法主要分为间

通常采用异氰酸酯、异硫氰酸酯,测定氨基酸类药物可用邻苯二甲醛和N2乙酰2L半胱氨酸等。目前许多CDA已经商品化,有一些CDA还能用于药物对映体的制备和半制备。国内目前在这方面也作了不少工作。邵刚等[2]以52二甲氨基萘磺酰氯为柱前荧光标识试剂,用ODS柱完成了对静注l2麻黄碱和d2伪麻黄碱后豚鼠血浆内该对映体水平的考察,并且定量检测了服用中成药小青龙合剂后人血浆中的该对对映体。金晓等[3]以(+)2FLEC作为CDA,经过ODSHypersil柱分离,以水和乙腈为流动相,使麻黄碱、去甲麻黄碱、去甲伪麻黄碱的4对对映体同时达到基线分离,分离度均大于115。杨青等[4]用异氰酸222萘酯

接法和直接法。前者又称手性试剂衍生化法(CDR),后者又可分为手性固定相法(CSP)和

收稿日期　1997207221

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(NI)不仅拆分了胺类药物的对映体,也拆分了

苯芴醇和苯丙醇的对映体。丘宗荫等[5]用

GITC及C18柱拆分了地佐西平对映体,该法已用于测定右旋地佐西平的光学纯度和血药浓度。

在体内手性药物的分析中,衍生化HPLC常因其程序复杂而受到局限,Krull等发展了一种固相衍生化技术,可实现衍生化HPLC自动化。这种固相衍生化试剂是将手性衍生化试剂固定于高分子材料的小孔内,小孔亲水的流动相及大分子蛋白质进入,而允许小分子疏水性药物进入发生衍生化反应。同时在流动相中加入低浓度乙腈溶液和十二烷基磺酸钠(SDS)表面活性剂,其中SDS用于溶解变性蛋白并防止其沉淀在衍生化柱中,除蛋白外的小分子疏水性药物在聚合试剂孔内被衍生化,衍生化后的非对映体可以常规反相柱分离。将这种固相衍生化柱与反相柱在线相连,即可直接进行对映体分析,Chou等用92芴基甲氧氯甲酸酯(FMOC)2L2脯氨酸和FMOC2L2苯丙氨酸标记物在活化的邻2硝基苯并苯酚聚合介质中合成有光学活性的聚合试剂,成功地分离分析了胺类对映体。Gao等用FMOC2L2脯氨酰标记的固相衍生化试剂测定了尿中苯丙胺对映体。其他手性胺类药物如普奈洛尔、阿普洛尔、麻黄碱、昔奈福林等采用固相衍生化法进行分析也见报道。近年,用带FMOC2L2脯氨酰标记和邻硝基二苯甲酮为底物的手性固相衍生化试剂已用于血浆样品中药物对映体的直接进样分析。以聚合羟基苯并或二甲氨基吡啶　为底物的衍生化试剂,由于聚合基质的疏水性保护而稳定化,有较好的在线衍生化重现性。

衍生化试剂固定在聚合的载体上进行生物体液的分析有许多优点:聚合试剂的疏水特性在药物检测中可作为一种固相萃取的介体;聚合试剂的有限孔径同样起到性通道介体的作用,从而避免生物体液中高分子蛋白的干扰。此法能直接分离分析体液中的药物对映体,简化了衍生化步骤,提供一种生物体液药物对映体检测的新途径。

间接法的主要优点为:(1)可用价格便宜、柱效较高的非手性柱;(2)反应时可通过选择衍生化剂提高检测灵敏度。其缺点为:(1)衍生化反应使样品分离时间延长、操作较复杂;(2)对衍生化剂的纯度、稳定性要求较高;(3)还要求对映体的衍生化反应须迅速且反应速率一致。2　直接法

直接法是引入“手性识别”或“手性环境”(手性固定相、手性流动相添加剂)到HPLC系统中,以形成暂时非对映异构体复合物,从而使药物对映体分离。这基于“三点作用”分离理论。本文对于其手性识别机理不再赘述。2.1　手性固定相(CSP)　手性固定相是在色谱柱的担体上加入高光学纯的手性异构作而成。CSP使用方便,一般不需要高光学纯的衍生化试剂,制备分离便利,但也存在通用性差、样品有时须作柱前衍生等不足。自1981年Pirkle研究出(R)2N2(3,52二硝苄基)苯基甘氨酸CSP以来,以商品出售的手性固定相已有100种左右。这些手性固定相有Pirkle型相、蛋白质键合相、环糊精键合相、纤维素及多糖衍生物相、合成手性聚合物相、冠醚类键合相以及其他一些手性固定相等。

2.1.1　Pirkle型手性固定相　Pirkle型手性固定相的合成主要通过含末端羧基或异氰酸酯基手性前体与氨基键合硅胶进行缩合反应,分别形成含酰胺或脲型结构CSP。将2,2,22三氟(21292蒽)乙醇(TFAE)键合到硅胶上形成的固定相被称为第一代Pirkle型CSP。其后,Pirkle等又制备了一系列3,52二硝基苯甲酰(DNB)氨基酸、醇、胺衍生物CSP,构成了第二代Pirkle型CSP。第三代Pirkle型CSP有富电子的萘基和较长的键合烷基链,提高了立体识别能力和适用范围。此后,合成出既含π2酸(DNB),又含π2碱(萘基),含有碳、磷、联萘等不对称中心的CSP。近几年来,又相继合成出氨基磷酸酯及一系列含萘、杂环的氨基酸衍生物、二氨和由联萘羧酸衍生的多种作用CSP。

Pirkle柱已商品化,其中一些可用于制备和半制备,在药物对映体分析中已广泛使用,已

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用于氨基醇类、乙内酰脲、内酰胺、胺类、醇类及

硫醇类药物对映体的拆分。Pirkle型CSP的优点是柱效和柱容量高,但在拆分有强酸或强碱性功能团的药物对映体时,要求进行衍生化。最近,Petersen等[6]利用一种Pirkle型α2Burke1手性柱(将二甲基2N23,52二硝基苯α2氨基酸22,22二甲基242戊基磷酸酯共价键合到5μm的巯苯基硅胶上)分离测定了15种β2阻断剂,分离度介于1107～1141。Pirkle柱大多使用正相分离系统,流动相通常用己烷加少量醇类改性剂。最近,Rustum发现Pirkle型手性相也可用于反相分离系统,从而扩展了其应用范围。2.1.2　蛋白质手性固定相　蛋白质是一类由手性亚基团(L2氨基酸)组成的高分子量聚合物,可对药物对映体在蛋白质的结合位点进行手性识别而达到手性分离。目前商品化的手性蛋白质键合相有两种:(1)将牛血清蛋白共价键合到硅胶上(Resolvsil柱),主要用于氨基酸及其衍生物对映体的分离;(2)通过离子键(或共α价键)以及蛋白交联作用将α12酸性糖蛋白(12

AGP)固定到硅胶上。第二代蛋白质手性柱AGP柱(Chiral2AGP)较第一代的稳定性好、柱效高,且对许多药物对映体有良好的立体选择性,可直接分离许多药物对映体,如硫喷妥因[7]、心得怡及β2阻滞剂[8]等。人血清蛋白(HSA)已通过二醇键合到硅胶上,对酸型药物和α2芳基丙酸非甾体消炎药有高对映体选择性。AGP2CSP是当今血药研究中应用最广的CSP之一。其后又研制出几种新的AGP2CSP,并用于酸性、碱性及中性药物对映体的分离。近年来已研究出第三代的酸性蛋白手性柱Ovomucoid,其CSP是从鸡蛋白中分离出来的卵粘蛋白,在很宽的pH范围内有相当的稳定性,能分离许多不同的胺和羧酸类手性药物,如氯酚宁胺、苯异丙酸类。酶也是一种蛋白质,Jadaud等研制了一种ACHT2CSP,将酶共价键

α合到硅胶上,已用于分离N22天冬酰2苯丙氨酸甲酯。Haginaka等[9]认为,蛋白质由于外层

亲水内层疏水,本身有混合功能,而过长的交联剂疏水键会使固定相的立体选择性降低。他们

用二琥珀酰亚氨基碳酸二酰胺(DSC)将卵类粘蛋白固定于氨丙基柱上,对体液中多种酸性、碱性手性药物进行实验,对映体分离良好。Oda等[10]将二琥珀酰亚氨基辛二酰胺(DSS)用作交联剂,将抗生物素蛋白键合于氨丙基柱上,对体液中的酮洛芬直接进样分析,两对映体分离良好。

使用蛋白质手性柱时,一般多用磷酸或硼酸缓冲液再加入0～5%的乙腈、乙醇、丙酮或醚类有机溶剂作流动相。蛋白质手性柱的柱容量低,极易超负载,但用于制备也有报道。这类手性柱很难将药物对映体母体与其代谢产物及内源性化合物分离,一般多需增加预柱或与非手性柱联用。尽管如此,由于其特殊的对映体选择性,至今仍有许多药物只能在蛋白质CSP上分离。2.1.3　环糊精手性键合固定相　环糊精(CD)的手性识别主要来自环内腔对芳烃或脂肪烃侧链的包容作用以及环外壳上的羟基与药物对映体分子发生氢键作用。在3种类型的环糊精中β,2环糊精对形成包容络合物有最佳大小的内腔,适用于大多数药物对映体的位阻和电子

α特征,因此广为使用。2环糊精适合于分子量

小于200的药物对映体的分析,而γ2环糊精则更适用于较大分子药物的分析,如含有稠环的药物。

Berthed[11]用商品β2CD柱和γ2CD柱拆分了25种不同类型的手性药物,其中有11种对

β映体间的RSΕ115。2CD柱还被用于体液中

布洛芬对映体的分析。Vigh等用β2CD分析柱,通过替代色谱的方式对甲基苯巴比妥和环己巴比妥的对映体进行了半制备分离,负载量可达4～6μmol。Haginaka等[12]研究了一种有双重功能的特殊CSP。将β2环糊精固定在新近发展SHP的填料上β,2环糊精不位于微孔中,而是与亲水的32甘油基氧丙基相一起结合在表面上。这种CSP带有亲水基团,可防止蛋白质的沉淀,同时又带有手性基团识别,可分离对映体。这种CSP可直接进样用于血清中药物对映体的分析。

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90年代以来,又制备出一系列衍生化CD

γ键合固定相,如乙酰化αβ,,2CD,对甲苯酯β2

CD,氨基甲酸酯β2CD及萘乙基氨基甲酸酯β2CD等。CD衍生化提高了手性识别能力。已研制的天然CD及CD衍生物键合固定相大部分已有Astec,E.Merck等公司商品供应。用环糊精手性固定相在HPLC中分离药物对映体一般用含甲醇、乙醇或乙腈作有机改性剂的缓冲溶液为流动相。最近Chang等[13]提出了一种新型的流动相(MeCN,MeOH,HOAc,TEA),突破了传统的正相或反相模式,20多种过去难以分离的手性药物达到基线分离。2.1.4　纤维素和多糖衍生物手性固定相　纤维素是含有葡萄糖单元的线形聚合物。由于葡萄糖单元有手性,因此可直接或经衍生化用作CSP。纤维素衍生物一般由纤维素和相应的酰

下,可完全拆分烯丙洛尔、普洛萘尔和心得平。Küsters等[17]用ChiralcelOD柱不仅对环氧化物进行了制备分离,而且还考察了ChiralcelOD,OJ,OC柱在不同的流动相和温度下对7种茶碱类手性药物的分离情况[18]。用ChiralcelOJ柱,Klemish等[19]成功地分离了抗

梦幻药物CI2943。Lanchote等[20]对血浆中的脉律定进行了测定。纤维素衍生物作CSP常用的流动相为甲醇—水、乙醇、乙醇—水、正己烷—异丙醇。其他多糖如木聚糖、聚氨基葡萄糖、糊精等苯基氨基甲酸酯衍生物也可涂渍在硅胶上形成CSP。这类CSP有应用范围广和样品容量高的优点;缺点是柱效低,有些溶质显示不可逆吸附,且多为涂渍柱,易流失,所用溶质有一定。2.1.5　合成手性聚合物CSP　合成手性聚合物CSP的制备目前使用最多的是以下两种途径:(1)在手性条件下不对称聚合,如用手性催化剂;(2)用手性单体。用这两种技术,可制备有手性识别的等规聚合物,如聚甲基丙烯酸三苯甲酯、甲基丙烯酸二苯222吡啶甲酯、聚酰胺等。它们的手性来源于聚合物的左旋或右旋定向螺旋型结构,这类手性聚合物可涂渍或键合到硅胶上,作为CSP。光学活性聚氨酯类主要用于分离含有芳香基团的外消旋体,如联二萘酚和反式环醚或环烷基二苯酯类。有螺旋链的聚甲基丙烯酸三苯基甲酯(PTrMA)涂敷在烷基化硅胶表面,在较广的范围内可对消旋物进行有效分离。这类聚合物CSP柱容量和柱效都较高,且可改变流动相改性剂,提高其手性选择性,然而被分离药物须有严格的立体构型要求。2.1.6　冠醚类键合相　冠醚类化合物有亲水性内腔和亲脂性外壳,可键合在硅胶或聚苯乙烯基质上制成手性固定相。根据主2宾化学原理,主要用于一些含有能够质子化的伯胺功能团的药物对映体的分离,尤其是一些氨基酸及其衍生物的分离。流动相多用过氯酸水溶液中加入一定比例(Φ5%)的甲醇调解。

氯或异氰酸酯作用制取。1973年Hesse和Hagel[14]首次报道了三醋酸纤维素酯有极好的分离芳香族化合物对映异构体的能力。此后许多纤维素三酯类衍生物如三苯甲酰基酯(CTB)和三苯基氨基酯都被涂敷在大孔硅胶上用作手性固定相,它们有直接分离许多对映异构体的能力。该类固定相的手性识别主要来自氨基甲酸酯或酯的部位与被拆分物之间形成氢键或偶极2偶极作用,也可能通过被拆分物分子进入纤维素网状腔,导致腔内立体环境的改变而实现。日本Daicel化学工业公司开发了一系列由纤维素衍生物制备的手性柱,ChiralcelOJ,OA,OB,OK,CA21,OD,OC,OG,OF柱以及ChiralpakAD,AS柱等。这些商品化的手性柱在药物对映体分析方面有很大应用前景。

这类手性柱中,ChiralcelOD柱即纤维素2三(3,52二甲基苯基甲酸酯)手性固定相和ChiralcelOJ柱即纤维素2三(42甲基苯基甲酸酯)手性固定相近年来应用较多。Aboul2Enein用ChiralcelOD柱成功分离了噻吗洛尔两对映体之后,又对β2阻滞剂萘羟心安[15]及茚心安[16]进行了良好的分离。Masurel等用半制备的ChiralcelOD柱对异环磷酰胺进行了手性制备分离,Okamoto等用其制备柱,在1次过柱

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2.1.7　其他手性固定相　如配体交换色谱

(LEC)手性固定相。这类CSP分离药物对映

体是基于固定相手性配体、金属离子与被分离溶质对映体形成的多元配合物热力学稳定性的差异和动力学的可逆性。适用于HPLC的硅胶键合手性LECCSP是由Gübitz等人[21]发展起来的,键合的配体分别为L2脯氨酸、组氨酸、酒石酸、丙二胺麻黄碱等。何炳林[22]等在聚乙烯胺树脂上经化学反应引入L2氨基酸,并与铜离子络合生成高分子手性树脂,有效拆分了

DL2苯丙氨酸、DL2组氨酸和DL2色氨酸。

脱液中回收,但其缺点是系统平衡时间较长,添

加剂消耗较大,某些添加剂欠稳定且往往干扰检测。常用的手性添加剂有环糊精类手性试剂、手性冠醚、手性蛋白质及氨基酸、配位体金属离子交换剂、手性离子对试剂、手性氢键试剂等。

环糊精类用作手性流动相添加剂的作用原

β理与其用作手性固定相相同。2CD及其衍生

物对巴比妥类、乙内酰脲类有显著的立体选择性,已用于分离氨基酸及其衍生物、巴比妥类、氯噻酮、苯妥英代谢物、叔丁喘宁、美芬妥因及其代谢物、哌嗪类镇痛药、甲基炔诺酮、伪麻黄

γ碱、172酮甾体、去甲羟基安定等[27]。2CD用

于分离甲基炔诺酮、甾体类药物[28]。最近,Deng等[29]建立了一种新的方法,用反相色谱柱,流动相为25mol・L-1磷酸钠和3%的乙腈,以β2环糊精为流动相添加剂,并在流动相中加入离子对试剂12庚烷磺酸钠,用InertosilODS23柱分离测定了人脑及一些食物中的两种重要的生物碱6,72二羟基212甲基21,2,3,42四氢异喹啉(salsolinol)和6,72二羟基21,22二甲基21,2,3,42四氢异喹啉(N2methylsalsolinol)的对映体。在以β2CD为CMPA的分析系统中,多以磷酸盐或醋酸盐缓冲液添加一定比例的甲醇为溶剂,而在β2CD衍生物为CMPA的分析系统中,溶剂为一定比例的甲醇—磷酸水溶液。用的固定相常为ODS,CN,C8,苯基,硅胶等。

有机酸或碱能与离子对试剂在流动相中反应生成低极性不解离的离子对,但反相离子对色谱很少直接用于手性药物的分离,正相离子对色谱广泛用于药物对映体的分离。常用的手性反离子有奎宁、奎尼丁、102樟脑磺酸、N2苯甲酰氧基羰基2甘氨酸2L2脯氨酸。被分离的药物有β2阻滞剂、奎宁、奎尼丁、羧酸、磺酸、甲氟嗪、苯丙酰苯心安等。酒石酸衍生物作为离子对试剂,近年来也被用于氨基醇类和胺类药物的分离。常用的固定相有硅胶、CN及Diol等。两性离子对色谱也用于拆分一些药物对映体。

据报道β2CD与手性离子对合用可增加难分离对映体的立体选择性[30]。

最近,Knox等[23]制备了一种新型手性固

定相,在多孔石墨上吸附单分子层N2(22萘2磺酰)2苯丙氨酸之DL异构体的铜络合物,拆分了α2氨基酸和α2羟基酸,分离度大于2。Armstrong将大环抗菌素键合到硅胶上,这类

手性固定相通用性很强,容量也很高,已用于多种药物对映体的制备。Machida等[24]以酒石酸酐为原料,以p2氯苯基取代异丙基,并键合到三甲基硅烷基化硅胶上,对芳香族、脂肪(环)族醇及β2氨基醇类药物有很好的手性识别能力。L󰂞mmerhofer等[25]将奎宁氨基甲酸酯吸附到硅胶表面上,作为手性CSP,通过条件优化,使7种氨基酸:丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苏氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸的对映体同时达到基线分离。

周华等[26]设计和制备了一种新型手性固定相。该固定相以构象刚性的L2脯氨酸为手性选择子,经引入保护基、萘酰胺化、加氢脱保护基、酰胺化和与LiChrosorbNH25μm微粒硅胶偶联等5步反应而制得。拆分了4种N23,52二硝基苯甲酰2DL2氨基酸甲酯的对映体,选择性在1104～1118之间。2.2　手性流动相添加剂(CMPA)　手性流动相添加剂也是直接对药物对映体进行有效拆分的一种有力工具。其分离原理是在药物对映体与加入到流动相中的手性添加剂间形成暂时非对映异构体复合物,然后用非手性柱将其拆分。CMPA操作简便,分析过程较少发生消旋化,添加剂选择的范围较宽,纯异构体易从柱后洗

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手性冠醚主要用于胺类药物对映体的分

离。如在流动相中同时加入环糊精和冠醚,二者可产生协同作用而使手性药物得到更好的分离。

手性蛋白质及氨基酸类(如胆酸、牛血清蛋白以及α12酸性糖蛋白等)作为手性添加剂,可通过疏水性、静电、氢键和电荷转移等反应,形成蛋白质2溶质复合物分离药物对映体。已用于分离氨基酸、羧酸、疏水性胺类等。一般用含水溶剂作流动相,固定相是经修饰的中等粒度的硅胶。

配位体金属离子添加剂分离药物对映体的基本原理是在流动相缓冲溶液中加入金属离子和配位体交换剂形成二元络合物,药物对映体再与其形成稳定性不同的三元络合物而达到手性分离。配合交换系统使用水性流动相。流动相中加入有机修饰剂(乙腈、甲醇),可缩短疏水性药物的保留时间,并提高分离度。常用的手性配合试剂多为氨基酸及其衍生物,如L2脯氨酸、L2苯丙氨酸等。配位金属有Cu2+,Zn2+,Ni2+,Cd2+等。该法已用于分离氨基酸及其衍生物、苯妥类代谢物、多巴胺、氨基醇等。用L2苯丙氨酸和CuSO4为手性流动相添加剂,曾苏等[31]建立了测定人尿中氧氟沙星对映体的RP2HPLC拆分方法,并在反相HPLC制备柱上,拆分了氧氟沙星的两种对映体,制备获得的两种对映体的光学纯度均大于99%。Hsieh等[32]以辛基2L2脯氨酰胺+Ni2+为手性流动相添加剂,分离了用于治疗癫痫病的药物对羟苯基苯海因p2hydroxyphenylphenylhydantoin(p2HPPH)。近年来发展了一些新的配位体系作为CMPA,如去甲麻黄碱及其衍生物2Cu2+用于分离氨基酸,聚胺2Cu2+用于分离氨基酸、巴比妥类手性药物。

手性氢键试剂如N2乙酰基2L2缬氨酸2四丁酰胺,N’2双异丙基酒石酸酰胺也可用作手性流动相添加剂。药物对映体基于分子间的弱作用力氢键而被分离,需使用低极性的有机流动相。该类试剂已用于分离巴比妥类、氨基酸

(-)2反式21,22二氨基环己烷、及其衍生物、氨

基醇等。

此外,还有一些手性诱导剂也可作为流动相添加剂。将手性诱导剂加到流动相中,利用诱导吸附的原理,可与对映体分子共同竞争性地吸附到非手性固定相表面,发生立体反应形

α成不稳定的非对映体对复合物。如(-)22甲苄胺,在硅胶柱上可拆分22氨基庚烷。

用直接法,大多数药物对映体在分离前不需进行手性衍生化反应,适用于药物对映体的质量控制和质量管理。但也存在局限性,如手性流动相添加剂的性质、流动相浓度的条件和分离温度等均影响其手性识别,需进行条件优化。直接法中,CSP和CMPA合用,即在固定相上选用能与一种构型的待测对映体结合强的手性选择剂,而在流动相中选用能与另一种构型的待测对映体结合较强的手性选择剂,可以使对映体选择性得到极大的提高。3　其他方法3.1　非手性衍生化技术　某些药物在进样手性柱分析之前,应将其衍生化以降低基团活性,改善色谱行为。所需衍生化试剂与间接法中的不同,不必有高光学纯和手性。某些药物如胺类、酸类等如果直接进样于手性柱,由于它们的游离基团与固定相之间较强的作用,致使色谱行为差,甚至不能分离。Wainer等将普奈洛尔与碳氯进行简单衍生化反应形成　唑烷酮衍生物,可很好地测定其在血清中的两种对映体。

早期的衍生化反应多在溶液中进行,其弊端是必须通过萃取除去衍生化溶液中大量未反应的衍生化剂,操作繁复。最近,一种非手性固相衍生化试剂得到发展和应用,其原理与间接法中介绍的手性固相衍生化技术相似。Bourque等[33]研究了两种用于强或弱碱性药物衍生化的固相试剂,固定有3,52二硝基苯甲酰基。因其标记头是一种强(酸,手性药物能在Pirkle型柱中得以分离。经pH调节后,待分析的样品可直接注向离线固相衍生化试剂中,一定时间后把衍生物洗脱出来,再进手性柱分离。用聚合的3,52二硝基苯甲酰基标记的苯并试剂作离线衍生化后,能分析尿中的苯丙胺。

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此外,体液中的胺类、氨基醇类、氨基酸类利用

此技术也得到了分离。此方法可替换溶液相衍生化方法。

Bourque等[34]最近又报道了氨基甲酸酯类固相衍生化试剂用于手性胺类或醇类药物的测定,衍生化产物为3,52二硝基苯甲酰胺或酯,可在Pirkle型萘尿类CSP上进行对映体的分离。首先将3,52二硝苯基异氰酸酯作为一种活性氨基甲酸酯固定到聚合材料上,这种固定的聚合试剂在碱性介质中分解出少量的3,52二硝苯基异氰酸酯。由于活化的氨基甲酸酯因疏水性而阻止通过聚合基质,了与分析物反应的试剂消耗,因此,在自动分析中,试剂能反复地用于有效地衍生化。另外,由于低浓度时聚合物骨架上只释放氨基甲酸酯,因此它不存在溶液相衍生化方法中用氨基甲酸酯试剂所观察到的二聚作用或交叉反应等一系列问题。3.2　手性柱联用技术　在许多情况下,CSP法不能直接应用于体内手性药物分析。一种新的分离测定方法非手性柱2手性柱联用技术近几年来得到较快发展。该技术是先利用一个非手性柱将生物样品中的手性药物与内源代谢物分离或多个手性药物相互分离,然后流出液通过一切换阀或直接进入一手性柱中,使药物对映体各自得以分离[35]。用非手性柱2手性柱联用技术不仅能提高手性固定相的分离能力,而且通过峰积压效应可克服由单纯手性分离所造成的峰展宽,并能延长柱的使用寿命。该技术已被用于多种手性药物的体内分析,如血浆中特布他林、甲氟嗪、唯拉帕米、酮洛芬,血清中的亚叶酸、心得怡、吡嗪哌酯以及环磷酰胺,尿中的佐匹克隆及其代谢物[36]、氯噻酮[37]等。单个的手性柱有时在同时分离多种手性药物时会有较大的局限性,而若用两个手性柱联用且流动相变换技术,使两手性柱有各自系统的流动相,则会提高分离效能。Oda等[38]将能用于直接进样的抗生物素蛋白柱和普通的卵类粘蛋白柱联用,可分析氟卡尼及其手性代谢物。最近,Pichini等[39]将两个手性柱ChiralcelODR柱串联,同时分离了血浆中的氟苯氧丙胺和去甲氟

苯氧丙胺的对映体,这种方法对今后氟苯氧丙胺和去甲氟苯氧丙胺的药效学和药动学的研究大有帮助。多种方法合理组合运用常常有利于问题的解决[40]。4　展望

随着社会经济的发展和人类生活水平的提高,人们对身体健康的重视程度逐渐提高,对药品的质量要求也愈来愈高,药物对映体的分离测定愈来愈显示出其重要意义。近些年来,HPLC法已迅速成为药物对映体分离和测定的有效工具,可覆盖约40%的药物。虽然用于大规模工业化生产还存在相当大的距离,但手性HPLC法也已逐渐用于药物对映体的制备和半制备,不仅大大促进了手性药效学、药动学等方面的研究,为手性新药的研制提供了有效的分析手段,而且解决了以药物纯异构体供药的难题,为人类的健康和生命质量的提高作出了很大贡献,因而有广阔的应用前景,必将在新世纪人类卫生事业中发挥巨大的作用。

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欢迎订阅1999年《中草药》杂志

《中草药》杂志经国家科委和国家新闻出版署批准,由国家医药管理局中草药信息中心站主办,国家医药管理局天津药物研究院出版。《中草药》是级的药学科技学术刊物,月刊,国内外公开发行。

本刊1992年荣获国家科委、宣传部、国家新闻出版署组织的全国优秀科技期刊评比一等奖;1997年荣获第二届全国优秀科技期刊评比二等奖;1991年荣获国家医药管理局医药情报成果一等奖;1990年、1993年、1995年和1997年四次荣获天津市优秀期刊奖;1995年获华北地区优秀期刊奖。经天津市自然科学期刊评估委员会评估,本刊分别被评为天津市1995年度、1997年度一级期刊,本刊为

1992年～1993年中国自然科学核心期刊,位居300种核心期刊之24位,为中药学期刊之首。本刊名列

“药学类核心期刊”第3位。据中国科学引文数据库1996年数据统计,本刊被列入“被引频次最高的中国科技期刊500名排行表”,名列第20名,医药卫生类期刊的第7名。本刊主要报道中草药化学成分;药剂工艺、生药炮制、产品质量、检验方法;药理实验和临床观察;药用动、植物的饲养、栽培、鉴定和资源调查等方面的研究论文,并辟有综述、短文、新药开发纵谈、新产品、企业介绍、学术动态、信息等栏目。重点科研论文附英文摘要或以英文全文刊登。

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