一种基于探针捕获富集的快速构建靶核酸测序文库的方法和试剂盒[

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 107236729 A(43)申请公布日 2017.10.10

(21)申请号 201710534788.8(22)申请日 2017.07.04

(71)申请人 上海阅尔基因技术有限公司

地址 200433 上海市杨浦区政立路477号同

和国际大厦B座301-303室(72)发明人 陈云弟　罗俊峰　陈薇　赵萱　

柴映爽　(74)专利代理机构 上海新天专利代理有限公司

31213

代理人 龚敏(51)Int.Cl.

C12N 15/10(2006.01)C12Q 1/68(2006.01)C40B 50/06(2006.01)

()发明名称

一种基于探针捕获富集的快速构建靶核酸测序文库的方法和试剂盒(57)摘要

本发明公开一种基于探针捕获富集的快速构建靶核酸测序文库的方法和试剂盒，所述方法

基因包括以下步骤和完成这些步骤所需的试剂：

组DNA片段化；DNA末端修补；探针与热变性形成的单链DNA片段进行分子杂交；生物素-亲和素磁珠分离；以探针为引物进行引物延伸，合成互补链；双链DNA片段一端连接接头，另一端不连；PCR扩增；DNA片段长度选择；完成以上各步反应所使用的试剂。与现有的各类靶核酸富集技术相比，本发明提供的方法具备以下优势：1)保真性好2)重现性好3)速度快4)通用性强。CN 107236729 A权利要求书2页 说明书8页 附图1页

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1.一种基于探针捕获富集的快速构建靶核酸测序文库的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤和完成这些步骤所需的试剂：

1)基因组DNA片段化；2)DNA末端修补；

3)探针与热变性形成的单链DNA片段进行分子杂交；4)生物素-亲和素磁珠分离；5)以探针为引物进行引物延伸，合成互补链；6)双链DNA片段一端连接接头，另一端不连；7)PCR扩增；

8)DNA片段长度选择；

9)完成以上各步反应所使用的试剂。

2.根据权利要求1所述的一种基于探针捕获富集的快速构建靶核酸测序文库的试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有：

1)酶切消化DNA片段化试剂，或者超声波破碎DNA片段化试剂；2)DNA末端修补试剂；3)探针杂交试剂；

4)亲和素磁珠分离试剂；5)引物延伸试剂；6)接头连接试剂；7)PCR试剂；

8)磁珠法或者琼脂糖凝胶切割法DNA片段长度选择试剂。

3.根据权利要求1所述的基于探针捕获富集的快速构建靶核酸测序文库的方法和试剂盒，其特征在于包括：

1)所述的1)基因组DNA片段化，可以用超声波破碎法或者酶切消化法；2)所述的3)探针杂交，其中探针可以是DNA，也可以是RNA，从5’端到3’端，探针依次包含以下4种元件：(a)生物素标记，(b)PCR扩增引物，该序列在后续的高通量测序步骤中也用于与流动槽内表面的寡核苷酸片段杂交，(c)测序引物，(d)靶核酸杂交探针；

3)所述的6)接头连接，其中接头包含以下4种元件：(a)PCR扩增引物，该序列在后续的高通量测序步骤中也用于与流动槽内表面的寡核苷酸片段杂交；(b)4种碱基任意排列、任意长度的标签；(c)测序引物；(d)3’端单链突出的一个碱基T；

4)所述的7)PCR扩增，其一端引物为接头所带的，另一端引物为探针所带的；5)所述的8)DNA片段长度选择，用磁珠法或者琼脂糖凝胶电泳切割法。

4.一种根据权利要求2或3所述的基于探针捕获富集的快速构建靶核酸测序文库试剂盒的应用，是应用于全外显子组测序和基因panel靶向测序。

5.根据权利要求2或3所述的基于探针捕获富集的快速构建靶核酸测序文库试剂盒的使用方法，其特征在于包括下述步骤：

1)用所述的1)酶切消化DNA片段化试剂，或者超声波破碎DNA片段化试剂对基因组DNA进行片段化；

2)用所述的2)DNA末端修补试剂修补DNA片段的末端；

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3)用所述的3)探针杂交试剂后进行探针杂交；

4)用所述的4)亲和素磁珠分离试剂分离探针所捕获的外显子片段或者靶片段；5)用所述的5)引物延伸试剂进行引物延伸；

6)用所述的6)接头连接试剂进行单端接头连接；7)用所述的7)PCR试剂进行PCR扩增；

8)用所述的8)磁珠法或者琼脂糖凝胶切割法DNA片段长度选择试剂进行DNA片段长度选择；

9)对富集得到的外显子或者靶核酸文库进行二代高通量测序；10)对测序结果进行分析，获得受试者的靶核酸基因变异信息。

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一种基于探针捕获富集的快速构建靶核酸测序文库的方法和

试剂盒

技术领域

[0001]本发明属于高通量基因测序技术领域。

技术背景[0002]相对于经典的Sanger测序，高通量基因测序又称二代测序、下一代测序(next generation sequencing,NGS)。相应的，Sanger测序也叫一代测序。全外显子组测序和panel测序都属于靶向基因测序，是二代测序的重要分支技术，主要目的有二：一是为了节省测序费用，因为全外显子组只占全基因组大小的1％，各种panel所针对的目标靶区域更小；二是为了降低生物信息学数据分析的难度，加快分析速度，因而在基础研究、临床科研、临床诊断和新药研发等各领域得到广泛应用。

[0003]目前已有的外显子测序和靶向测序产品主要有4家品牌：安捷司的SureSelect和HaloPlex，罗氏公司的NimbleGen，Illumina公司的TruSeq和Nextera(基于转座子技术)以及IDT公司的全外显子panel。其中基于转座子的Nextera技术尽管速度快，但是数据质量稍有瑕疵。其他外显子测序技术都包括全基因组文库构建和外显子区域片段捕获富集两个环节，步骤繁多，耗时长；由于反应和纯化的环节较多，导致DNA的损失比较大，因而对模板基因组DNA的量的要求都比较高。[0004]对于panel测序，主要有两种技术路线：探针杂交测序和多重PCR扩增子测序。具体选择哪种方法合适，取决于所需检测区域的大小。如果靶区域比较小，2千到3千对引物就能覆盖，通常选择操作比较简便的多重PCR扩增子测序技术；否则，选择流程比较复杂的探针杂交技术。

发明内容

[0005]本发明提供一种基于探针捕获富集的快速构建靶核酸测序文库的方法和试剂盒，包括两个部分：建库方法和建库试剂盒。本发明可以改善目前外显子测序和基因panel靶向测序检测方法的数据质量，降低难度，提高检验速度，可以实现自动化，使高通量基因检验更加快速和准确。

[0006]本发明所采取的技术方案是：

[0007]一种基于探针捕获富集的快速构建靶核酸测序文库的方法，其中方法部分包括以下步骤：

[0008]1)基因组DNA片段化；[0009]2)DNA末端修补；

[0010]3)生物素标记的探针与热变性形成的单链DNA片段进行分子杂交；[0011]4)亲和素磁珠分离探针捕获的DNA片段；[0012]5)以探针为引物进行引物延伸，合成互补链；[0013]6)双链DNA片段一端连接接头，另一端不连；

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7)PCR扩增；

[0015]8)DNA片段长度选择。

[0016]本发明还提出了一种基于探针捕获富集的快速构建靶核酸测序文库的试剂盒，包括以下试剂：

[0017]1)酶切消化DNA片段化试剂，或者超声波破碎DNA片段化试剂；[0018]2)DNA末端修补试剂；[0019]3)探针杂交试剂；

[0020]4)亲和素磁珠分离试剂；[0021]5)引物延伸试剂；[0022]6)接头连接试剂；[0023]7)PCR试剂；

[0024]8)磁珠法或者琼脂糖凝胶切割法DNA片段长度选择试剂。[0025]其中方法部分的以下3个步骤，技术上存在多种可选项，任选其中一种都能实现相同的目的：

[0026]1)所述的1)基因组DNA片段化，可以用超声波破碎法，也可以用酶切消化法；[0027]2)所述的3)探针杂交，探针可以是单链DNA，也可以是单链RNA；[0028]3)所述的8)DNA片段长度选择，方法可以用磁珠法，也可以使用琼脂糖凝胶电泳切割法。

[0029]本发明还提供了基于探针捕获富集的快速构建靶核酸测序文库试剂盒在全外显子组测序和基因panel靶向测序中的应用，包括下述步骤：[0030]1)用所述的1)酶切消化试剂，或者超声波破碎试剂，对基因组DNA进行片段化；[0031]2)用所述的2)DNA末端修补试剂修补DNA片段的末端；[0032]3)用所述的3)探针杂交试剂后进行探针杂交；

[0033]4)用所述的4)亲和素磁珠分离试剂分离探针所捕获的外显子片段或者靶片段；[0034]5)用所述的5)引物延伸试剂进行引物延伸；

[0035]6)用所述的6)接头连接试剂进行单端接头连接；[0036]7)用所述的7)PCR试剂进行PCR扩增；

[0037]8)用所述的8)磁珠法或者琼脂糖凝胶切割法DNA片段长度选择试剂进行DNA片段长度选择。

[0038]9)对富集得到的外显子或者靶核酸文库进行二代高通量测序；[0039]10)对测序结果进行分析，获得受试者的靶核酸基因变异信息。[0040]11)本发明所提供的新型探针捕获杂交技术，在操作流程的简便性方面达到了扩增子测序的水平，集中了二者的长处，既保持了探针杂交的精密度，又达到了扩增子测序的简便性，而且没有因此增加额外的缺点。

[0041]12)与现有的各类靶核酸富集技术相比，本发明提供的方法具备以下优势：[0042]13)1)数据质量高，保真性好。由于PCR循环次数减少1/3，显著降低PCR扩增引入的人为偏差(bias)。

[0043]14)2)成功率高，重现性好。技术路线简捷明了，反应步骤减少，集中了探针杂交捕获技术的精密度和扩增子测序技术的简便性，把探针杂交测序技术的难度降低到扩增子测

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序的水平。

[0044]15)3)速度快。文库构建时间缩短1/3，项目周期缩短。[0045]16)4)通用性强。所述方法基于Illumina平台，经过适当优化即可兼容ThermoFisher高通量测序平台和自动化工作站。附图说明

[0046]图1探针结构示意图。[0047]图2接头结构示意图。

[0048]图3快速靶核酸测序文库构建流程图。

具体实施方式[0049]实施例1 CFTR基因外显子区域富集测序[0050]1)基因组DNA片段化

[0051]超声波破碎和酶切消化两种方法都可以实现满意的基因组DNA片段化效果。本实施案例采用NEB公司的NEBNext dsDNA Fragmentase酶切消化方法。[0052]1)在0.2mL PCR管中按比例加入下列组分，总体积10μL，稍微涡旋震动混匀3sec，无热盖37℃孵育35分钟；

[0053]

[00][0055][0056][0057][0058]

2)在PCR管中加入合适体积的磁珠，稍微涡旋混匀，稍微离心，室温放置5分钟；3)在磁力架上放置5分钟；4)在磁力架上，移除管中的上清液，保留5μL溶液，避免触动磁珠沉淀；5)在磁力架上，加入160μL新鲜配制的80％乙醇，静置30sec，移除160μL洗涤液；6)重复：在磁力架上，加入160μL新鲜配制的80％乙醇，静置30sec，移除160μL洗涤

液；

7)低速离心30sec，在磁力架上小心移除余液，室温晾干(避免磁珠沉淀开裂)；

[0060]8)用21μL TE重新悬浮磁珠，吹吸5-6次，室温静置1分钟，置于磁力架上5分钟，将20μL上清液移入新的PCR管中，4℃备用，也可以-20℃保存1周。

[0061]2.预先将亲和素磁珠M280与生物素标记的CG-p3进行饱和结合，形成CG-M280磁珠，在磁力架上静置5分钟，移去上清，用TE溶液洗涤磁珠沉淀两次，用TE溶液调整浓度为1μg/μL备用，

[0059]

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其中CG-p3:5-TCGTGTAGGGAAAGAGTGT-Biotin。3.杂交延伸

合成下表中的探针序列，其中的4个N称之为SID

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以上探针按照等分子数混合形成CG-probe mixture，最终调整为0.75fmol/μL

[0069]按照下列体系配置溶液:[0070]纯化后的DNA片段：20μL[0071]CG-probe mixture(0.75fmol/μL)：3μl[0072]NEBuffer 2(10X):5μl[0073]dNTP(10mM each):0.5μl(0.1mM final)[0074]Sterile H2O:18.5μl[0075]混合均匀后，95度5分钟，52度10分钟，降至37度，加入[0076]Klenow Fragment(3′→5′exo–)(NEB M0212):3μl[0077]继续孵育30分钟，然后加入10μl CG-M280磁珠，52度10分钟，置于磁力架上室温放置5分钟，TE溶液洗涤两次。[0078]4.连接adaptor[0079]CG-p1：5-AGACGTGTGCTCTTCCGATCddT-3[0080]CG-p2-1(其中的6个N称之为MID)：

[0068][0081]

GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3[0082]两者退火形成CGdaptor，并调整浓度为1pmol/μl[0083]将下列成分加入到含有CG-M280磁珠的PCR管中[0084]Quick Ligase Reaction Buffer(2X)：10μl[0085]Quick Ligase(NEB M2200)：1μl

[0086]CGdaptor(每个样本一种CGdaptor):1μl[0087]Nuclease-free Water：8μl[0088]混合均匀后，在25度条件下孵育10分钟，在磁力架上静置5分钟，用TE溶液洗涤两次，用20μl去离子水悬浮磁珠，准备进行PCR扩增。[00]5、PCR扩增

[0090]CG-p5:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGA[0091]CG-P7:CAAGCAGAAGACGGCATACGA[0092]CG-M280磁珠悬液:20μL[0093]CG-p5Primer(10μM):2.5μL[0094]CG-p7Primer(10μM):2.5μL[0095]Kapa Hifi mix:25μL[0096]PCR循环设置如下：

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SampleCG-Lib74CG-Lib71CG-Lib77CG-Lib73CG-Lib70CG-LibCG-Lib42CG-Lib69CG-Lib41CG-Lib65CG-Lib40CG-Lib43CG-Lib39CG-Lib38

按照常规方法进行PCR产物纯化，并测定产物浓度5.测序与数据分析

1)我们将PCR产物进行二代高通量测序，测定index时需要进行13个循环；2)分析时需要MID和SID标签进行分组，以获得更多的目标片段多样性3)数据比对分析如下图所示：

GeneCFTRCFTRCFTRCFTRCFTRCFTRCFTRCFTRCFTRCFTRCFTRCFTRCFTRCFTR

MeanDepth1178.261410.1112.881286.421206.91709.251371.361511.6214.997.011481.972476.681568.281718.91

5x99.96％100.00％100.00％100.00％99.93％100.00％100.00％100.00％100.00％99.87％100.00％100.00％100.00％100.00％

20x98.65％99.43％99.35％99.75％99.26％99.87％99.47％99.87％100.00％99.76％100.00％100.00％100.00％100.00％

50x97.06％98.08％98.23％98.80％98.44％98.42％98.17％98.78％99.33％99.59％100.00％99.90％99.73％99.74％

100x94.43％94.57％94.91％95.95％96.28％97.06％97.21％98.00％98.43％98.53％99.15％99.42％99.45％99.69％

Duplicate Rate24.85％31.41％25.78％37.％30.23％33.33％38.08％34.56％25.86％28.20％25.32％39.19％26.39％26.53％

Mapping Rate99.85％99.82％99.84％99.％99.88％99.85％99.88％99.％99.84％99.85％99.83％99.79％99.80％99.79％

On Target Rate30.31％29.61％30.52％30.75％30.71％30.17％36.08％31.58％30.51％30.97％30.68％30.57％30.78％30.24％

总共14个测序文库，平均深度为1384.66x，其中50x深度下平均覆盖率为98.88％，

100x深度下平均覆盖率为97.36％，说明我们能很好的获得CFTR的基因信息。[0106]综上，本发明利用探针进行目标区域捕获富集的快速构建第二代高通量测序文库的方法，称之为AccuraSeq，可用于全外显子组测序或特定区域序列的靶向测序，本发明步骤包括：1)用于捕获和富集靶核酸的DNA或RNA探针的设计方法，从5’端到3’端，探针包括生物素标记、扩增引物、测序引物、靶核酸杂交探针共4个区域(如附图1所示)；2)靶核酸的大规模捕获与富集方法；3)用于构建靶核酸高通量测序文库的试剂盒；4)检测靶核酸的方法。本发明的应用包括以下步骤：1)用超声波破碎法或者酶切消化法对基因组DNA进行片段化；2)用酶学方法修补双链DNA片段的末端；3)探针与DNA片段进行分子杂交；4)用亲和素磁珠分离、纯化探针捕获的DNA片段；5)以探针为引物进行引物延伸，合成互补链；6)用酶学方法

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在双链DNA片段的一端连上接头，另一端不连，双链接头包括PCR扩增引物、标签序列(barcode)、测序引物、3’端单链突出一个碱基T共4种元件(如附图2所示)；7)PCR扩增；8)对PCR产物进行DNA片段长度选择，得到终文库(如附图3所示)。与现有的各类靶核酸富集技术相比，本发明提供的方法具备以下优势：1)保真性好，提高数据质量：PCR循环次数减少1/3，显著降低PCR扩增引入的偏差(bias)；2)重现性好，提高检验成功率：流程简明快捷，反应步骤减少，既保持了探针杂交捕获技术的精密度，又拥有了扩增子测序技术的简便性；3)速度快，缩短项目时间：文库构建所需时间缩短1/3；[0107]4)通用性强，兼容各类高通量基因测序平台：所述方法基于Illumina平台，经过适当优化即可兼容Thermo Fisher平台和自动化工作站。

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