DNA的定量分析

1.原理

DNA定量分析是DNA分子操作过程中一个必不可少的过程，常用的有两种方法。

（1）紫外光谱分析法。核酸分子（DNA或RNA）由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，260nm处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸浓度成正比。核酸分子的单链、双链之间的转换，对光吸收水平有一定影响，但其偏差可用特定的公式进行校正。

（2）EB荧光分析法。EB即溴化乙锭，它能插入DNA或RNA的碱基对平面之间并与之结合，结合后能在紫外光的激发下产生橘黄色荧光。荧光强度与被结合 的EB的量成正比，而被结合的EB的量又与核酸分子长度和数量成正比，所以荧光强度可以初步代表DNA含量。该方法经济简便，但准确性较低。

2. 材料

（1）DNA标准液。

（2）EB储存液（10mg／ml）。

（3）5×SDS加样液：50％甘油；0.5％SDS；0.1mol／L EDTA；0.1％溴酚蓝；0.1％二甲苯青FF。

（4）0.1×TE溶液。

（5）主要设备：紫外分光光度仪；琼脂糖凝胶电泳设备。

3. 方案

3.1 紫外光谱分析法

（1）用 0.1×TE对待测 DNA样品按 1:20或合适倍数稀释。

（2）用 0.1×TE作空白对照，在波长为 260 nm、280 nm和 310 nm处调零时使用。

（3）在三种波长下测量稀释好的DNA溶液的OD值。

（4）根据OD值计算DNA浓度（ug／mL）。公式如下：

单链 DNA ［ssDNA］＝33×（OD260－OD310）×稀释倍数

双链 DNA ［dsDNA］＝50×（OD260－OD310）×稀释倍数

单链 RNA ［ssRNA］＝40×（OD260－OD310）×稀释倍数

常见问题及注意事项如下：

（1）OD310值是背景，若溶液盐浓度越高，OD310值也越高。

（2）DNA的 OD260／OD280约为1.8，若高于1.8则可能有RNA污染，低于1.8则可能有蛋白质污染。

3）RNA的OD260／OD280值大约为2.0。

3.2 EB荧光分析法

（1）琼脂糖凝胶的制备。用含0.5ug／mL EB的1×TAE配制1％的微型琼脂糖凝胶。

（2）样品的准备。把待测DNA样品进行1:2连续稀释；并准备一份DNA标准品作对照用。

（3）上样。各稀释样品与加样缓冲液按5:1混匀后上样。

（4）电泳。100 V稳压电泳至溴酚蓝达到凝胶的 3／4处。

（5）紫外灯检测。肉眼可见到的最高稀释度约含DNA80 ng。