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DNA的定量分析

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1.原理

DNA定量分析是DNA分子操作过程中一个必不可少的过程,常用的有两种方法。

(1)紫外光谱分析法。核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键,260nm处有特异的紫外吸收峰,其吸收强度与核酸浓度成正比。核酸分子的单链、双链之间的转换,对光吸收水平有一定影响,但其偏差可用特定的公式进行校正。

(2)EB荧光分析法。EB即溴化乙锭,它能插入DNA或RNA的碱基对平面之间并与之结合,结合后能在紫外光的激发下产生橘黄色荧光。荧光强度与被结合 的EB的量成正比,而被结合的EB的量又与核酸分子长度和数量成正比,所以荧光强度可以初步代表DNA含量。该方法经济简便,但准确性较低。

2. 材料

(1)DNA标准液。

(2)EB储存液(10mg/ml)。

(3)5×SDS加样液:50%甘油;0.5%SDS;0.1mol/L EDTA;0.1%溴酚蓝;0.1%二甲苯青FF。

(4)0.1×TE溶液。

(5)主要设备:紫外分光光度仪;琼脂糖凝胶电泳设备。

3. 方案

3.1 紫外光谱分析法

(1)用 0.1×TE对待测 DNA样品按 1:20或合适倍数稀释。

(2)用 0.1×TE作空白对照,在波长为 260 nm、280 nm和 310 nm处调零时使用。

(3)在三种波长下测量稀释好的DNA溶液的OD值。

(4)根据OD值计算DNA浓度(ug/mL)。公式如下:

单链 DNA [ssDNA]=33×(OD260-OD310)×稀释倍数

双链 DNA [dsDNA]=50×(OD260-OD310)×稀释倍数

单链 RNA [ssRNA]=40×(OD260-OD310)×稀释倍数

常见问题及注意事项如下:

(1)OD310值是背景,若溶液盐浓度越高,OD310值也越高。

(2)DNA的 OD260/OD280约为1.8,若高于1.8则可能有RNA污染,低于1.8则可能有蛋白质污染。

3)RNA的OD260/OD280值大约为2.0。

3.2 EB荧光分析法

(1)琼脂糖凝胶的制备。用含0.5ug/mL EB的1×TAE配制1%的微型琼脂糖凝胶。

(2)样品的准备。把待测DNA样品进行1:2连续稀释;并准备一份DNA标准品作对照用。

(3)上样。各稀释样品与加样缓冲液按5:1混匀后上样。

(4)电泳。100 V稳压电泳至溴酚蓝达到凝胶的 3/4处。

(5)紫外灯检测。肉眼可见到的最高稀释度约含DNA80 ng。

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