大肠杆菌K_12转醛醇酶基因talB的克隆及在运动发酵单胞菌CP4中的表达

工业微生物

IndustrialMicrobiology

󰀁Vol.36No.2󰀁

Jun.2006

大肠杆菌K󰀁12转醛醇酶基因talB的克隆及在

运动发酵单胞菌CP4中的表达

管于平,󰀁刘󰀁成,󰀁邹少兰,󰀁吴经才,󰀁张敏华

(天津大学石化中心,天津300072)

*

摘󰀁要󰀁󰀁研究了E.coliK󰀁12转醛醇酶基因(talB)在自身启动子和在Z.mobilisCP4eno基因启动子的启动下在E.coliDH5󰀁和Z.mobilisCP4中的表达情况。首先克隆了E.coliK󰀁12talB基因,并连接到穿梭载体pZB1上构建成pZB1󰀁talB;然后利用PCR重叠延伸技术将E.coliK󰀁12talB自身的启动子换成Z.mobilisCP4eno的启动子,构建得到pZB1󰀁Peno󰀁talB。将这两个质粒分别转化E.coliDH5󰀁和Z.mobilisCP4。对转化子粗酶液进行的转醛醇酶酶活力测定结果表明,E.colitalB自身启动子和Z.mobiliseno启动子能以基本相同的效率启动talB基因在E.coli和Z.mobilis中的表达。

关键词:转醛醇酶基因;󰀁启动子;󰀁大肠杆菌;󰀁运动发酵单胞菌󰀁󰀁转醛醇酶是磷酸戊糖途径非氧化支路的限速酶。在磷酸戊糖途径中,转醛醇酶将景天庚酮糖󰀁7󰀁磷酸上的三碳单位转移到甘油醛󰀁3󰀁磷酸的C1上,生成果糖󰀁6󰀁磷酸和赤藓糖󰀁4󰀁磷酸。在大肠杆菌中,磷酸戊糖途径除了分解葡萄糖或戊糖而获得细胞代谢所需的能量外,它还为细胞中氨基酸、维生素、核苷酸和细胞壁的合成代谢提供中间产物。而且,磷酸戊糖途径是大肠杆菌唯一能利用D󰀁木糖、D󰀁核糖或L󰀁阿拉伯糖的途径。

󰀁󰀁运动发酵单胞菌属于革兰氏阴性细菌,微好氧生长。它对糖的摄取速度和发酵生成乙醇的速度均优于酿酒酵母,但其可利用的碳源仅为葡萄糖、果糖和蔗糖。因此人们致力于对运动发酵单胞菌进行基因改造,使其能代谢五碳糖(如木糖、阿拉伯糖)而产乙醇,并已取得重大进展

[1,2,3]

不同

[5]

。研究外源基因在运动发酵单胞菌中的表达

情况,不仅有助于对其开展基因工程改造工作,也有助于了解其表达机制。

󰀁󰀁本文拟克隆大肠杆菌的转醛醇酶基因talB,并研究talB在自身启动子和运动发酵单胞菌ED途径的烯醇化酶基因(eno)启动子的启动下在E.coli和Z.mobilis中的表达情况。

1󰀁材料与方法

1.1󰀁菌株与质粒

󰀁󰀁运动发酵单胞菌Z.mobilisCP4购自中国工业微生物菌种保藏中心,大肠杆菌E.coliK󰀁12由耶鲁大学大肠杆菌保藏中心馈赠。pUC19购自华美生物工程公司,pZB1由本室构建,7656bp,有Amp(氨苄青霉素)和Cml(氯霉素)两个抗性标记,是E.coli和Z.mobilis间的穿梭载体1.2󰀁工具酶和主要试剂

󰀁󰀁各种性内切酶以及T4DNA连接酶购自宝生物(大连)工程公司;转醛醇酶酶活力测定用试剂购自Sigma公司;Pfu聚合酶购自北京鼎国公司。胶回收试剂盒、细菌基因组提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒分别购自北京博大泰克公司和清华大学天

[6]

。在运动发酵单胞菌中检

[4]

测不到转醛醇酶活性,转酮醇酶活力也很低,故要使其代谢五碳糖,除了引入代谢五碳糖的相关基因外,还必须同时引入转醛醇酶和转酮醇酶基因

[1~3]

。

。

󰀁󰀁运动发酵单胞菌代谢途径独特,是目前发现的唯一一种通过Entner󰀁Doudoroff途径(简称ED途径)厌氧发酵葡萄糖的微生物,ED途径基因的表达与大肠杆菌碳代谢基因的表达机制有显著

作者简介:管于平(1979~),男,硕士研究生。*通讯作者,E-mail:liuc@tju.edu.cn

󰀂36󰀂

󰀁第2期管于平,等:大肠杆菌K󰀁12转醛醇酶基因talB的克隆及在运动发酵单胞菌CP4中的表达第36卷󰀁

为时代公司。其余一般试剂用国产分析纯。1.3󰀁培养基和培养条件

󰀁󰀁大肠杆菌的培养采用LB培养基;运动发酵单胞菌的培养采用T培养基(yeastextract10g󰀁L;glu󰀁cose20g󰀁L;KH2PO42g󰀁L;MgSO4 7H2O1g󰀁L;(NH4)2SO41g󰀁L)。需要时加入抗生素Amp和Cml、X󰀁gal、IPTG等试剂,浓度:Amp100󰀂g󰀁mL(E.coli)或600󰀂g󰀁mL(Z.mobilis),Cml25󰀂g󰀁mL(E.coli)或100󰀂g󰀁mL(Z.mobilis),X󰀁gal25󰀂g󰀁mL,IPTG25󰀂g󰀁mL。1.4󰀁PCR扩增和测序

󰀁󰀁根据E.coliK󰀁12MG1655基因组序列(AE000111)中talB序列和Z.mobilisCP4eno序列(M99380),用Oligo6.0软件设计如下引物(小写字母表示为了引入酶切位点而设计的错配碱基):󰀁󰀁P1:5!GCCGGTatCGATGACTTTCCTGTGTAAAC3!(ClaI)󰀁

󰀁P2:5!ctgctaGCGATCAGAGATGGAAACTAA

3!

(NheI)

󰀁󰀁P3:5∀TTGTCTAgACgctAGCTACTCAATACGTAA3∀(XbaI、NheI)

󰀁󰀁P4:5∀TCAattTgtCcGTCATATCGAAACCTTTCT3∀󰀁󰀁P5:5∀GAaAggTttcgatATGACGGACAAATTGAC3∀󰀁󰀁P6:5∀ACCGAgcTCCCGGTCACGCTAAGAATGATT3∀(SacI)

󰀁󰀁引物合成和克隆片段测序均由上海博亚生物技术有限公司完成。

󰀁󰀁使用BiometraPCR热循环仪。1.5󰀁DNA操作技术

󰀁󰀁基因组DNA的提取采用试剂盒。PCR扩增目的基因参照文献

[7]

稳定期。离心收集菌体,超声波处理破壁,离心所得上清即为粗酶液。其蛋白含量测定方法参照文献

[12]

,酶活测定方法参照文献

[11]

。

󰀁󰀁酶活力单位定义:在给定实验条件下,每分钟催化转化1󰀂molNADH的酶量为一个酶活单位(即1U)。

2󰀁结果

2.1󰀁talB基因的克隆和pZB1󰀁talB的构建󰀁󰀁以E.coliK󰀁12基因组DNA为模板,使用引物P1、P2,对所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,发现有一条单带,大小与预期产物大小(1380bp)接近(见图1)。

图1󰀁PCR产物凝胶电泳

1、PCR产物,1380bp󰀁󰀁2、DNAMarkerIII

󰀁󰀁回收此片段,经ClaI和NheI位点连入pZB1(注:两个位点都不在抗性标记内),得到pZB1󰀁talB。宿主为DH5󰀁,用LB+Amp+Cml平板筛选转化子。对转化子进行液体培养,而后提取质粒,进行酶切鉴定(电泳图谱见图2),结果表明所有的酶切片段大小均与预期酶切片段大小相符。

󰀁󰀁提交阳性转化子菌液进行克隆片段的测序,结果表明,克隆片段序列与AE000111中的talB序列完全一致。

2.2󰀁Peno󰀁talB和pZB1󰀁Peno󰀁talB的构建2.2.1󰀁Peno󰀁talB基因的构建

󰀁󰀁以Z.mobilisCP4基因组DNA为模板,用引物P3、P4扩增CP4eno的启动子,产物电泳图谱见图3(第一次PCR);以2.1节中构建的pZB1󰀁talB为模板,

37󰀂

及相关仪器、试剂使用说明书进

[7]

行操作。大肠杆菌质粒提取参照文献连接反应和酶切反应参照文献细胞

[8]

[7]

中的SDS󰀁

[9]

碱裂解法,运动发酵单胞菌质粒提取参照文献。

和相关试剂使用说

明书进行操作。一步法制备和转化大肠杆菌感受态

,运动发酵单胞菌感受态细胞制备和电穿孔

[10]

转化参照文献。

1.6󰀁粗酶液转醛醇酶酶活力测定

󰀁󰀁大肠杆菌和运动发酵单胞菌都用LB+Amp+Cml液体培养基(但抗生素浓度不同,见前)培养至

󰀂

󰀁第2期

󰀁󰀁

工󰀁业󰀁微󰀁生󰀁物

第36卷󰀁

图2󰀁转化子质粒的性内切酶酶切电泳图谱

1、pZB1󰀁2、pZB1󰀁talB󰀁3、pZB1󰀁NheI󰀁4、pZB1󰀁talB󰀁1󰀁NheI(转化子1)󰀁5、pZB1󰀁talB󰀁2󰀁NheI(转化子2)󰀁6、DNAMarkerVI󰀁7、pZB1󰀁talB󰀁1󰀁(NheI+ClaI)󰀁8、pZB1󰀁talB󰀁2󰀁(NheI+ClaI)󰀁9、pZB1󰀁talB󰀁2󰀁HindIII10、pZB1󰀁talB󰀁2󰀁ScaI󰀁11、pZB1󰀁talB󰀁2󰀁PstI󰀁12、DNAMarkerIII

图4󰀁PCR产物凝胶电泳

1、PCR产物󰀁2、DNAMarkerIII

化子质粒提取物的酶切分析电泳图谱见图5。提交阳性转化子菌液进行克隆片段的测序,结果表明,克隆片段序列分别与M99380中eno基因的启动子以及AE000111中的talB序列完全一致。

用引物P5、P6扩增talB基因(不含启动子区),产物电泳图谱见图3(第二次PCR);以第一次和第二次PCR产物的混合物为模板,使用引物P3、P6,以构建Peno󰀁talB,产物电泳图谱(见图4)表明Peno󰀁talB构建成功,其与预期的产物大小(995bp)一致。

图5󰀁转化子质粒的性内切酶酶切电泳图谱

1、pUC19󰀁2、pUC19󰀁talB󰀁1(转化子1)󰀁3、pUC19󰀁EcoRI󰀁4、DNAMarkerIII󰀁5、pUC19󰀁talB󰀁2󰀁SacI(转化子2)󰀁6、pUC19󰀁talB󰀁1󰀁SacI󰀁7、pUC19󰀁talB󰀁2󰀁(SacI+XbaI)󰀁8、pUC19󰀁talB󰀁1󰀁(SacI+XbaI)󰀁9、pUC19󰀁talB󰀁1󰀁HindIII󰀁10、pUC19󰀁talB󰀁1󰀁BamHI

图3󰀁PCR产物凝胶电泳

1、PCR产物(Z.mobilisCP4eno启动子区)󰀁2、DNAMarkerVI󰀁3、PCR产物(E.coliK󰀁12talB结构基因)

󰀁󰀁用NdeI和NheI双酶酶切pUC19󰀁Peno󰀁talB,回收1383bp、含Peno󰀁talB的片段。将其插入到穿梭载体pZB1的NdeI和NheI位点(注:两个位点都不在抗性标记基因内),得到pZB1󰀁Peno󰀁talB。宿主为DH5󰀁,用LB+Amp+Cml平板筛选。转化子质粒提取物的酶切分析电泳图谱见图6。

38󰀂

2.2.2󰀁pZB1󰀁Peno󰀁talB的构建

󰀁󰀁上述Peno󰀁talB片段经XbaI和NheI位点插入到pUC19中,得到pUC19󰀁Peno󰀁talB。宿主为DH5󰀁,用LB+Amp+X󰀁gal+IPTG平板筛选。转

󰀂

󰀁第2期管于平,等:大肠杆菌K󰀁12转醛醇酶基因talB的克隆及在运动发酵单胞菌CP4中的表达

[4]

第36卷󰀁

没有检测到转醛醇酶活性,与文献吻合。表2󰀁Z.mobilisCP4转化子粗酶液转醛醇酶活

培养时间

(h)

8121416

转醛醇酶比活力(U󰀁mg蛋白)

Z.mobilisCP4Z.mobilisCP4Z.mobilisCP4

(pZB1)(pZB1󰀁talB)(pZB1󰀁Peno󰀁talB)󰀁󰀂0.0012

󰀁󰀁󰀂

0.030.0260.03

0.010.0180.022

󰀁󰀁注:#󰀁∃表示没有进行测定,#󰀂∃表示没有检测到转醛醇酶活性。

3󰀁讨论

图6󰀁转化子质粒性内切酶酶切电泳图谱

1、pZB1󰀁Peno󰀁talB󰀁

󰀁2、pZB1󰀁Peno󰀁talB󰀁NheI󰀁3、pZB1󰀁Peno󰀁talB󰀁

BamHI󰀁4、DNAMarkerVI󰀁5、pZB1󰀁Peno󰀁talB󰀁(NheI+NdeI)󰀁6、pZB1󰀁Peno󰀁talB󰀁EcoRI󰀁7、pZB1󰀁Peno󰀁talB󰀁PstI󰀁8、pZB1󰀁Peno󰀁talB󰀁ScaI󰀁9、DNAMarkerIII

󰀁󰀁不同的生物体内具有不同的表达、以及转录系统。Z.mobilis的基因表达机制目前研究很少,初步认为碳代谢基因表达机制与E.coli有很大不同。Z.mobilisED代谢途径和乙醇发酵的13个基因都为组成型高表达,它们的基因表达产物占细胞内可溶性蛋白的50%左右。分析认为这些高表达基因的启动子存在两个高度保守的序列,但这两个保守序列与大肠杆菌 70识别的共同序列的同源性较低。这些基因包括eno、gap(3󰀁磷酸甘油醛脱氢酶基因)、pdc(丙酮酸脱羧酶基因)等。

󰀁󰀁拓宽Z.mobilis的碳源范围(主要是五碳糖)的改造,必须同时引入转醛醇酶和转酮醇酶基因

[1,2,3]

[5]

2.3󰀁talB和Peno󰀁talB在E.coliDH5󰀁和Z.mobilisCP4中的表达

2.3.1󰀁talB和Peno󰀁talB在E.coliDH5󰀁中的表达󰀁󰀁DH5󰀁(pZB1󰀁talB)和DH5󰀁(pZB1󰀁Peno󰀁talB)粗酶液转醛醇酶酶活测定结果见表1:

表1󰀁E.coliDH5󰀁转化子粗酶液转醛醇酶酶活

菌株

E.coliDH5󰀁(pZB1)E.coliDH5󰀁(pZB1󰀁talB)E.coliDH5󰀁(pZB1󰀁Peno󰀁talB)

转醛醇酶比活力(U󰀁mg蛋白)

0.050.1060.109

。鉴于Z.mobilis独特的代谢途径和特

󰀁󰀁根据表1,可以看出talB和Peno󰀁talB都能在DH5󰀁中正确表达且酶活水平相当,其酶活水平为对照菌株DH5󰀁(pZB1)转醛醇酶酶活的2倍。2.3.2󰀁talB和Peno󰀁talB在Z.mobilisCP4中的表达

󰀁󰀁将pZB1󰀁talB和pZB1󰀁Peno󰀁talB电穿孔转化至Z.mobilisCP4感受态细胞,用T+Amp+Cml平板筛选。对得到的转化子进一步进行了酶切分析鉴定(略),然后测定了不同生长时期粗酶液转醛醇酶酶活,测定结果见表2。

󰀁󰀁根据表2结果,可以看出:talB和Peno󰀁talB均能在CP4中正确表达;talB在CP412h及以后的不同时间表达水平基本没有区别;Peno󰀁talB在CP4中的表达水平随培养时间延长而不断提高,但至16h止仍低于talB的表达水平;对照CP4(pZB1)中

󰀂

点,这两个基因以组成型、高表达为宜。因此本文选择了eno基因的启动子。

󰀁󰀁E.colitalB基因在自身启动子和eno启动子下的表达,宿主为E.coli时表达水平相当,为Z.mobilis时自身启动子下的表达反而更高,是一个有意思的现象。这至少说明:不管Z.mobilis的基因表达机制如何、与E.coli的基因机制有多大的区别(这些目前还不清楚),但至少在talB的表达上,E.coli的talB自身启动子和Z.mobilis的eno启动子功能相当,这正好说明了Z.mobilis和E.coli表达机制相似的一面。

󰀁󰀁在CP4中的表达检测只进行到16h,延长时间Peno󰀁talB的表达水平有可能进一步上升。另外,可能是因为所用质粒拷贝数不同,以及酶活测定方法有区别,本文酶活测定结果明显低于文献报道

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󰀁第2期

󰀁󰀁

工󰀁业󰀁微󰀁生󰀁物

第36卷󰀁

值

[13]

,此文献使用pUC19,底物之一是4󰀁磷酸赤藓

tionofthepromoterandidentificationofaconservedsequenceintheregulatoryregion.JBacteriol.,1992;174(9):2816-2823

[6]󰀁高卫华,运动发酵单胞菌和大肠杆菌间穿梭质粒载体的构建,

硕士学位论文,天津大学,天津,2004

[7]󰀁萨姆布鲁克J.等.分子克隆实验指南(第三版)黄培堂等译,

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[8]󰀁奥斯伯等F.精编分子生物学实验指南(颜子颖等译),科学

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[9]󰀁NesterE.W.InManualofMethordsforGeneralBacteriology.

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糖(本文此底物为甘油醛)。这些方面的进一步研究正在进行中。

参

考

文

献

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[2]󰀁KristineD.,MinZhang,ChristinaE.,etal.Developmentofan

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mobilisglf,zwf,edd,andglkgenesformanoperon:localiza󰀁

CloningofEscherichiacoliK󰀁12talBanditsexpressionin

ZymomonasmobilisCP4

GUANYu󰀁ping,LIUCheng*,ZOUShao󰀁lan,WUJing󰀁cai,ZHANGMin󰀁hua

(TianjinR&DCenterforPetrochemicalTechnology,TianjinUniversity,Tianjin300072)

Abstract󰀁TheexpressionofE.coliK󰀁12talBgeneinZ.mobilisCP4underthecontrolofitsownpromoterandtheZ.mobilisCP4enopromoterwasstudied.First,talBgenefromE.coliK󰀁12wasclonedandinsertedintoashuttlevectorpZB1toformplasmidpZB1󰀁talB.Second,thetalBnativepromoterwasreplacedbytheenopromoterfromCP4usingPCRoverlapextensionmethod,andalsointroducedintopZB1toformplasmidpZB1󰀁Peno󰀁talB.Then,bothoftherecombinantplasmids,pZB1󰀁talBandpZB1󰀁Peno󰀁talB,weretransformedintoE.coliDH5󰀁andZ.mobilisCP4.ThetransaldolaseactivitydeterminationsshowedthattalBandPeno󰀁talBexpressedinE.coliandZ.mobiliswithequaleffi󰀁ciency.

Keywords󰀁talB;promoter;Zymomonasmobilis;Escherichiacoli

󰀂40󰀂