鱼类疫苗的现状

鱼类疫苗的现状

鱼用疫苗是指能使鱼类产生自动免疫的生物制剂。如加以严格区分，鱼用疫苗可分为菌苗、疫苗和类毒素三类。菌苗是由细菌制备的，疫苗是由病毒制备的，类毒素则由外毒素所制成。鱼用疫苗中，主要是菌苗和疫苗。按病原的活力来分，又可分为死苗和活苗。死苗又称灭活疫苗。是将免疫性好的菌种和病毒种经人工大量培养后，用物理或化学的方法将其杀死而制成。其特点是安全性能好，容易保存，但免疫性能不如活苗好，而且使用剂量大，目前在生产上使用的主要是死苗。活苗又称弱毒疫苗。是用人工培养减弱的毒（菌）株或天然的弱毒苗株，经大量繁殖后制成。这种弱毒疫苗进入机体内后，仍能生长繁殖，一段时间后，因其毒力弱，故很快便被机体的抵抗力所扑灭。机体通过这一斗争后，所获得的免疫力比较坚强，免疫效果较灭活疫苗好，且使用剂量小，免疫产生快，免疫时间较长，这些是活苗的优点。但因是活的微生物制品，较难保存，容易失效是其缺点。新型疫苗，近年来,随着分子免疫学与基因工程技术的迅猛发展,新一代鱼用疫苗的研究也从20世纪90年代开始起步。目前,国外研究进展较快,主要有亚单位疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗、基因工程疫苗等。与传统的疫苗相比,新型疫苗具有安全、高效、可大量生产等优点[1,2]。

1.亚单位疫苗 亚单位疫苗是应用某些化学试剂裂解细菌或病毒,驱除病原微生物中有害成分和对激发机体保护性免疫无用的成分,保留其中一种或几种主要抗原成分所制成的一类疫苗。在兽医领域,已有禽流感的血凝素疫苗、口蹄疫VP1疫苗以及结核杆菌、布氏杆菌等核糖体的亚单位疫苗[3]。在水产病防活领域,也有不少研究人员进行了这方面的研究,如Kuzyk等[4]已研究了针对大马哈鱼败血症的亚单位疫苗;在我国,孙建和等[5]通过化学方法交联HEC毒素和多糖,在研制嗜水气单胞菌亚单位疫苗方面做了一定的尝试。与传统疫苗相比,亚单位疫苗有抗体出现早、滴度高、持续时间长等优点。不过,由于种种原因,许多水产动物疾病的亚单位疫苗都处于实验室阶段,应用实践较少。

2.合成肽疫苗 也称为表位疫苗或第三代疫苗,是应用人工方法设计、合成,或以基因工程制备具有保护作用的类似天然抗原决定簇的小肽制成的一类疫苗。确定病原体的抗原决定簇中使机体产生中和性抗体等保护性应答成分的氨基酸序列是设计合成肽疫苗的前提。在鱼类杆状病毒中的G蛋白是一种重要的中和性抗原,由500 多个氨基酸组成,在杆状病毒的致病性中发挥着重要作用[6]。而针对传染性造血器官坏死病毒(IHNV),Winton等[7]发现,将编码G蛋白的部分基因克隆入大肠杆菌或杀鲑气单胞菌的减毒株中表达,通过浸浴法免疫可产生保护作用。也有试验发现,由大肠杆菌表达的纯化的IHNV 核蛋白基因的产物或体外根据氨基酸序列合成的G蛋白不能在鱼体内诱导保护性免疫反应,而以包含IHNV的G蛋白细菌裂解产物免疫时,却可以明显提高鱼体对此病的免疫力。到目前为止,鱼用合成肽疫苗的研究基本处于试验阶段,具体的作用机制、免疫途径以及免疫效果等都有待进一步研究。

3.活载体疫苗 这类疫苗以某种非致病性病毒或细菌(株)为载体来携带并表达其他致病性病原与保护性免疫相关的抗原基因。用这种重组体作为活疫苗进行预防接种时,病毒或细菌在其繁殖的细胞中产生外源蛋白,诱发机体产生特异性免疫应答。Noonan等[8]将IHNV、病毒性出血败血症病毒(VHSV)和IPNV的抗原表位基因—G蛋白基因转入杀鲑气单胞菌的无毒株A440中,通过活菌苗A440感染大马哈鱼可使其产生针对这几种杆状病毒的保护性免疫反应。

4.基因缺失疫苗 这是利用基因工程技术去掉病毒基因组中负责毒力基因中的某一片段,使其成为缺损病毒株所制成的一类疫苗。Marsden等[9]将杀鲑气单胞菌的aroA基因删除构建了减毒活疫苗,Vanderheijden等将斑点叉尾鮰病毒的ORF50基因中删除一段1200bp的序列成功构建了减毒株V60。这种缺失突变株在自然条件下,不易返祖成强毒。所以,这种突变株是稳定的,用这种方法制造出的弱毒疫苗株在安全性能下更加有保证,而且具有良好的免疫原性。

5.DNA疫苗 又称基因疫苗或核酸疫苗。它是将外源抗原基因插入细菌质粒,构建成重组质粒,直接接种于动物机体,被导入宿主的靶细胞中,DNA则表达特异的蛋白抗原与宿主细胞MHC2Ⅰ类或MHC2Ⅱ类抗原分子结合,刺激免疫识别系统,从而引发特异性体液免疫和细胞免疫应答,使动物获得保护力的一种新型疫苗。目前,对鱼用DNA疫苗的应用研究主要集中在对鲑、鳟的IHNV、VHSV、鲤春病毒(SHRV)等传染性病毒病的防治上。[17-21]Traxler等[10]以编码IHNV糖蛋白的裸DNA免疫大西洋鲑,8周后用IHNV进行攻击试验,保护率可达40%～100%。Lorenzen等[11]针对VHSV 糖蛋白构建的DNA 疫苗能诱导70%的虹鳟产生较高水平的免疫保护。Kim等[12]按照IHNV、SVCV、SHRV 的糖蛋白基因构建三种病毒的DNA疫苗,免疫虹鳟后进行的攻毒试验发现三种疫苗均使虹鳟产生了对IHNV的免疫抵抗力。与常规疫苗相比,DNA疫苗主要有以下优点:①在体内产生的免疫应答与病原微生物自然感染相似,因而可产生有效的免疫应答;②避开了病原微生物,无感染的潜在危险;③外源基因持续表达,免疫起长;④需要的免疫剂量低,每尾鱼10～100μg的剂量即可获得到良好的免疫效果[13]。当然,DNA疫苗也存在安全性的方面的问题,而且DNA疫苗的接种多采用肌内注射的方法,这种方法耗时且费力,而且不适用鱼苗和经济价值较低的鱼类,在实际生产中有一定的局限性[14]。因此,探索有效的免疫方法是DNA疫苗研究急需解决的问题

活疫苗迄今为止,世界各国允许生产的无论是病毒还是细菌性鱼用疫苗,均为灭活疫苗。然而,为了增强免疫效果的持续性,更有效地诱导受免鱼的细胞免疫应答,研究和开发鱼用活疫苗是很有意义的。长期以来,为了避免用于制备活疫苗的病原菌在水体中扩散和毒力回归的危险,各国均不敢使用鱼用活疫苗。以往研制人体用和动物用活疫苗的方法主要是将病原体置于各种条件下培养,通过诱导其发生基因突变而确立弱毒株的。然而,采用这种方法研制成一种活疫苗不仅需要很长的时间,而且存在很大的盲目性。现在,应用基因操作技术可以将病原体上的目的抗原基因克隆到非致病性病毒或细菌中,从而令这种既带有目的抗原基因又没有致病性的微生物充当活疫苗的角色。由于病毒的感染防御抗原比较单纯,

目的抗原的发现和克隆均较细菌简单,现在已有几种疫苗的研究取得了实质性的进展。因为致病菌的感染防御抗原较多,即使发现并克隆成功一个或者数个感染防御抗原,也难以刺激受免鱼体产生高水平的免疫应答。此外,克隆到菌体内的外源基因能否在受体菌中表达和稳定地遗传而不丢失,都是至关重要的问题。最近引起人们高度重视的还DNA疫苗。这种疫苗不只是利用病原体的抗原相关基因,而且可以利用受免鱼体与免疫应答有关的细胞因子的基因。由于这种DNA 疫苗并不是致病菌,所以不存在复毒和病源扩散问题,安全性是有保证的。不过,如果病原体的有效抗原相关基因正是毒素基因的话,就仍然要面对DNA 疫苗的弱毒化问题微囊疫苗疫苗在消化道内被消化而失去抗原性,这是口服免疫接种法所面临的最大问题。为了防止疫苗的抗原性在消化道内被破坏,多年前,就有了商品化兽用微囊疫苗。最近有人试验了将鱼用疫苗用囊膜包被后再对鱼类口服免疫接种,已经在实验室内取得了较好的免疫效果。如果鱼用微囊疫苗的研究获得成功的话,那么,对鱼类的口服免疫接种法将再度引起人们的关注。用微囊包被疫苗不仅可以防止受免鱼体的消化系统对疫苗的破坏,还可以达到使疫苗缓慢释放,从而延长对鱼体免疫系统刺激时间的目的。如果能将微囊包被技术用于注射用疫苗的包被,就有可能避免在鱼用疫苗中添加存在食品卫生方面问题的弗氏佐剂。免疫效果的判定为了测定免疫接种后受免鱼的免疫应答水平,除采用活菌攻毒试验外,还有多种方法可供采用。对于结构较为单纯的病毒性疫苗,测定受免鱼血清中的中和抗体,就可能较为准确地评价受免鱼体的免疫防御水平了。但是,对于采用致病机制和结构均比较复杂的细菌制备的细菌性疫苗,仅检测1项或2项指标,是很难对受免鱼体的免疫防御水平作出准确评价的。这是因为研究者虽然可以通过检测针对菌体外毒素的血清中的中和效价和针对菌体表面抗原的血清中的调理抗体效价以及测定巨噬细胞的特异性吞噬率、自然杀伤细胞的杀菌活性和嗜中性白细胞中活性氧的浓度等,作为评价受免鱼免疫应答水平的指标,但是,在接受抗原刺激后受免鱼的免疫应答是十分复杂的生理学过程,是在各种免疫细胞及其多种细胞因子的协同作用下完成的,因此,凭1项或者2项指标,不可能全面反映出这种复杂的免疫应答状况。不过,通过检测上述指标可以比较受免疫鱼某种特异性或者非特异性免疫应答的上升程度。为了准确评价鱼用疫苗的效果,除了要进行攻毒试验

外,还有必要结合疫苗在野外鱼池中应用的效果和各项免疫指标进行综合分析。受免鱼的应激状态随着水产养殖业的发展,高密度集约化养殖方式被广泛采用,在我国的许多养殖场均出现了养殖池底堆积有大量有机物质,水体的富营养化和有害微生物的大量孽生等现象。在这种饲养条件下,各种饲养鱼类始终处于强烈的应激状态之中,鱼体的免疫机能也处于被抑制的状态。即使是品质良好的鱼用疫苗,对这种生理状态不正常的饲养鱼实施免疫接种,也是不可能获得理想的免疫效果的。因此,免疫接种的成败与否,不仅取决于鱼用疫苗的品质,甚至更重要的是取决于饲料环境、饵料、鱼类种内遗传差异和饲养管理的水平等多种因素。在研制有效的鱼用疫苗的同时,探讨适宜的免疫接种条件,革新现有的养殖技术是很有必要的。[15]