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科目 遗传学实验 题目 模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
摘要：
农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体。本次实验意在对模式植物拟南芥T-DNA插入突变体进行鉴定。实验中用到的主要实验方法有：CTAB法提取拟南芥基因组DNA、PCR扩增目的基因片段、琼脂糖凝胶电泳分离核酸。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。DNA经EB染色，EB可与核酸结合，在紫外光激发下产生荧光。现广泛应用于核酸的研究中。 引言
Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。
T-DNA插入基因内部导致基因突变：T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。这使农杆菌Ti 质粒转化系统的应用范围受到了一定的限制。
反向遗传学研究的首要条件是获得基因敲出突变体，建立可靠、有效、方便的T-DNA插入突变体的鉴定方法。其中，“三引物法”是主要鉴定方法之一。
“三引物法”即采用三个引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR扩增产物仅有1种，电泳结果为一条大带（由LP+RP这一对引物扩增出来）；纯合突变体植株目的基因
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的两条染色体上均发生T-DNA插入，也只能得到1种PCR扩增产物，电泳结果为一条小带（由BP+RP这一对引物扩增出来）；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，所以PCR扩增产物有2种，电泳结果为一条大带由（LP+RP这一对引物扩增出来）和一条小带（由BP+RP这一对引物扩增出来）。电泳结果差异明显，能有效区插入突变体的类型。
此法优点是可同时鉴定出纯合突变体并确证T-DNA的插入情况。本方法操作简单，成功率高，结果可靠，适用于从大量拟南芥T—DNA插入突变体中快速鉴定出突变体。 【实验材料】
1.试剂： 液氮，2*CTAB提取液，氯仿-异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，TE，
PCR反应体系（DNA模板（基因组DNA），引物LP、RP、BP，缓冲液，MgCl2，dNTP mixture，ddH2O，Taq酶），琼脂糖凝胶电泳（琼脂糖，1×TAE缓冲液，Loading buffer，DL 2,000 DNA Marker，λ-Hind Ⅲ DNA digest Marker，溴化乙锭。
2.器具： 1.5ml离心管，水浴锅，微量移液器，离心机，PCR仪，微波炉，电泳
仪，电泳槽，梳子，三角瓶，微量天平，手套，染色盘，凝胶成像仪。
3.材料：拟南芥T-DNA插入突变体植株。 【实验步骤】
提取拟南芥基因组DNA
1. 在1.5ml离心管中放入2或3片拟南芥幼嫩叶片，用液氮将其研磨成细粉，向管中加入600ul预热至65℃的2×CTAB提取液，轻摇混匀。 2. 65℃水浴30 min，其间轻摇混匀。
3. 向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），室温下轻轻混匀10 min，12000 rpm离心15 min，再转移上清入新管。
4. 向上清液中2倍无水乙醇或等体积的异丙醇，小心混匀，-20 ℃ 下30 min，12000 rpm离心15 min，弃上清。
5. 用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清。 6. 将沉淀晾干，加20-50ul TE (pH 8.0)，65℃水浴30 min溶解DNA。
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PCR
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取3个PCR小管（一个为三引物体系，另外两个为双引物体系），按照如下
反应体系向PCR小管内加入样品，设定如下反应程序，进行PCR。 反应体系：
三引物反应体系 25ul体系 H2O 10xTaq buffer (MgCl2free) MgCl2 (25mM) 引物LP (10 uM) 引物RP (10 uM) 引物BP (10 uM) dNTP (各2.5mM) 模板DNA(30-50ng/μl) Taq酶(5U/μl ) 15ul 2.5ul 2ul 1ul 1ul 1ul 0.5ul 2ul 0.2ul 双引物反应体系25ul体系 H2O 10xTaq buffer（MgCl2free) MgCl2 (25mM) 引物LP或BP (10 uM) 引物RP(10 uM) dNTP (各2.5mM) 模板DNA(30-50ng/μl) Taq酶(5U/μl ) 16ul 2.5ul 2ul 1ul 1ul 0.5ul 2ul 0.2ul 反应程序
预变性 94℃ 5min 变性 94℃ 40sec
退火 53℃ 50sec 延伸 72℃ 80sec 循环35次 72℃ 10min 琼脂糖凝胶电泳
注：①电泳这一步骤，我与其余五名同学共同完成，共用同一块胶板。
②基因组DNA的电泳所用琼脂糖凝胶浓度为0.8%，PCR产物的电泳所用琼脂糖凝胶浓度为2% 。
1. 制胶：称取0.24g琼脂糖，加入30mlTAE缓冲液（用于基因组DNA的电泳）；
另称取1.60g琼脂糖，加入80mlTAE缓冲液（用于PCR产物的电泳）。放入微波炉中加热溶化。
2. 灌胶：待胶冷至50-60℃时，缓缓倒入胶板。约半个30—40min后，胶已凝固，
拔去梳子，将胶板放在电泳槽中，补充槽内TAE缓冲液，至约高出胶板1mm。
3. 加样：将样品与Loading buffer在封口膜上混匀，用微量移液器将样品加入到
点样孔内。（基因组DNA加样量为5ul，PCR产物加样量为20ul）
4. 电泳：接通导线（加样端接负极），调节电压至5v/cm，当指示剂距胶板底部
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1-2cm时，停止电泳。 清洗。
5. 染色：将胶板放入含EB的染色盘中，染色约10min，再将胶板转移到清水中6. 观察：将凝胶放入凝胶成像仪内观察、拍照。 【实验结果】
理论上，电泳结果图上会出现一条大带或一条小带或两条带同时出现，并且可以对T-DNA插入突变体的类型做出准确鉴定。各种可能的电泳结果对应插入突变的类型如下表：
电泳条带的有无 1000-1500bp间 有 有 无 800-900bp间 无 有 有 鉴定结果 野生型 插入杂合突变体 插入纯合突变体 但是由于多种可能，最终基因组DNA和PCR扩增产物的电泳结果都没有出现预期条带。
对这一现象出现的原因分析如下：
由于班里大多数同学出现了同样的情况，只有极少数同学的电泳结果图上出现了条带，基本可以断定并非由实验操作造成。【注意事项】
1. 实验取材为植株叶片，而不要将植株连根拔起。否则的话即便检测出实验材料为插入纯合突变体，由于植株已经不存在，实验结果就没有了意义。 2. 液氮研磨实验材料时，注意不要将液氮倒在手上，以免将皮肤冻伤。 3. 配制PCR反应体系时由于各种试剂量较少，要靠壁滴加。
4. 在用微波炉加热溶解琼脂糖的过程中，TBE缓冲液中的水分会蒸发掉一少部分，所以，最好在加热前在三角瓶内补充少量蒸馏水。
5. 注意电泳方向，点样孔所在方向对准电泳槽的负极（DNA带负电荷，在电泳的过程中向正极移动）。
6. EB为强诱变剂，染色时要佩戴手套，实验技术后认真清洗双手。
参考文献
[1]模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定.ppt
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