AnalysisandTesting分析检测doi:10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2019.11.052自制泡菜中高产胞外多糖乳酸菌的筛选与鉴定ScreeningandIdentificationofLacticAcidBacteriaProducingExtracellularPolysaccharidesinHomemadePickles◎ 薛艳蓉，靳 光，王 呈，梁茂文，赵瑞生，刘 波(山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西 太原 030032）(Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan Xue Yanrong, Jin Guang, Wang Cheng, Liang Maowen, Zhao Ruisheng, Liu Bo030032, China)摘 要：试验以自制泡菜为原料，通过平板涂布、划线分离、革兰氏染色和接触酶试验得到3株乳酸菌，经过16S rDNA序列分析鉴定，3株菌株分别为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）2株和发酵乳杆菌（Lactobacillus fermeutum）1株，并对其胞外多糖产量进行测定，筛选出产胞外多糖含量最高的菌株。分离出的高产胞外多糖乳酸菌，可为研究、开发新型功能性食品提供原料，并为后续胞外多糖的工业化制备提供理论依据及数据支持。关键词：泡菜；胞外多糖；筛选；鉴定Abstract：Three strains of lactic acid bacteria were obtained from kimchi flavor raw material by plate coating, scribed separation, Gram staining and contact enzyme test. After 16S rDNA sequence analysis, three strains were identified production was determined, and extracellular polysaccharide production was screened out,the strain with the highest as Lactobacillus plantarum (2 strains) and Lactobacillus fermeutum (1 strain), and their extracellular polysaccharide polysaccharide content. The lactic acid bacteria with high yield of extracellular polysaccharides can provide raw materials for the research and development of new functional foods and provide theoretical basis and data support for the industrial preparation of extracellular polysaccharides.Key words：Pickles; Extracellular polysaccharides; Screening; Identification中图分类号：TS201.3多糖类化合物是由微生物代谢产生的，广泛存在转化、及免疫调节等生理过程[2]。它具有良好的于微生物、植物及动物机体当中[1]，可参与细胞的代谢、生物活性，具有降血糖、调节血压、调节机体的免疫基金项目：山西省青年科技研究基金（编号：201601D021112）。作者简介：薛艳蓉（1982—），女，硕士，助理研究员；研究方向为畜产品。通讯作者：靳光（1981—）男，硕士，副研究员；研究方向为肉牛及畜产品。XIANDAISHIPIN现代食品/165分析检测Analysis and Testing功能等作用，广泛应用于医药行业[3]。乳酸菌胞外多1.2.2 产胞外多糖乳酸菌的筛选糖不仅具有保健功能，还可作为安全、天然的添加剂，将纯化得到的菌株再次接种于MRS培养基中，37 ℃ 可赋予产品良好的口感、风味和质地[4-5]。近年来，胞培养箱中培养48 h。用无菌接种环挑取表面粘稠并有外多糖已成为乳酸菌资源开发利用的研究热点。明显拉丝的单菌落，观察菌落的特征：形态、大小、泡菜是以萝卜、卷心菜、白菜等为原料，浸渍在表面光滑程度、菌面隆起程度及菌落边缘的整齐程度。低浓度的盐水中，在乳酸菌的作用下，经7～10天发对该菌株的纯培养物进行革兰氏染色，在显微镜下观酵而成的一类蔬菜制品，因质地脆嫩和风味独特而深察其细胞形态特征。受消费者的青睐[6]。泡菜主要是靠乳酸菌发酵生成大1.2.3 16S rDNA基因序列分析量乳酸来抑制微生物，从而达到长时间贮存的目（1）DNA的提取。按说明书，用细菌基因组的。乳酸菌不仅能起到抑菌作用，其在发酵过程中可DNA提取试剂盒提取上述纯化菌落的基因组DNA。产生多种物质，从而赋予泡菜特殊的风味。可从泡菜（2）16S rDNA基因序列的测定。对提取的基因组中分离出乳酸菌，并将具有优良发酵特性的乳酸菌分进行PCR扩增，引物为（5'-AACGCGAAGAACCTTAC 离株应用于泡菜的生产中。本研究旨在从自然发酵的-3'）和（5'-CGGTGTGTACAAGACCC-3'）。PCR反应 泡菜中筛选出高产胞外多糖的乳酸菌菌株，通过形态体系：引物各1 μL，dNTP 4 μL，10×PCR buffer 5 μL， 观察，结合分子生物学方法对其进行鉴定，从而丰富MgCl2 4 μL，Taq酶0.5 μL，模板DNA 2 μL，用dd 产胞外多糖乳酸菌发酵剂的种类。H2O补至50 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min，1 材料与方法94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循环30次，最后一次循环中72 ℃下延伸10 min。1.1 材料与仪器PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR扩增产物送往山西兆恩因生物公司进行DNA测序。泡菜为饭店的自制泡菜。95%乙醇、三氯乙酸、（3）同源性分析。将测序结果做Blast分析。根苯酚及浓硫酸等：均为国产分析纯试剂；细菌基因组据GenBank中提供的基因序列，采用Mega软件中的提取试剂盒：天根生化科技有限（北京）有限公司；邻接法构建系统发育树。MRS培养基；MRS-CaCO3培养基。1.2.4 胞外多糖产量测定超净工作台；立式高压灭菌锅；电热恒温培养箱；将筛选得到的乳酸菌菌株接种于MRS液体培养厌氧操作箱；电显微镜；2720 PCR扩增仪，3730-XL基中，37 ℃培养48 h，取培养液加80%三氯乙酸至测序仪及15R冷冻离心机。终浓度为10%，充分搅拌，4 ℃、16 000 r·min-1离心 1.2 实验方法20 min，收集上清液。在上清液中加3倍体积的95%的乙醇，沉淀过夜。4 ℃、16 000 r·min-1下离心20 min， 1.2.1 样品中乳酸菌的分离纯化收集沉淀并用蒸馏水溶解，装入透析袋，透析48 h，得厌氧操作。称取适量泡菜汤汁，用0.9%（W/W）胞外粗多糖水溶液。采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量。的生理盐水对其进行梯度稀释，将样品稀释为10-4、10-5、10-63个稀释度，分别吸取3个稀释度的稀释液2 结果与分析0.1 mL，涂布于MRS-CaCO3培养基平板上，每个稀释度重复3次，37 ℃下恒温培养24～48 h，观察并记录2.1 产胞外多糖菌株的筛选菌落特征，挑取具有乳酸菌典型特征并伴有溶钙圈的将筛选出的菌株分离纯化后进行革兰氏染色、接菌落，进行反复划线纯化，直至出现单个纯菌落，并触酶实验，将革兰氏阳性且接触酶实验呈阴性的菌株对纯化菌株进行革兰氏染色、接触酶试验。初步确定为乳酸菌。如图1，菌落呈圆形、乳白色、不166/现代食品XIANDAISHIPINAnalysisandTesting分析检测透明、表面凸起、光滑湿润且粘稠且边缘整齐[7]。菌株2.3 胞外多糖产量测定因可产生胞外多糖，从而使菌落粘稠且可以拉丝[8]。 进一步筛选粘稠并拉丝的菌落。结果从泡菜分离培养3株菌株，提取胞外多糖，计算不同菌株的出3株产胞外多糖的乳酸菌，如图2，在光学显微镜下，胞外多糖产量。如图3所示，3株菌株的胞外多糖产量3菌株均为革兰氏阳性菌，呈短杆状，单独或成对存在，均在200 mg·L-1以上，其中M2菌株即植物乳杆菌的无芽孢[7]，标记为M1～M3。胞外多糖产量最高，为351 mg·L-1。图3 不同菌株胞外多糖产量图3 结论图1 菌株菌落形态图本研究以饭店自制的泡菜为原料，从中挑选高产胞外多糖的乳酸菌株，经过分子生物学鉴定，该菌株为植物乳杆菌。近年来，乳酸菌胞外多糖已成为研究和开发产胞外多糖的细菌的热点之一[9]。本实验筛选出的高产胞外多糖M2菌株，为进一步开发利用乳酸菌菌种资源奠定了一定的理论基础[10]。参考文献：[1]杨同香，吴孔阳，陈俊亮，等.真菌发酵胞外多糖的研究进展[J].食品科学，2016，37（5）：265-270.[2]房 芳，柳春燕，陈靠山，等.苹果链格孢菌胞外多糖及分光光度法改用酶标仪法的稳定性[J].黑龙图2 菌株镜检图江八一农垦大学学报，2017，29（4）：72-77.2.2 产胞外多糖菌株株16S rDNA序列分析[3]王恒禹，刘 玥，姜 猛，等.多糖在食品工业中的应用现状[J].食品科学，2013，34（21）：431-438.提取3株菌株的基因组DNA，经PCR扩增后测序，[4]Zannini E，Waters D M，Coffey A，et al. 根据GenBank中提供的基因序列，依据16S rDNA序Production，properties，and industrial food 列构建进化树进行分析，M1、M2与Lactobacillus applicationof lactic acid bacteria-derived plantarum的相似度为99%，因此鉴定为植物乳杆菌；exoplysaccharides[J].Applied Microbiology and M3与标准菌株Lactobacillus fermeutum的相似度为Biotechnology，2016，100（3）：1121-1135.100%，因此将其鉴定为发酵乳杆菌。[5]董 浩，王红丽，王 莘.降胆固醇乳酸菌的筛XIANDAISHIPIN现代食品/167分析检测Analysis and Testing选、鉴定及与中药协同作用的研究[J].长春大学学报，乳中高产胞外多糖乳酸菌的筛选与鉴定[J].食品工业2016（10）：53-58.科技，2016，37（7）：143-147.[6]汤艳燕，龙 谋，黄盛蓝，等.不同色变泡萝卜[9]陈 佩，党 辉，孟 科，等.一株高产胞外多中挥发性成分的比较研究[J].中国调味品，2018，43糖乳酸菌的筛选与鉴定[J].陕西农业科学，2017，63（6）：1-5.（2）：1-4.[7]刘素纯，吕嘉枥，蒋立文.食品微生物学实验[10]黄承敏，肖 茜，王蓉蓉，等.一株高产胞外多[M].北京：化学工业出版社，2013.糖乳酸菌的分离鉴定及其产胞外多糖的研究[J].中国[8]陈孝勇，赵 欣，骞 宇，等.传统发酵牦牛酸酿造，2019，38（1）：80-83.（上接第1页）表1 方法1、2的标定对比表标准1标准2实验溶液类别改进前改进后改进前改进后空白样品空白样品空白样品空白样品贮备液/mL020010010010碘标液加入量/mL2525303020203030硫代硫化钠消耗量均值/mL23.5067828.2622.0219.0512.7928.5222.444.2 温度和淀粉溶液的影响参考文献：[1]邢书才，杨 永，岳亚萍，等.碘量法滴定分析在实验时，若是温度相对较高，淀粉溶液会发生中影响分析质量因素的研究[J].中国测试，2018，44一定的变化，因此一定要对温度进行控制，确保反应（9）：44-50.的灵敏度[5]。同时，淀粉溶液需要现配现用，配制时[2]孔 玲，代 婷，杜礼霞，等.碘量法测定葡萄间较长的溶液不能使用，以降低对分析质量的影响，糖含量的影响因素研究[J].西南师范大学学报：自然保证实验结果的准确性。科学版，2017，38（7）：163-166.5 结语[3]杨荣清.浅析短碘量法测定铜精矿中铜含量的影响因素[J].科学技术创新，2018（29）：14-15.综上所述，本文利用实验的方式，对碘量法滴定[4]孙彬彬，童 俊，鹿 慧，等.EDTA滴定法结合分析中影响分析质量的因素展开了分析和阐述，其目酸碱滴定法用于碱液中锌、锡的联合测定以及游离碱的是明确其影响因素，并进行相应的改进，以此保证的测定[J].冶金分析，2018，38（5）：58-63.碘量法滴定分析的准确性，展现出碘量法滴定分析的[5]戴兴德，白 莹，张小林.自动电位滴定法间接优势，促进相关行业的发展。测定过氧乙酸消毒液中过氧乙酸[J].理化检验：化学分册，2018（8）：970-972.168/现代食品XIANDAISHIPIN
