产志贺毒素大肠埃希菌的分子生物学鉴定和
耐药性分析1
李咏梅，李凡
吉林大学基础医学院病原生物学教研室, 1320011
E-mail：mayflower380@163.com摘 要：本文采用多重PCR（multiplex PCR, mPCR）法对产志贺毒素大肠埃希菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC）分离株进行毒力基因的分子生物学鉴定；用WHO推荐的K-B法对分离株进行抗生素的敏感性测定，以了解stx1、stx2、eaeA、hlyA 4种毒力基因的分布情况，以及分离株对18种抗生素的敏感性。结果显示产志贺毒素的大肠埃希菌共有46株，其中两种毒素均产生的有22株（47.8%）；单纯产生stx1的有16株（36.9%），stx2的有8株（17.4%）；四种毒力基因均存在的有19株（41.3%），血清型为O157:H7，而非O157:H7血清型的菌株（23/46）中，4种毒力基因同时存在的仅有3株（6.6%），但有13株（56.9%）hlyA基因阳性。全部STEC对复方新诺明耐药，对链霉素耐药率为28.3%，氨苄西林为30.4%，红霉素为69.6%，而且有5株对至少4种以上抗生素多重耐药，耐药谱为复方新诺明-链霉素-红霉素-氨苄西林。非O157型 STEC耐药菌次为122， 而O157 型为63。 实验结果证明mPCR法可以快速检测STEC特征性毒力基因，以判定其致病性能。非O157型STEC对抗生素较易形成耐药性。 关键词：STEC；鉴定; 耐药性
1．引言
STEC是世界上人类食物中毒的重要致病因子，也是引起大规模食源性食物中毒的主要病原菌。STEC中有100余个血清型的致病性大肠杆菌可以致病，主要血清型是O157H7，可引起非出血性腹泻，出血性结肠炎（haemorrhagic colitis, HC），溶血性尿毒综合症(haemolytic uraemic syndrome, HUC)。但是，近年来非O157H7 STEC引起的HC、HUC在逐年增加。由于E.coli O157H7不发酵山梨醇而比非O157H7 STEC容易鉴定，所以非O157H7 STEC常被人们所忽视。而STEC致病的特征性毒力因子是1型志贺毒素（Shiga toxin type1, stx1）和2型志贺毒素（Shiga toxin type2, stx2）,分别由stx1基因编码和stx2基因编码。然而，其他毒力因子如由eaeA基因编码的紧密素（intimin）也称黏附抹平因子（attachment and effacement factor）；由hlyA基因编码的溶血素（hemolysin）等也是重要的毒力因素。因此，用多重PCR技术对标本进行STEC毒力基因的鉴定，不仅可作特征性鉴定，而且还可对其潜在的致病性能作出前瞻性判定。 1
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本课题为高等学校博士学科点专项科研基金资助课题，编号为30271251
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尽管STEC所引起的腹泻多数是自限性的，但是早期应用抗生素进行治疗，可以减少发展成HUC的病历。但是不良后果则是EHEC多药耐药菌株的增加[3]。为了了解STEC在各种来源标本中的分布及毒力基因存在情况，及分离株对临床常用抗生素的敏感性，本文作如下报告：
2．材料和方法
1.1材料
1.1.1试验标本 取自于长春市、吉林市儿童医院住院腹泻患儿粪便，长春市、吉林市防疫站提供的食品、水源、动物粪便中初分离出的大肠埃希菌。
1.1.2 质控菌株 大肠埃希菌ATCC25922，金黄色葡萄球菌ATCC25923，铜绿假单胞菌ATCC27853，吉林大学基础医学院病原生物学教研室提供。
1.1.3试剂 PCR用试剂均购于北京鼎国生物技术发展中心，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司，批号200208。
1.1.4仪器 PCR扩增仪（新加坡）；UV WHITE-2020D凝胶成像系统；DY-WI恒压恒流水平电泳仪（北京）。
1.2方法
1.2.1标本分离和处理 对临床采集的腹泻患者粪便标本，动物粪便标本1g用Cary-Blair培养基运送，实验室初步分离出可疑为大肠埃希菌；环境和食品标本1g先行肉汤增菌，后接种麦康凯培养基。上述菌株均经37℃培养18h-20h，用接种环取2-3个可疑菌落，置500μl灭菌双蒸水或生理盐水中，混匀，100℃煮沸10-15min，振荡混匀，13 000g离心1min，上清液即可用于PCR模板。
1.2.2 mPCR鉴定 STEC的四种毒力基因的引物序列及扩增片段的大小见表1
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mPCR的反应总体积为50ul，在0.5ml反应管中依次加入10×buffer ，0.2mmol/l 的dNTPs，10pmol的引物每条1.5ul,TaqDNA酶1U,模板2ul，双蒸水补至50ul。设阳、阴性对
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照。反应程序为94℃7min变性模板DNA，94℃1min,56℃1min,72℃1min，30个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，分子量100-1200bp的Marker作参照，EB染色后用琼脂糖凝胶成像软件分析系统检测和分析结果。（见图1）
对鉴定为STEC的菌株进行血清型分型，大致分成Ｏ157和非Ｏ157两群。
1.2.3 STEC的耐药性监测 采用WHO推荐的K-B法对分离鉴定的全部STEC菌株，进行18种常用抗生素的药物敏感试验，结果依照NCCLS判定
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。
3.结果
3.1 STEC的分子生物学鉴定
从各种标本中分离出可疑大肠埃希菌112株，经mPCR鉴定出能产生志贺毒素的菌株46株，来源遍布人、动物粪便，污水，食品，数量上无显著性差异。其中两种毒素均产生的有22株（47.8%）；单纯产生stx1的有16株（36.9%），stx2的有8株（17.4%）；四种毒力基因菌存在的有19株（41.3%）。46株STEC中有23株为O157H7，23株非O157H7 。23株O157型STEC中，有19株（82.6%）stx1、stx2、eaeA、hlyA基因均阳性；而非O157中仅有3株（6.6%）stx1、stx2均阳性，eaeA基因阳性1株（2.2%），hlyA基因阳性13株（56.9%）。即非O157菌株中hlyA基因的携带率要高于eaeA基因。见表2
表2 46株STEC四种毒力基因的分布情况
基因型
菌株数(n)
血清型
构成比（%）
stx1＋stx2＋eaeA＋hlyA 19 O157:H7 41.3 stx1＋stx2＋hlyA 1 non-O157 2.2 stx1＋stx22 non-O157 4.3 stx15 non-O157 10.9 stx22 non-O157 4.3 stx1＋hlyA 11 non-O157 23.9 stx2＋eaeA＋hlyA 4 O157:H7 8.8 stx2＋hlyA 1 non-O157 2.2 stx2＋eaeA 1 non-O157 2.2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
图1 STEC毒力基因的分布 1和9为Marker，
2为阳性对照，10为阴性对照，3-8为待测菌株。
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3.2药物敏感试验
46株STEC，在所采用的18种临床常用抗生素的测试中，对复方新诺明（SXT）、氨苄西林（AM）、链霉素（S）、红霉素（E）氨曲南（AZT）耐药率较高，对其余抗生素耐药率较低。所有菌株对SXT耐药，并且存在多重耐药，耐药谱为复方新诺明-链霉素-红霉素。在23株O157型STEC中6株（26.1%）对链霉素，3株（13.0%）对氨苄西林耐药。15株（65.2%）对红霉素耐药。在23株非O157型STEC中7株（30.4%）对链霉素耐药，11株（47.8%）对氨苄西林耐药，17株（73.9%）对红霉素耐药，至少有5株达到耐4种以上的抗生素，方式为复方新诺明-链霉素-红霉素-氨苄西林。与O157型相比，仅存在对氨苄西林耐药性的差异P＜0.05。非O157型STEC的耐药总菌次为122株，而O157型为63株。详见表3
表3 46株STEC对抗生素的敏感试验结果 抗生素
敏感
耐药
R（%）
氯霉素（C） 44 2 4.3 奈替米星（NET） 42 4（2* 2） 8.7 氨曲南（AZT） 36 10（5* 5） 21.7 奥格门丁（AMX/CA） 39 7（2* 5） 15.2 头孢克罗（CEC） 39 7（2* 5） 15.2 复方新诺明（SXT） 0 46（23*23） 100 哌拉西林（PIP） 40 6 13.0 头孢吡肟（FEP） 42 4 8.7 头孢噻吩（CF） 40 6 13.0 头孢曲松（CRO） 41 5 10.9 头孢唑啉（CZ） 40 6 13.0 庆大霉素（GM） 40 6 13.0 四环素（TE） 37 9（4* 5） 19.6 红霉素（E） 14 32（15* 17） 69.6 呋喃妥因（FT） 43 3 6.5 诺氟沙星（NOR） 41 5（1* 4） 10.9 氨苄西林（AM） 32 14（3* 11） 30.4 链霉素（S） 33 13（6* 7） 28.3
注：*为O157型STEC耐药株
4．讨论
STEC所产生的志贺样毒素（Shiga-like toxin, SLT）是引起Vero细胞变性、坏死的毒素，是介导致病的主要因素，而LEE（locus of enterocyte effacement）致病岛所携带的eaeA基因编码产生的紧密素蛋白可以促使细菌粘附于肠黏膜细胞，以及hlyA基因编码产生的溶血素都可增强本菌的毒性。
传统的鉴定方法包括营养培养、菌落选择、生化反应特性和志贺毒素的鉴定，需要几
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天的时间才能完成STEC的鉴定。本试验用多重PCR法可同时检测四种致病的毒力基因，这不仅可了解两型志贺毒素共同或单独存在的情况，而且还可以检测到另外两种毒力基因与之并存的状态。实验结果表明，在产志贺毒素的大肠埃希菌中，主要的血清型确实为O157，而且4种毒力基因并存的几率也很高。本试验所获得的非O157型的STEC株中stx1、stx2、hlyA基因存在的百分率分别可达41.3%、13.2%和56.7%，故非O157型STEC的致病性确实不容忽视。因此采用多重 PCR可以快速、特异地筛选标本中的STEC并对其潜在的致病性能给以评价。
本试验从环境标本（污水）、家畜、家禽粪便以及食品中也分离鉴定出一定数量的STEC，并检测到耐药性的存在。提示应该加强食品卫生的监督和管理以及合理在家养动物中使用抗生素，以减少食源性STEC型食物中毒的可能性和抗生素的选择压力。
对致病性大肠埃希菌引起的临床病症，及时投用敏感的抗生素，对减轻症状、延缓病程起着重要的作用。因此经常了解细菌的耐药趋势和抗菌药物选择压力，将经验用药改变为根据细菌药敏试验结果使用抗生素，避免滥用抗生素，从而减少耐药菌株产生及耐药的严重程度。
STEC耐药菌株的日益增多，与许多因素有关，所以加强本菌耐药性的发生以及耐药性的传递的研究显得日趋重要。
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参考文献
[1] Meng, J., Zhao, S., and Doyle, M.P. Virulence genes of Shiga toxin-producing Escherichia coli isolated from food, cattle and humans. Int. J. Food Microbiol. 1998a. 45: 229-235.
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Molecular Detection and Antibiotic Susceptibilities
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of Shiga Toxin-producing E.coli
YongMei Li，Li Fan
Department of pathogenibiology, fundamental medical college. Jilin university; Jilin 132001
Abstract
This paper to explore the distribution of virulence genes in Shiga toxin-producing Escherichia coli , and the antibiotic susceptibility for all isolates. Virulence genes were detected by using multiplex PCR assay; and antibiotics susceptibility was tested by Kirby-Bauyer protocol. The results show that of 46 STEC isolates, 22(47.8%) isolates carried the marker gene for stx1 and stx2 . Four kinds of virulence gene, stx1, stx2 combined with the intimin encoding gene eaeA and the enterohaemolysin encoding gene, hlyA were detected in 19(41.3%) O157 isolates. 13(56.9%)non-O157 STEC carried hlyA gene. All STEC strains resisted to Sulfamethoxazole timethoprim , and the rate of resistant to Ampicillin, Erythromycin and Streptomycin was respectively 30.4%, 69.6%, 28.3%. 5 isolates resisted to multiple antibiotics. The mPCR assay may be used to rapid and specific identify marker virulence gene of STEC; non-O157 STEC strains are liable to be antibiotic resistance.
Keywords：STEC ; molecular detection; antibiotic susceptibilities
作者简介：李咏梅，女，1964年生，博士研究生，主要研究方向是细菌遗传学。
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