福建农业学报２７（５）：４６５￣４６９，２０１２ Ｆｕｊｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 文章编号：１。０８—０３８４（２０１２）０５－－４６５－－０５ 王晓丰，薛晖，丁正峰，等．草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的建立［Ｊ］．福建农业学报，２０１２，２７（５）：４６５—４６９－ ＷＡＮＧ Ｘ—Ｆ．ＸＵＥ Ｈ，ＤＩＮＧ Ｚ－Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＴ—ＬＡＭＰ） Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｒａｓｓ Ｃａｒｐ Ｒｅｏｖｉｒｕｓ ＥＪ］．Ｆｕｊｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１２，２７（５）：４６５—４６９・ 草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的建立 王晓丰 ，薛 晖 ．一，丁正峰 ，唐建清 ，夏爱军 。，熊怀生。 （１．江苏省淡水水产研究所，江苏 南京 ２１００１７；２．国家大宗淡水鱼类产业技术体系南京综合试验站， 江苏 南京 ２１００１７；３．淮安市楚州区水产技术推广站，江苏 淮安 ２２３００１） 摘 要：为更加快速、灵敏地检测草鱼呼肠孤病毒（Ｇｒａｓｓ Ｃａｒｐ Ｒｅｏｖｉｒｕｓ，ＧＣＲＶ），建立环介导等温扩增（ＲＴ— ＬＡＭＰ）检测方法。根据ＧｅｎＢａｎｋ中ＧＣＲＶ ＨＺ０８等毒株ＶＰ６蛋Ａ基因序列设计引物，以ＧＣＲＶ弱毒疫苗株 （ＧＣＨＶ－８９２）总ＲＮＡ为模板建立ＲＴ—ＬＡＭＰ反应，对扩增产物用性内切酶ＰｖｕⅡ进行酶切鉴定，所得酶 切产物大小符合预期值。随后对ＬＡＭＰ反应体系包括Ｍｇ 、ｄＮＴＰｓ、甜菜碱（ｂｅｔａｉｎｅ）和内外引物浓度比进 行了优化，并以含ＶＰ６蛋白基因的重组质粒（ｐＥＡＳＹ—ＶＰ６）为模板考量了该方法的敏感性，结果显示最低检测 限为１０ ｃｏｐｉｅｓ・ Ｉ ，比ＲＴ—ＰＣＲ检测方法敏感１０倍。特异性试验表明与白斑综合征病毒（ＷＳＳＶ）、嗜水气 单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、病毒性神经坏死病毒（ＶＮＮＶ）无交叉反应。应用ＲＴ—ＬＡＭＰ方法检测１６份 疑似出血病草鱼，６份病料获得了阳性扩增，与ＲＴ—ＰＣＲ检测结果一致。 关键词：草鱼出血病；呼肠孤病毒；逆转录环介导等温扩增；检测方法 中图分类号：Ｓ ９１７ 文献标识码：Ａ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＴ－ＬＡＭＰ） Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｒａｓｓ Ｃａｒｐ Ｒｅｏｖｉｒｕｓ ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ—ｆｅｎｇ ，ＸＵＥ Ｈｕｉ ～，ＤＩＮＧ Ｚｈｅｎｇ—ｆｅｎｇ ，ＴＡＮＧ Ｊｉａｎ－ｑｉｎｇ ～，ＸＩＡ Ａｉ—ｊｕｎ ”，ＸＩＯＮＧ Ｈｕａｉ—ｓｈｅｎｇ。 （１．Ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｊｉａｎｇｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ，Ｊｉａｎｇｓｕ ２１００１７，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｎａｎｊｉｎｇ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ Ｆｉｓｈｇｓ，Ｎｎｎｊｉｎｇ，．１ｉａｎｇｓｕ ２１００１７，Ｃｈｉｎａ；３．Ｈｕａｉ ａｎ Ｃｈｕｚｈｏｕ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｈｕａｉ ａｎ，Ｊｉａｎｇｓｕ ２２３００１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ＲＴ—ＬＡＭＰ ｖｉｒｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｇｒａｓｓ ｃａｒｐ ｒｅｏｖｉｒｕｓ（ＧＣＲＶ）．Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ＶＰ６ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＧＣＲＶ ｓｔｒａｉｎ ＨＺ０８ ｆｒｏｍ ＧｅｎＢａｎｋ， ａ ｓｅｔ ｏｆ ｆｏｕｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｏｆ ＧＣＲＶ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｆｏｒ ＲＴ—ＬＡＭＰ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ ＰｖｕⅡｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ． Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ＬＡＭＰ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ。ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｍｇ ，ｄＮＴＰｓ，ｂｅｔａｉｎｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｉｎｎｅｒ ｔｏ ｏｕｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ＶＰ６ ｇｅｎｅ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｉｎｉｍｕｍ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｉｓ １０ ｃｏｐｉｅｓ・Ｌ～．ａ ｔｅｎｔｈ ｔｈｅ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ＲＴ—ＰＣＲ．Ｎｏ ｃｒｏｓｓ—ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ａｍｏｎｇ ｗｈｉｔｅ ｓｐｏｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ（ＷＳＳＶ），Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ （ＶＮＮＶ）ｉｎ ＲＴ—ＬＡＭＰ．Ｓｉｘｔｅｅｎ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｇｒａｓｓ ｃａｒｐ ｏｆ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａｓｓａｙ，ａｎｄ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＲＴ—ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔ，ｓｉｘ ｓａｍｐｌｅｓ ｇｏｔ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｇｒａｓｓ ｃａｒｐ；ｒｅｏｖｉｒｕｓ；ＲＴ－Ｉ ＡＭＰ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ Ｃａｒｐ Ｒｅｏｖｉｒｕｓ， 草鱼呼肠孤病毒（Ｇｒａｓｓ 是水生呼肠孤病毒属中致病力最强的毒株…，具有 ＧＣＲＶ）是我国分离、鉴定的第１ 株鱼类病毒，也 高度传染性和致死性，主要危害１龄草鱼种引起出 收稿日期： ２０１２—０３—１０初稿；２０１２—０４—０６修改稿 作者简介： 王晓丰（１９８４一），男，硕士，研究实习员，主要从事水产病害研究（Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｎｇｘｉａｏｆｌ９８３＠１６３．ｃｏｍ） 通讯作者： 薛晖（１９６８一），男，硕士，研究员级高级工程师，主要从事水产病害研究（Ｅ—ｍａｉｌ：ｊｓｘｕｅｈｕｉ＠１６３．ｃｏｍ） 基金项目： 国家现代农业产业技术体系建设专项（ＣＡＲＳ－４６—３１） ４６６ 福建农业学报 第２７卷 血病，死亡率最高可达９Ｏ 以上 ］，给水产养殖 业造成了巨大的经济损失。草鱼出血病临床症状和 病理表现复杂多样，基本可以归纳为３种类型，分 别是：红肌肉型、红鳍红鳃盖型和肠炎型［３］。“一 病多症”以及混合其他病原的多重感染更是给疾病 的早期诊断和防控带来了很大的困难，因此，建立 敏感、快速的检测方法显得尤为迫切。 目前用于检测ＧＣＲＶ的方法主要有病毒分 离Ⅲ２］、电镜观察ｌ＿４ 及ＲＴ－ＰＣＲｌ５ 等，这些方法具有 准确性好、结果直观等优点，但也存在着操作繁 琐，周期较长，所需仪器昂贵等缺憾，不能满足临 床上快速、敏感的检测要求。日本学者Ｎｏｔｏｍｉ 等ｌ６ 发明的环介导等温扩增（Ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）检测方法兼具特 异性好、敏感性高及简便易行的优点，已被广泛应 用于各种病原体的检测，如白斑综合征病毒 ］、溶 血性链球菌 ］、弓形虫ｌ＿ｇ 等。ＬＡＭＰ的技术原 理 是针对靶基因的６个区域设计４条特异性引 物，利用具有链置换活性的ＤＮＡ聚合酶在６５℃的 恒温条件下保温１ ｈ完成核酸扩增反应，形成一系 列不同长度的茎环结构ＤＮＡ产物，结果可通过凝 胶电泳或荧光染料显色的方法进行判读。本研究据 此建立了ＧＣＲＶ的ＬＡＭＰ检测方法，并对反应体 系进行了优化，以期能够用于草鱼出血病的临床快 速诊断。 １ 材料与方法 １．１参考毒株、菌株与质粒 草鱼出血病弱毒疫苗（ＧＣＨＶ一８９２株）由珠 江水产研究所提供；对虾白斑综合征病毒 （ＷＳＳＶ）、嗜水气单胞菌Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ和 病毒性神经坏死病毒（ＶＮＮＶ）由本实验室保存； 包含ＧＣＨＶ一８９２株ＶＰ６蛋白基因的重组质粒 ｐＥＡＳＹ—ＶＰ６由本室构建。 １．２ 主要试剂 ＴｒａｎｓＺｏｌ、反转录试剂盒等购自北京全式金生 物技术有限公司；Ｂｓｔ ＤＮＡ聚合酶大片段购自纽 英伦生物技术（北京）有限公司；ＰｖｕⅡ核酸内切 酶、ＤＮＡ分子量标准购自生工生物工程（上海） 有限公司。 １．３ 引物设计与合成 参考ＧＣＲＶ—ＨＺ０８株和ＨＡ一２０１１毒株ＶＰ６蛋 白基因序列（登录号ＧＵ３５０７４６、ＪＮ５６５１４７），运 用专业ＬＡＭＰ引物设计软件（Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ３）在线设计引物并送交上海生物工程技术服务 有限公司合成。引物序列如下： Ｆ３：５ 一ＴＴＧＣＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＧＡＴＧＧＡ一３ ； Ｂ３：５＇－ＧＣＡＡＡＧＣＡＣＧＧＴＴＴＧＴＧＧ～３ ； ＦＩＰ（Ｆ】ｃ＋Ｔ４＋Ｆ２）：５ 一ＴＡＧＡＧＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧ－－ ＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＧＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＴＣ一３ ； ＢＩＰ（Ｂ ｃ＋Ｔ４＋Ｂ２）：５ 一ＧＣＣＣＴＡＴＣＧＣＴＣＴＣＣ：Ｔ— ＧＧＡＣＴＴＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＡＣＧＴＣＣＧＴＧＡＡＴ一３ 。 在内引物ＦＩＰ中引入的Ｐｖｕ１Ｉ酶切位点以斜体 加粗显示。 １．４ 病毒ＲＮＡ的提取与反转录 ＧＣＲＶ疫苗冻干品加适量生理盐水溶解，取 ３００ Ｌ按ＴｒａｎｓＺｏｌ使用说明提取病毒总ＲＮＡ。 随后立即进行反转录，反应体系和程序按照试剂盒 说明书操作。 １．５ ＬＡＭＰ预试验及产物酶切鉴定 参考文献［７，１０－｝建立２５ Ｌ的ＬＡＭＰ预试 验反应体系，包括：１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ反应缓冲液 ２．５ ＦＬ，１０ Ｆｍｏｌ・Ｌ一 的夕 弓Ｉ物Ｆ３／Ｂ３各０．５ Ｌ， ２Ｏ ｔｏｏｌ・Ｌ一 的内弓ｌ物ＦＩＰ／ＢＩＰ各２ Ｌ，１０ ｍｏｌ・Ｌ 的ｂｅｔａｉｎｅ ４ ｇＬ，２．５ ｍｍｏｌ・Ｌ 的 ｄＮＴＰｓ ２ Ｌ，８ Ｕ・ Ｌ 的Ｂｓｔ ＤＮＡ聚合酶１ ＦＬ，以及１ Ｌ疫苗毒株的ｃＤＮＡ，以双蒸水补齐。 反应程序是６５℃保温ｌ ｈ，继续８５。Ｃ ５ ｍｉｎ，结束 反应后取５“Ｌ在２ 琼脂糖凝胶上进行电泳。 为验证ＬＡＭＰ扩增产物的特异性，用性 内切酶ＰｖｕⅡ对扩增产物进行酶切。酶切体系２０ 肚Ｌ，包括：１０×Ｂｕｆｆｅｒ Ｇ ２／，Ｌ，Ｉ ＡＭＰ产物５ ｔｔＬ，Ｐｖｕ ｌＩ酶１ Ｌ，ｄｄＨ：Ｏ １２ Ｌ。酶切反应在 ３７℃温浴４ ｈ，结束反应后取５ Ｌ在５ 琼脂糖凝 胶上进行电泳。 １．６ ＬＡＭＰ反应体系的优化 优化体系采取设定某一组分的不同浓度梯度， 而其余组分则为固定值的策略。试验中分别对 Ｍｇ抖、ｄＮＴＰｓ、ｂｅｔａｉｎｅ浓度和内外引物浓度比设 置了不同的梯度进行反应，结束反应后通过凝胶电 泳观察各组分的最佳反应浓度。Ｍｇ 浓度设置了 ０、１、３、５、７、９ ｍｍｏｌ・Ｌ 共６个梯度； ｄＮＴＰｓ浓度设置了０．２、０．６、１．０、１．４、１．８ ｍｍｏｌ・Ｌ 共５个梯度；ｂｅｔａｉｎｅ浓度设置了０．４、 ０．８、１．２、１．６、２．０ ｍｏｌ・Ｌ 共５个梯度；在固 定外引物浓度为０．２ Ｆｍｏｌ・Ｌ 的条件下，内外引 物浓度比设置了１：２、１：４、１：６、１：８、１：１０、 １：１２共６个梯度。 １．７敏感性试验 用分光光度计定量质粒ｐＥＡＳＹ—ＶＰ６的浓度， 第５期 王晓丰等：草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的建立４６９ 的基础上，设置不同的内、外引物浓度梯度，发现在 １：８时扩增效率高，电泳图谱较清晰，同时引物用 量少。因此，经过优化后的最佳反应体系组成是： １０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ反应缓冲液２．５ Ｌ，１０／．ｔｍｏｌ・Ｌ－１ 的外引物Ｆ３／Ｂ３各０．５ Ｌ，２０ ｍｏ１．Ｌ 的内引 物ＦＩＰ／ＢＩＰ各２ Ｌ，１０ ｍｏｌ・Ｌ 的ｂｅｔａｉｎｅ ４ Ｌ， ２５ ｍｍｏｌ・Ｌ 的ＭｇＣ１２ １肚Ｌ，２．５ ｍｍｏｌ・Ｌ 的 ｄＮＴＰｓ ６ Ｌ，８ Ｕ・ Ｌ－１的Ｂｓｔ ＤＮＡ聚合酶１ Ｌ， 模板ｅＤＮＡ １ Ｌ，以双蒸水补齐至２５ Ｌ。 由于ＧＣＲＶ基因组是分节段的，因而造成不 同病毒毒株的复杂性和高度可变性［１］。检索 ＧｅｎＢａｎｋ上已公布的ＧｃＲＶ毒株ＶＰ６基因并进行 多序列比较分析，进化关系明显归为２类：ＨＺ０８ 和ＧＤ１０８毒株为一类，ＧＣＲＶ一８７３、８７５、８７６和 ９９１等毒株为另一类。在之前建立草鱼出血病ＲＴ－ ＰＣＲ检测方法的过程中，曾参照ＧＣＲＶ－８７３、８７５ 等毒株的ＶＰ６基因序列设计引物来扩增ＧＣＨＶ一 ８９２毒株，但一直未能有阳性结果；而后参照 ＨＺ０８毒株ＶＰ６基因设计的引物则获得了阳性扩 增。扩增产物经克隆后测序，结果与ＨＺ０８毒株的 序列相似性为９７ ，因此ＧＣＨＶ－８９２毒株的ＶＰ６ 基因应与ＨＺ０８株归为１类。运用所建立的ＲＴ— ＬＡＭＰ方法检测采集自江苏淮安、镇江、扬州等 地区的１６份草鱼病样，有６份病料获得了阳性扩 增，对另外的１０份阴性样品采用文献Ｅ５－１的引物和 方法依然未能获得阳性结果。ＬＡＭＰ技术具有高 度特异性，能从仅相差１个核苷酸的基因标本中， 找出相应的靶序列进行扩增［１ ，因此本研究建立 的草鱼出血病ＲＴ—ＬＡＭＰ检测方法只适用于和 ＨＺ０８毒株ＶＰ６基因属同一类型的草鱼呼肠孤病 毒检测。综上，说明目前在江苏境内流行的草鱼呼 肠孤病毒株与ＨＺ０８毒株亲缘关系相近，本实验室 先前测序的ＨＡ一２０１１毒株ＶＰ６基因部分序列与 ＨＺ０８毒株有９９ 的相似性也证明了这一点。回访 调查明确养殖场并未有过免疫，可排除检测阳性毒 株属于疫苗毒的可能，鉴于ＨＡ－２０１１毒株与疫苗 毒株极大的序列相似性，因此疫苗免疫将有可能预 防该病的进一步流行。 参考文献： ［１］肖雪，颜其贵，欧洋，等．草鱼呼肠孤病毒的研究进展［Ｊ］． 水利渔业，２００６，２６（５）：１０６—１０９． ［２］徐洋，郝贵杰，沈锦玉，等．两株草鱼呼肠孤病毒江西株的分 离与鉴定Ｉ－ｊ］．淡水渔业，２０１０，４０（３）：４４—４９． ［３］王方华，李安兴．草鱼病毒性出血病研究进展［Ｊ］．南方水 产，２００６，２（３）：６６—７１． ［４］丁清泉，余兰芬，王学兰，等．草鱼出血病鱼主要器官组织的 超薄切片观察及感染力的比较［Ｊ］．水产学报，１９９０，１４ （１）：６６—６９． ［５］ＺＨＡＮＧ Ｌ Ｌ，ＬＵＯ Ｑ，ＦＡＮＧ Ｑ，ｅｔ ａ１．Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＲＴ—ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒａｓｓ ｃａｒｐ ｒｅｏｖｉｒｕｓ ［Ｊ］．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１０，１６９（１）：２８—３３． ［６］ＮＯＴＯＭＩ Ｔ，ＯＫＡＹＡＭＡ Ｈ，ＭＡＳＵＢＵＣＨＩ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｌｏｏｐ－ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０００，２８（１２）：６３． ［７］ＫＯＮＯ Ｔ，ＳＡＶＡＮ Ｒ，ＳＡＫＡＩ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｉｔｅ ｓｐｏｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｓｈｒｉｍｐ ｂｙ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００４，１１５； ５９—６５． ［８］尹欢，李琦，陈江源，等．溶血性链球菌ＬＡＭＰ检测方法的 建立［Ｊ］．食品科学，２０１０，３１（２２）：３１１—３１４． ［９］陈道桢，许飞，葛海燕，等．环介导等温扩增检测弓形虫方法 的建立［Ｊ］．中国实验诊断学，２０１１，１５（１０）：１７１２～１７１５． ［１０］ＶＡＲＧＡ 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