课程名称：微生物学实验 课程编码：0431030706 英文名称：Microbiological experiment 学 时：36 学 分：2 适用专业：制药工程及相关专业 课程类别：必修 课程性质：专业基础课 先修课程：微生物学 参考教材：杜连祥，路福平主编。《微生物学实验技术》，中国轻工业
出版社，2005，8.
一、 制定本大纲的依据
本教学大纲是根据教学目的、要求以及实际教学学时制定的，课程总学时为36学时。在不妨碍教学内容的系统性与逻辑性的前提下（包括前后实验内容的衔接关系），主讲教师可以按照自己的具体教学情况或经验，适当地将某些内容的次序加以变更或调整。
二、 本实验课程的具体安排
实验项目的设置及学时分配（表）
序实验项目名称 号 1 细菌培养基的配制与灭菌 (1) 培养基的概念和种类 (2) 培养基的配制原则、方法和注意 事项 (3) 高压蒸汽灭菌的原理、操作步骤 和注意事项 (4) 培养基的灭菌 内容简介（50字左右） 学时 要求 2 必修 类型 类别 人数 验证 专业 2 实验实验实验实验每组 1
2 细菌的接种与培养 (1) 无菌操作 (2) 细菌接种方法: 斜面接种, 平板划线接种, 穿刺接种, 液体试管接种 (3) 细菌的培养 2 必修 验证 专业 2 3 显微镜的构造及使用技术 (1) 显微镜的种类 (2) 显微镜的工作原理 (3) 显微镜的构造：光学系统和机械系统 (4) 干燥系物镜的使用和注意事项 2 必修 验证 专业 2 4 细菌染色与形态观察 (1) 细菌的染色方法：简单染色、革兰氏染色; 芽孢染色。 (2) 革兰氏染色的原理、步骤和注意事项 (3) 细菌个体形态的观察 (5) 细菌群体形态菌落特征的观察 (5) 穿刺接种和液体接种菌体生长特征观察 2 必修 验证 专业 2 5 真菌培养基的配制与灭菌 (1) 酵母菌培养基的配制与灭菌 (2) 霉菌培养基的配制与灭菌 (1) 酵母菌接种与培养：斜面接种、 平板划线、液体接种 (2) 霉菌的接种与培养：斜面点接和 平板接种 2 必修 验证 专业 2 6 真菌的接种与培养 2 必修 验证 专业 2 7 酵母菌水浸片的制备和形态观察 (1) 酵母菌水浸片的制备 (2) 酵母个体形态的观察 (3) 酵母菌菌落形态观察 (4) 酵母液体培养特征 2 必修 验证 专业 2 2
8 酵母菌细胞计数、出芽率和死亡率的测定 (1) 血球计数板的使用 (2) 酵母菌计数 (3) 酵母菌出芽率的测定 (4) 酵母菌活体染色和死亡率的测定 2 必修 验证 专业 2 9 酵母菌细胞大小的测定 (1 )显微测微尺的使用 (2) 目镜测微尺的标定 (3) 酵母细胞大小的测定 2 必修 验证 专业 2 10 霉菌的形态观察 (1)毛霉、根霉、黑曲霉、青霉的个体 形态观察 (2) 毛霉、根霉、黑曲霉、青霉的群 体形态观察 2 必修 验证 专业 2 11 细菌生理生化实验 (1) 培养基、各种试剂的配制与灭菌(2) 各种试验菌的接种与培养 (3) 结果观察与分析 6 必修 综合 专业 2 12 细菌总数和大肠菌群的测定 (1) 培养基、试剂的配制与灭菌 (2) 样品处理 (3) 接种与培养 (4) 细菌菌落计数 (5) 大肠菌群测定 8 必修 综合 专业 2 13 微生物菌种保藏 (1) 菌种保藏原理和方法 (2) 真空冷冻干燥保藏菌种 (3) 清点仪器、洗刷玻璃器皿 2 必修 验证 专业 2 三、 本实验课在该课程体系中的地位与作用
微生物学实验课是与微生物学理论课同学期开设的一门重要的技术基础课。通过本课程
的教学，使学生较熟练的掌握微生物学实验的基本操作技术和初步掌握研究微生物的基本方法。通过对具体微生物材料的观察、分析，进一步加深和巩固对微生物学理论课所学知识的理解并提高学生分析和解决实际问题的能力。
四、 学生应达到的实验能力与标准
通过本课程的教学，使学生掌握进行常规常见微生物检测的实验原理和基本方法，具有独立进行微生物学检测实验方案的设计、初步具备利用微生物学手段分析和解决发酵生产过
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程中有关实际问题和从事有关科学研究工作的能力。
要求学生了解实验室的布置以及实验室的规则；使学生熟练掌握显微镜的使用技术并熟悉显微镜的使用技术并熟悉显微镜的构造及保养方法；学会干热灭菌箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱的使用；具有选择和制备培养基的能力；掌握基本染色原理和方法以及制片技术；熟悉细菌、酵母菌、霉菌的基本形态结构、生理生化特征和血清学特性，具有菌种初步鉴定的基本技能；通过实验，使学生学会无菌操作方法，掌握微生物的分离、筛选和育种的基本知识和技能，了解菌种保藏的一般方法。
五、 讲授实验的基本理论与实验技术知识
实验一 细菌培养基的配制与灭菌 1.实验内容与要求：
（1）了解加热灭菌的基本原理，掌握实验室常用的几种加热灭菌技术 （2）了解配制培养基的基本材料，学习配制肉汤培养基的方法并掌握其要点。 2.实验材料：
（1）培养基组成 牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，pH值7.2，固体时加琼脂2%。 （2）试剂 6mol/lHCl、10%NaOH。
（3）其它工具：台秤、量筒、试管、三角瓶、烧杯、分装架等。 实验二 细菌的接种与培养 1.实验内容与要求：
（1）掌握无菌操作的概念和基本操作技术； （2）了解细菌常用的培养基以及培养条件； （3）了解平板划线分离菌种的原理和操作要点。 2.实验材料：
（1）菌种：大肠杆菌(Escherichia coli)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，八叠球菌(Sarcina sp.)。
（2）培养基：肉汤固体斜面（2个/菌），肉汤液体试管（2管/菌），平板划线接种肉汤固体培养基（10-15ml/皿，2块/菌），平板点接肉汤固体培养基（10-15ml/皿，3支菌用1块），穿刺用肉汤半固体培养基（2管/菌）。
（3）其它工具：接种针，接种环，酒精灯或煤气灯，消毒酒精棉球，镊子，试管架，标签纸，培养箱（37℃）
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实验三 显微镜的构造及使用技术 1.实验内容与要求：
（1）了解普通光学显微镜的构造、原理、维护及保养方法； （2）学会使用普通光学显微镜观察生物标本片。 2.实验材料：
普通光学显微镜，擦镜纸，标本片（可以用做好的酵母水浸片）等。 实验四 细菌染色与形态观察 1.实验内容与要求：
（1） 掌握简单染色法的操作技术；
（2）了解革兰氏染色的基本原理，并掌握革兰氏染色的操作技术； （3）掌握油镜的使用方法；
（4）了解细菌的个体形态和菌落培养特征。 2.实验材料：
（1）菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和八叠球菌(Sarcina sp.)的培养物。
（2）染色液：草酸铵结晶紫染色液，路哥氏碘液，番红染色液，95%乙醇。
（3）其他：显微镜，载玻片，接种环，镊子，香柏油，玻璃缸，二甲苯、酒精灯、擦镜纸、吸水纸。
实验五 真菌培养基的配制与灭菌 1.实验内容与要求：
（1）了解天然培养基的制备原理，掌握麦芽汁天然培养基的配制方法； （2）掌握土豆葡萄糖琼脂培养基的配制方法。 2.实验材料：
（1）培养基：麦芽汁培养基，土豆葡萄糖琼脂培养基。
（2）其他工具：接种环，试管，培养皿，三角瓶，玻璃U形管，酒精灯或煤气灯，酒精棉球，镊子，滤纸等。 实验六、真菌的接种与培养 1.实验内容与要求：
（1）掌握酵母菌和霉菌的接种方法，生长的培养基和培养条件； （2）掌握小室培养方法；
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（3）进一步掌握无菌操作的概念和基本操作技术。 2.实验材料：
（1）菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），热带假丝酵母（Candida tropicalis），八孢裂殖酵母 （Schizosaccharomyces octosporus）,总状毛霉（Mucor racemosus），黑根霉（Rhizopus nigricans），黑曲霉(Aspergillus niger)、桔青霉（Penicillium citrinum）。 （2）培养基：固体麦芽汁斜面（2个/菌），液体麦芽汁试管（2管/菌，酵母），平板麦芽汁划线接种（10-15ml/皿，1块/菌，酵母），平板点接麦芽汁固体培养基（10-15ml/皿，3个酵母菌用1块，霉菌1个/皿），用于小室培养的土豆葡萄糖琼脂培养基（2ml/管，1管/菌，共3管/组）。
（3）其它工具：接种环，接种钩、玻璃U形管，酒精灯或煤气灯，消毒酒精棉球，镊子，滤纸，试管架，标签纸，培养箱（酵母28℃，霉菌30℃）。 实验七、酵母菌水浸片的制备和形态观察 1.实验内容与要求：
（1）掌握酵母菌水浸片的制备；
（2）进一步熟悉低倍镜和高倍镜的使用方法； （3）了解酵母菌的个体形态和群体形态特征。 2.实验材料：
（1）菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），热带假丝酵母（Candida tropicalis），八孢裂殖酵母 （Schizosaccharomyces octosporus） （2）培养基：麦芽汁培养基，土豆葡萄糖琼脂培养基。
（3）其他工具：镊子，载玻片，盖玻片，玻璃棒，显微镜，滤纸，擦镜纸等。 实验八 酵母菌细胞计数、出芽率和死亡率的测定 1.实验内容与要求：
（1）了解血球计数板的构造、使用及计算方法，并利用血球计数板对酵母细胞进行计数；（2）对酵母细胞进行出芽率、死亡率的测定； （3）学会并掌握酵母菌的活体染色方法。 2.实验材料：
（1）菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）28℃下恒温培养48h的液体试管一支。 （2）试剂：以pH6.0的0.02mol/L磷酸缓冲液配制的0.05%美蓝染色液。 （3）其它工具：显微镜，血球计数板，盖玻片，酒精灯，无菌吸管，滤纸条等。
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实验九 酵母菌细胞大小的测定 1.实验内容与要求：
（1）学会测微尺的使用和计算方法； （2）掌握酵母细胞体积的测定方法。 2.实验材料：
（1）菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）液体培养液
（2）其它：显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺，载玻片，盖玻片，酒精灯，无菌吸管，滤纸条等。
实验十 霉菌的形态观察 1.实验内容与要求：
（1）掌握常见霉菌的具体形态； （2）学会霉菌浸片的制作方法。 2.实验材料：
（1）菌种：总状毛霉（Mucor racemosus），黑根霉（Rhizopus nigricans），黑曲霉(Aspergillus niger)、桔青霉（Penicillium citrinum）。
（2）培养基：10°Brix麦芽汁斜面培养基和固体平板培养基。用于小室培养的PDA（或察氏固体培养基）。
（3）乳酸苯酚油棉蓝染色液。
（4）器具： 接种钩、显微镜，载玻片，酒精灯，盖玻片，吸水纸，大头针，玻璃纸，镊子，刮棒，玻棒，20%甘油（可以用水代替）等。 实验十一 细菌生理生化实验 1.实验内容与要求：
（1）了解微生物在不同基质中的各种代谢途径和产生的不同代谢产物，明确生理生化反应在微生物菌种鉴定中的重要性；
（2）根据生理生化反应特点，掌握微生物的鉴定方法。
（3）了解糖发酵试验的作用及原理，学习糖发酵试验的操作技术，观察细菌发酵糖能力的区别。
（4）了解三糖铁高层琼脂斜面实验的应用及反应原理，学习三糖铁高层琼脂斜面的使用方法。
（5）了解柠檬酸盐试验的用途和原理，学习柠檬酸盐试验的技术操作。
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（6）了解甲基红试验的反应原理和用途，学习甲基红试验的操作技术。 （7）了解V-P试验的反应原理及用途，学习V-P试验的操作技术。 （8）了解吲哚试验的反应原理和用途，学习吲哚试验的操作技术。 （9）了解石蕊牛乳试验的反应原理及用途，学习石蕊试验的操作技术。 （10）了解明胶液化试验的应用及反应原理，学习明胶液化试验的操作技术。 （11）了解硝酸盐还原试验的应用及反应原理，学习硝酸盐还原试验的操作技术。 （12）了解硫化氢产生试验的用途及原理，学习硫化氢产生试验的操作技术。 2.实验材料：
（1）菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、八叠球菌（Sprcina sp.）。
（2）培养基：葡萄糖、乳糖发酵培养基，三糖铁琼脂高层斜面、西蒙氏柠檬酸盐培养基、缓冲葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、石蕊牛乳培养基试管、明胶培养基、硝酸盐培养基、硫酸亚铁琼脂培养基。
（3）试剂：甲基红试剂、6%萘酚酒精溶液、40%氢氧化钾溶液、吲哚试剂有两种：柯凡克氏试剂、欧-波试剂、亚硝酸试剂Ⅰ和Ⅱ
（4）其他：酒精棉球，酒精灯，接种针，接种环、恒温箱、锌粉、干净试管，洗耳球，1毫升吸管、电冰箱等
实验十二 细菌总数和大肠菌群的测定 1.实验内容与要求：
（1）学习并掌握测定菌落总数的基本方法； （2）学会微生物实验中菌落总数的报告方式； （3）学习并掌握大肠菌群的测定方法； （4）了解测定过程中每一步的反应原理。 2.实验材料：
（1）被检样品： 根据不同需要选择被检样品（如鲜奶，酱油，醋，啤酒等）。
（2）培养基： 营养琼脂培养基或肉汤固体培养基、乳糖胆盐发酵培养基、乳糖EMB培养基、乳糖发酵培养基。
（3）试剂：3.生理盐水 9ml/支×10，225ml/瓶×1，革兰氏染色液，芽孢染色液。 （4）其它 1ml无菌吸管数支，培养皿数套，水浴锅，酒精灯，试管架，培养箱、显微镜，
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研钵，杜氏管，试管，涂布管等。 实验十三 微生物菌种保藏 1.实验内容与要求：
（1）了解菌种保藏的基本原理； （2）初步掌握各种菌种保藏的操作技术。 2.实验材料：
（1） 普通冰箱、液体石蜡。
（2） 微生物：细菌、放线菌、酵母菌、霉菌
六、 实验的考核与成绩评定
本课程的成绩包括理论知识的考试（闭卷），平时成绩两部分。其中，理论知识考试占全课程70%，平时成绩占30%（其中出勤和课堂纪律占10分，实验操作技能占10分，实验报告占10分），共计100分。
七、主要参考书
1. 杜连祥等主编。《工业微生物实验技术》，天津市科学技术出版社，1992，10.
制定人： 骆健美
审定： 批准：
2007年9月
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