细胞复苏与冻存

关于细胞复苏

细胞冷冻保存与复苏原理

三木 转自 体外培养的原理和技术. 薛庆善 主编. 2001年2月.科学出版社, pp128-136

细胞冷冻保存与复苏原理

在低于-70℃的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。因此，采取适当的方法将生物材料降至超低温，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以适当的方法将冻存的生物材料恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。所谓冷冻保存，就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-700C的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。而复苏就是以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过程。不论是微生物、动

物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。

水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因此进入细胞内，造成细胞死亡。这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生冰晶损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使

细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条件下保存。在复苏时，一般以很快的速度升温，1-2分钟内即恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度的电解质溶液中过长的时间，从而无冰晶损伤和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。而且不同的冷冻保

护剂其冷冻保护效果也不一样。

冷冻速率

冷冻速率是指降温的速度，直接关系到冷冻效果。细胞在冷冻过程中会发生如下变化：当细胞被冷至-50C时，因溶液中加有冷冻保护剂而降低溶液的冰点，细胞内外溶液仍未结冰；当被冷至-5～-150C之间时，细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态。细胞内未结冰的水分子会比细胞外部分结冰溶液中的水分子具有更高的化学能。其结果是，细胞内水分子为了和细胞外水分子保持化学能的平衡，会向细胞外流动。冷冻速度不同，细胞内水分向外流动的情况也不相同：如果冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，细胞内溶质浓度增高，细胞内不会发生结冰；如果冷冻速度快，细胞内水分没有足够的时间外渗，结果随着温度的下降而发生细胞内结冰；如果冷冻速度非常快（即超快速冷冻），则细胞内形成的冰晶非常小或不结冰而呈玻璃状态（玻璃化冷冻）。Luyet（1973）证实液体的凝固可分为两种形式：一种是晶体化，溶液中的分子呈有序排列；另一种情况是非晶体即玻璃化，液体中的分子呈无序状态，保持未凝固前的状态。 不同的冷冻速度既然能使细胞内发生不同的生理变化，也可以对细胞产生不同的损伤。当冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。同时冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成较到冰晶，造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。超快速玻璃化冷冻对细胞存活来说是最为理想的冷冻方法。细胞内外呈玻璃化凝固，无冰晶形成或形成很小的冰晶，对细胞膜和细胞器不致造成损伤，

细胞也不会在高浓度的溶质中长时间暴露而受损。

不同细胞的最适冷冻速率不同。小鼠骨髓干细胞、酵母、人红细胞的最适冷冻速率分别为

1.

60C/min、70C/min和2000C/min。细胞与细胞之间的最适冷冻速率可在1.60C～3000C/min，故对一种细胞进行冷冻保存之前，首先需要测定其最适冷冻速率，以保证获得最高的冷冻存活率。

冷冻保存温度

冷冻保存温度是指能长期保存细胞的超低温度，在此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止，但经过长期保存，在复苏后仍能保持正常的结构和功能。

不同的细胞和生物体以及使用不同的冷冻保存方法要取得同样的冷冻保存效果，冷冻保存温度可以不同。但从实际和效益的观点出发，液氮温度（-1960C）是 目前最佳的冷冻保存温度。在-1960C时，细胞的生命活动几乎完全停止，但复苏后细胞的结构和功能完好。如果冷冻过程得当，一般生物样品在-1960C下均可保存十年以上。应用-700C～-800C保存细胞，短期内对细胞的活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显降低。在冰点到-400C范围内保存细胞的效果不佳。

复苏速率

冷冻保护体外培养物，除了必须有最佳的冷冻速率、合适的冷冻保护剂和冻存温度外，在复苏时也必须有最佳的复温速率，这样才能保证最后获得最佳冷冻保存效果。

复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。复温速率不当也会降低冻存细胞存活率。一

般来说，复温速度越快越好。常规的做法是，在370C水浴中，于1-2分钟内完成复苏。复温速度过慢，细胞内往往重新形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细胞损伤非常快，往往在极短的时间内发生。

冷冻保护剂

冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。冷冻保护剂常常配制成一定的溶液。一般来讲，只有红细胞、大多数微生物和极少数有核的哺乳动物细胞悬浮在不加冷冻保护剂的水或简单的盐溶液中，并以最适的冷冻速率冷冻，可以获得活的冻存物。但对于大多数有核哺乳动物细胞来说，在不加冷冻保护剂的情况下，无最适冷冻速率可言，也不能获得活的冷冻物。例如将小鼠骨髓细胞悬浮在不加冷冻保护剂的平衡盐溶液中，并以0.3～6000C/min的冷冻速率降温冷冻，98%以上的细胞会死亡；而加入甘油冷冻保护剂进行冷冻保存时，98%以上的细胞都可存活。

冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是一些小分子物质，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。甘油和DMSO并不防止细胞内结冰，在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷，让甘油或DMSO等成分渗透到细胞内，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。目前DMSO的应用比甘油更为广泛，但要注意的是，DMSO在常温下对细胞的毒性作用较大，而在40C时，其毒性作用大大减弱，且仍能以较快的速度渗透到细胞内。所以，冻存时DMSO平衡多在40C下进行，一般需要40～60分钟。

非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质，主要包括聚乙烯吡咯烷酮

（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等。其保护机制的假说很多，其中有一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中水分子结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。

不同的冷冻保护剂有不同的优、缺点。目前一般多采用联合使用两种以上冷冻保护剂组成保护液。由于许多冷冻保护剂（如DMSO）在低温下能保护细胞，但在常温下却对细胞有害，故在细胞复温后应及时洗涤冷冻保护剂。

冷冻保存方法

按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分，冻存方法可分为非玻璃化和玻璃化冻存两种。非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-700C～-800C，然后直接投入液氮进行保存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至-1000C以下，再直接投入液氮保存的方法。以该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。玻璃化冻存则是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法。以该中方法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成。但目前细胞冻存最常用的仍是前一种方法。

非玻璃化冻存方法

下面以肿瘤细胞和杂交瘤细胞为例，介绍非玻璃化冻存细胞的详细过程。

主要材料

（1）仪器设备：普通冰箱、-300C低温冰箱和-700C～-800C超低温冰箱、液氮冻存罐、高速离心机、电子计算机程控降温仪等；

（2）冻存管：容量为1ml或1.5ml；

（3）冷冻保护液：一般是以9份小牛血清或细胞培养液与1份DMSO混合而成。现配现用，或配制后防入普通冰箱冰盒内冷冻保存。使用前，于室温下水浴溶解；

（4）待冻存细胞：各种肿瘤细胞或杂交瘤细胞。

操作过程

1. 待冻存细胞悬液的制备

(1) 按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备单细胞悬液，并计算细胞总数；

(2) 将细胞悬液以800～1000r/min离心5min，去上清夜；

(3) 向细胞沉淀物中加入冷冻保护液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达1×106～1×107个/ml；

(4) 按每管1～1.5ml的量分装于冻存管内，拧紧管盖；

(5) 再冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期。

2. 分级冷冻

(1) 先将冻存管放入普通冰箱冷藏室（4～80C），约40min；

(2) 接着将冻存管置于普通冰箱冷冻室（-100C～-200C），约30～60min；

(3) 将冻存管转入低温冰箱（-300C），放置30min左右；

(4) 然后将冻存管转移到超低温冰箱（-700C～-800C），过夜；

(5) 最后将冻存管投入液氮保存。

3. 记录

做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及操作人员。

冻存结果

如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。

讨论

在使用DMSO前，不要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制时最好带手套。

在将细胞冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以免液氮从液氮罐内溅出。若液氮溅出，

可能对皮肤造成冻伤。操作过程中最好带防冻手套、面罩、工作衣或防冻鞋。

应注意控制冻存细胞的质量。既要在冻存前保障细胞具有高活力，还要确保无微生物污染，这样的细胞才具有冻存价值。另外，在每批细胞冻存一段时间后，要复苏1～2管，以观察其活力以及是否受到微生物的污染。

冻存管宜采用塑料冻存管，不宜使用玻璃安瓿。因为在复苏时，需要从-1960C的液氮中取出冻存管，立即投入37～400C温水中，温差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生危险。

玻璃化冻存方法

以下以人单核细胞为例说明这种细胞冻存方法（Takhashi et al. 1986）。

主要材料

（1）冷冻保护液：为Hanks平衡盐溶液加入20.5%DMSO（w/v）、15.5%乙酰胺（w/v）、10%丙二醇（w/v）和10%聚乙二醇（Mr 8000）而成。用2 mol/L NaOH调节pH至7.4，现配现用。

（2）冻存管：SILASTIC玻璃小管，内径3mm，外径4.5mm；

（3）设备：液氮储存罐；

（4）待冻存细胞：人类外周血单核细胞。

冻存过程

（1） 用常规方法分离全血中单核细胞；

（2） 在冰浴中预冷冷冻保护液；

（3） 将装有单核细胞的离心管放置入盛有冰水的烧杯内（冰浴）；

（4） 沿离心管壁缓慢滴加预冷的冷冻保护液。滴加过程为：前3min以0.3ml/min速度滴加，后5min以0.6ml/min速度滴加，余下的冻存液以0.75ml/min速度滴加。2×107个细胞要滴加15ml冻存液。滴加的时间在15min左右。最终细胞密度要在1×106～1.5×106个细胞/ml，边滴加边轻轻晃动离心管；

（5） 轻轻吹吸混匀细胞冷冻悬液；

（6） 将细胞冷冻悬液分装于冻存管中。12cm长的冻存管装0.8ml细胞冷冻悬液；

（7） 将冻存管两端以火焰封口；

（8） 最后将冻存管直接投入液氮中保存。降温速度约为6000C/min。

冻存结果

如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。

讨论

玻璃化冻存法对细胞活性的保存具有较好的效果，不需要复杂的仪器设备，具有液氮储存

设备即可使用。目前，该方法已在胚胎冷冻方面得到广泛应用，但很少应用于一般细胞的冻存。这可能与需要配制较复杂的冻存液以及冷冻前和复苏后较烦琐的操作有关。

因为玻璃化冷冻保护液中的冷冻保护剂的浓度较高，室温下对细胞具有毒性（但在40C时毒性大为减弱）。所以，冷冻保护液的滴加全过程必须在40C冰浴中进行。另外，滴加速度要缓慢，如果滴加速度过快，则在细胞外产生很高的渗透压，造成细胞膜的损伤，导致细胞死亡，故要缓慢滴加，让冷冻保护剂有足够的时间缓慢渗透到细胞内，达到细胞内外的平衡。

冻存细胞的复苏

非玻璃化冻存的复苏方法

主要材料

（1） 仪器设备：恒温水浴箱、高速离心机；

（2） 培养用液：完全培养液。

复苏过程

（1） 调配37℃～40℃的温水，或将恒温水浴箱的温度调节至37℃～40℃；

（2） 从液氮中取出冻存管，立即投入37℃～40℃ 温水中迅速晃动，直至冻存液完全溶解；

（3） 将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5ml培养液，轻轻吹打混匀；

（4） 将细胞悬液经800～1000r/min离心5min，弃上清夜；

（5） 向细胞沉淀内加入完全培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足培养液进行培养。

结果

复苏后的细胞应该保持其冻存时的活力，活细胞数达90%以上。

讨论

细胞冻存悬液一旦融解后，要尽快离心除去冷冻保护液，防止冷冻保护剂对细胞产生毒性。实验人员在复苏细胞过程中，同样应具有自我保护意识，避免被液氮冻伤。

玻璃化冻存的复苏方法

以下以人的单核细胞为例说明其过程（Takhashi et al. 1986）。

主要材料

（1）设备：高速离心机；

（2）培养用液：添加20%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液、培养液。

操作过程

(1) 将冻存管从液氮中取出，立即投入冰浴中5min。复温速率约5600C/min。一次可以进行多个冻存管的复苏；

(2) 将冻存管两端剪断，可以将5ml细胞冻存悬液转移到50ml离心管中；

(3) 沿离心管壁缓慢加入已在冰浴中预冷的含20%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液。前10min以0.2ml/min的速度加入，后10min以0.5ml/min的速度加入，接着的15min以0.75ml/min的速度加入，最后30min以1ml/min的速度加入。全过程约为65min，都在冰浴中进行；

(4) 将稀释后的细胞悬液以400r/min离心5min，去除上清。向细胞沉淀中加入培养液重

新悬浮细胞，用于培养。

结果

复苏后的细胞应该保存其冻存时的活力，活细胞数达90%以上。

讨论

复苏时，冷冻保护液的稀释及去除过程与冻存前冷冻保护液的滴加过程一样，不能在室温下而必须在40C冰浴中进行，避免在室温下冷冻保护剂对细胞产生毒性。稀释过程也要缓慢进行，保证有足够的时间让冷冻保护剂从细胞内渗出，以达到细胞内外的平衡，避免高渗透压的损伤。

关于\"细胞的冰冻和复苏\"

huyanhui 细胞的冻存和复苏

一、原理

在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。

细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。

目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。

二、操作步骤

（一）冻存

1、消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。

2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。

3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。

4、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。

5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。

6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。

7、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－30℃ 1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。

注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。

（二）复苏

1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯37℃的温水。

2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。

3、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。

4、1000rpm离心10分钟，弃去上清液。

5、沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。

6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生长情况。

三、试剂和器材

器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管、离心机等

试剂：0.25％胰酶、培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）

附：冻存液配制：

培养基加入甘油或DSMO，使其终浓度达5—20%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后4℃下保存。

kwzy １．冻存时，可以直接将装有细胞的冻存管放到液氮中．效果非常好．

２．复苏时可省略步骤５．将上清夜吸干净后，直接用适当的培养液将细胞转到培养瓶或培养板（细胞数量少的情况下）中。

gdognchun 我感觉只要DMSO的浓度保持在10％就可以了，血清的浓度影响不是很大的。我曾经用90％的血清＋10％的DMSO也用过50％DMEM+40%血清＋10％DMSO冻存细胞，复苏后细胞都能成活。并且我是在细胞离心后用冻存液悬浮后，分装到冻存管中-80度过夜，后直接存放于液氮中。

antitrust 细胞冻存时要计数，但发现实验室里很少有人做！请问大家计数有什么呀？

hz_kirk 不用液氮，在—110度的冰箱中行不行？

multibliss 血清

1. 血清必须贮存于-20℃～-70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。如果一次无法用完一

瓶，可将其40～45ml分装于无菌50ml离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10％，必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。

2. 一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。

3. 瓶装（500ml）血清解冻步骤 (逐步解冻法)：-20℃或-70℃® 4℃冰箱溶解一天®室温下全溶后再分装，一般以50ml无菌离心管可分装40～45ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀（小心勿造成气泡），使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由-20℃®37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。

4. heat-inactivation是指56℃, 30分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份（complement）去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之质量。补体参与之反应有：cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type。

5. 勿将血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之质量。

6. 血清之沈淀物

6.1. 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白（lipoprotein）变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白（fibrin）造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之质量。

若欲减少这些凝絮沈淀物，可用离心3000rpm, 5min去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。

6.2. 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沈淀物的形成会显著的增多。有些沈淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“，但在37℃环境下，又会使此沈淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响 细胞之生长，但若怀疑此血清之质量，应立即停用，更换另一批号的血清。

7. 血清之生长测试

7.1. 材料：

7.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34或CCRC 60004)

7.1.2. αMEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 )

7.1.3. 6-well TC plate (or 35mm TC dish)

7.1.4. methanol

7.1.5. glacial acetic acid

7.1.6. 10% Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013)

7.2. 步骤：

7.2.1. 以αMEM with 10%FBS（已测试过）培养MDCK细胞于T75 flask至80% confluency。

7 .2.2. 以trypsin-EDTA处理细胞，离心后，加入适量不加血清之αMEM制成细胞悬浮液，并测细胞浓度。以不加血清之αMEM稀释细胞浓度为1×102活细胞数 / ml。

7.2.3. 将1 ml细胞悬浮液接种入6-well plate中，并另加入1 ml含不同浓度的血清（20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %）之αMEM，使血清最终浓度为10 % , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已测试过之血清同时进行对照组试验。

7.2.4. 37℃，5 % CO2培养箱培养5-7天，期间不需更换培养基，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触即可。

7.2.5. 去除培养基，加入1 ml Carnoy’s固定液（甲醇：冰醋酸﹦3：1），室温下静置10 min。

7.2.6. 去除固定液，水洗二次。

7.2.7. 加入1 ml 10% Giemsa solution，，室温下静置染色2-3 min。

7.2.8. 去除染液，水洗二次。

7.2.9. 以肉眼计数群落数

7.2.10. 计算SPE ( Serum Plating Efficiency )：

SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100%

7.2.11. 计算RPE(Relative Plating Efficiency)：

SPE = [ total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) ] x 100%

7.3. 比较各浓度血清培养基之RPE，即可得知待测血清对细胞生长的影响。

7.4. 订购多量同一批号的优良血清，置于-70℃保存之。

multibliss 冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。

细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常﹙例如产生单株抗体或是其它蛋白质﹚。

材料

37°C 恒温水槽

新鲜培养基

无菌吸管 / 离心管 / 培养瓶

液氮或干冰容器

步骤：

操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。

自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。

将新鲜培养基置于 37°C 水槽中回温，回温后喷以 70% 酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。

取出冷冻管，立即放入 37°C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化，以 70% ethanol 擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。

取出 0.9ml 解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内 (稀释比例为 1:10～1:15)，混合均匀，放入 CO2 培养箱培养。另取 0.1ml 解冻细胞悬浮液作存活测试。

解冻后是否立即去除冷冻保护剂 (例如 DMSO 或 glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有 5-10ml 培养基之离心管内，离心 1,000 rpm, 5 分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入 CO2 培养箱培养。

若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。

soso_fan 一般冻存的密度是1－4*10的六次方。

还有我们用的是德国的无血清冻存液，上面推荐复苏是直接稀释培养就可以了，没有必要离心洗涤。

freechange: 细胞冷冻和复苏

基本原理：

在长期的细胞培养过程中可能会出现微生物污染或基因型改变等情况，会导致具有优良特性细胞系的丢失。为防止这些细胞的丢失，细胞可以经快速冷冻并几乎无限期保存在非常低的温度下，如液氮（-176℃）。

试剂和设备：

冷冻液: 90%灭活血清+10%DMSO（或甘油），用0.45μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存；

培养液；台盼蓝溶液（0.4%溶解于PBS）；

70%乙醇；组织培养瓶；15-50 ml 无菌圆锥底离心试管；离心机；血球计数板；超净工作台；光学显微镜；37℃水浴；冷冻管；-80℃冰箱；液氮和液氮容器。

操作步骤：

（一）冷冻细胞

1． 收集对数生长期细胞；

2． 以25μl台盼蓝溶液稀释25μl细胞悬液；用血球计数板计数并计算细胞存活率（至少应该在90%以上）；

3． 细胞悬液在4℃ 条件下200´g离心10分钟；

4． 将沉淀的细胞重新悬浮在冷冻液中（大约5´106细胞/0.5 ml 冷冻液）；

5． 将细胞悬液加入到冷冻管中，每管0.5 ml；

6． 将冷冻管置于-80℃冰箱中；

7． 24小时后，将冷冻管移入液氮罐中；

8． 在记录本或电脑中记录下每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。

（二）细胞复苏

1． 将冷冻管迅速由液氮转入到37℃水浴中，冷冻管的顶部保持在水面以上以避免任何污染，不定时搅拌加速解冻；

2． 当细胞完全解冻后，用含70%乙醇的纱布擦拭冷冻管消毒；

3． 将解冻后细胞转移到含4℃预平衡培养液的试管中；

4． 细胞悬液在4℃下200´g离心10分钟；

5． 弃上清，将细胞重新悬浮在新鲜培养液中；

6． 将细胞转移到细胞培养瓶，CO2孵箱中培养；

7． 是用倒置显微镜检查细胞存活率以及细胞密度，如果细胞密度过高，用培养液稀释至适宜浓度。

对照试验

在冷冻细胞被移入到液氮罐中一段时间后，取出一管细胞复苏并进行培养以检测存活率。

实验要点及说明：

1． 严格遵守液氮操作规则（即戴上合适的手套和护目镜），液态氮对眼睛极为有害；

2． 对一瓶细胞培养液要尽可能多分装几个冷冻管；

3． 延长暴露在DMSO中的时间对细胞有害，因此冷冻和解冻操作要尽可能快；

4． 细胞可以暂时稳定保存在-80 ℃达数月；

5． 每批次冷冻和复苏的细胞的存活率可能会不相同，为避免这个问题，每次细胞冻存最好分两批以上进行；

6． DMSO可以防止在细胞内部出现冰结晶，冻存过程需要逐步降低温度；

7． 如果复苏后细胞难以恢复到良好状态，可以使用含10%鼠胚胎成纤维母细胞培养上清的培养液以促进恢复；

8． 也可以用含20%热灭活胎牛血清和10%DMSO的培养液为冷冻液。

Jurkat 细胞复苏

zwangw ：Jurkat 细胞，体外培养及冻存前状态良好，冻存时细胞计数为活细胞数大于90%，细胞总数大于10E6个，冻存液为10%DMSO（Sigma）加90%胎牛血清（Hyclone），冻存体积为1ml/管（冻存管为NUNC产品，1.8ml）。冻存条件为4度适应数小时、20度冻数小时后置液氮口过夜，最后入液氮。同时冻存的其他细胞复苏后均挺好，可Jurkat细胞怎么也复苏不出，无论是复苏后直接将冻存液加入新鲜基中还是离心后加入新鲜培养基均无活细胞，复苏出来的细胞大多为细胞碎片，偶有活细胞也维持不了24小时，可能是冻存时的问题。请各位高手指点，问题到底出在哪里，是否Jurkat 细胞有特殊的冻存要求？谢谢！

jiangql：Jurkat 细胞是肿瘤细胞中比较难以冻存的一种，你的问题是冻存方法不对。各种细胞对DMSO的敏感度是不同的。

冻存保护剂DMSO的作用是避免冻存产生的冰晶对细胞的损伤，但本身对细胞有毒性，MTT法中就是用它来溶解细胞的，而你“4度适应数小时、20度冻数小时”，过渡的时间过长，所以你“复苏出来的细胞大多为细胞碎片”。

最好的冻存方法是用程序冷冻仪，一般实验不用这么复杂，简便的方法保持降温速度基本是-1℃/min，也就是说4度20～30min，20度冻0.5～1h，-80度过夜或数天，最后入液氮。

其它的因素也会影响结果，而你“其他细胞复苏后均挺好”，相信已经知道，就不多说了。供参考。

zwangw：谢谢，我也一直怀疑是DMSO的浓度过高引起的细胞死亡，没有想到细胞逐步冷冻时间也有讲究。上次复苏的细胞觉得没活，但我没有立即处理掉，放了一个星期后细胞竟奇迹般的长了起来，只是细胞碎片太多，较难与活细胞分离，离心也不行，只能在慢慢传代的过程中稀释了。

carlzeiss：Jurkat应该很好养，也很容易冻。DMSO的浓度的确是很重要，一般人上来就选10%，但其实ATCC有很多细胞建议5%。我个人喜欢8%。但这个细胞10%是没问题的。有人冻不好就用90%血清，其实这也是浪费。需要注意的是先用合成培养基配DMSO，细心的话会发现这时会产热。在冰浴中保持低温，然后再加血清，记住10%血清就足够了。最好别忘记过滤除菌，需要冻的细胞一般都是重要细胞，要是在这步污染就亏了。4度适应没什么坏处，但是—20℃就不对了，细胞最怕就是0 至—40℃的冰晶期，因此如没有程序降温仪，可将细胞直接放—80℃冰箱，过几天再移液氮。有一种简易的降温装置，是控制细胞在深低温冰箱中温度下降速度的，忘记是什么公司的，但一般的细胞是用不着的。

zengcao：赞同jiangql的方法，我也是那样做的。但4度1h30min，20度冻30min，-80度过夜，然后投入液氮。血清一般为20-30%

maodan：像U937、Jurkat这种悬浮细胞，养的时候都比较好养，但复苏时就相对比较困难。我做的经验是：离心去掉大部分冻存液上清加入新鲜10培养基，放置一段时间2-3天甚至再长一段时间，期间不用更换培养基但要每天观察，直到细胞状态好细胞数增多，如Jurkat细胞出现抱团现象，这时再按常规方法培养就行了。悬浮细胞刚复苏细胞碎片是比较多，但一旦细胞状态好生长速度也比较快，多传几次就好了。

caicaizi：我一般直接放入-80，过夜或放一段时间都没问题，但冻存管周围要保温良好，如泡沫盒或棉花。

细胞复苏后都死掉了？

雪景：细胞（小鼠的成纤维细胞）复苏后发现细胞逐渐死亡，现象是细胞膜的破裂，内容物溢出，不知道是什么原因？ps 复苏的方法应该没有问题，因为复苏别得细胞都没有问题

还有 我得细胞冻存之前使用DMEM培养 由于想换培养基冻存时就换了DMPI10 不知道这样影不影响复苏？

Brokenarrow：体外培养的成纤维细胞，其生命期限与物种等因素有关。

例如：人胚成纤维细胞约可培养50代；恒河猴皮肤成纤维细胞能传代超过40代；鸡胚成纤维细胞则只有少数能培养30代；而小鼠成纤维细胞多数只能生长8代左右。

dora_ding：可能与冻存液或冻存的过程有关。

hkqu：小鼠成纤维细胞复苏比较麻烦，很容易死亡。成活率主要还是看冻存时的操作和复苏时间长短，换培养基不应该有影响的。另外一点复苏洗涤时一定要把冻存液洗干净，DMSO对细胞毒性较大。

echo9450627：怀疑是冻存时出了问题。

雪景： 复苏后加了培养基 马上观察就已经发现半数的细胞没有细胞壁了 剩下的细胞内容物均质 大概三个小时后就都死得差不多了 难道真的是冻存出了问题 可惜不是我冻存的 或者

培养基的渗透压会不会有问题？另外 复苏溶解37度大概2min左右，1000rpm 2-3min

vanbastern：离心的转速多少？这个也要当心，太高的转速对想对孱弱的细胞不利

雪景： 修正一下 出现问题的细胞是小鼠的胚胎细胞Balb C3T3细胞株

怎样提高细胞复苏成活率

zzjm：求助：我的杂交瘤细胞复苏后第一天情况很好,但第二三天后就出现大量死亡甚至全军覆没,请问各位高手有何办法提高细胞复苏存活率.冻存液:10%的甘油,20%血清

qjm7717： 我冻细胞用的是8%DMSO加血清.虽然比较奢侈,但是复苏出来效果不错的.你可以试试.复苏时24小时内一定要换液.以免DMSO对细胞的毒性.

293细胞复苏，第二天培养液即变黄，细胞成团

putaoqiu：细胞数量没怎么增长，不贴壁，聚集成团，不知道什么原因。离心收集加入新的培养液重新培养。

Tonyzhang：Bacteria contamination!

bioflow：细胞数量可能太多，减少细胞量再试试。

zhaofei ：我们实验室的293细胞复苏时也存在同样的问题，复苏困难，死细胞

太多，但不要着急，等它慢慢地爬。同时，293细胞培养时经常会聚集成团，各位是否也存在相同的问题？

野原：（TO zhaofei） 293细胞的确存在复苏困难的问题，但是一定不要轻易放弃，让它慢慢复苏就是。以前我在复苏293时，到第三天时如果细胞还不理想就丢掉重新复苏。印象极深的是：有一次也是第3天细胞还是贴壁极少，郁闷之下忘记丢掉，结果到第5天上午，奇迹出现了：发现细胞贴壁达到90％，状态非常好，可谓长势喜人。所以在复苏293时，一定要有耐心。

另外，根据我自己养293的经验：293的特点是贴壁并不牢，但是细胞相互之间却聚集非常紧密。所以用消化时最好是含EDTA的胰酶，使细胞充分分离，有利于细胞的贴壁。

putaoqi： 今天再看昨天换了培养液的，好像有一个细胞贴壁了。希望明天会更好。

另外，我们实验室的老师说状态不好还有一个原因是拿出来换罐冻融了几次，导致其他冻存的细胞系复苏也困难。

leeqiu：吹打不足，细胞分布不均匀时细胞容易成团，特别是293，1、2代都是。

培养液变黄考虑细胞接种太多或有感染。

seagate： 因为把胶原酶错当胰酶使用,结果消化不完全,细胞成团,培养液发黄,1月22日传的代,1月24日19点仍然不见长,所以今天晚上我又加了胰酶消化重悬,希望能好起来.

Douding：不用灰心，293复苏一般都不容易，但是一旦坚持下去，长好后就很容易传代了。

细胞复苏注意的几点事项

Jimlulu：

1 为获得最高的存活率，收到细胞后最好尽快复苏，如要继续保存务必在 液 氮中保存。如在-70度下,细胞的存活率将大大降低，甚至死亡。

2 复苏时先准备好10倍体积的新鲜培养液(血清浓度可稍高于冻存前细胞培养液中血清浓度)，例如1ml的冻存液用10ml培养液稀释。

3 从液氮中取除冻存管，旋紧管盖，迅速置于37-39度的水域中不断摇晃，务必使冻存液在1分钟那融化。

4 将融化后的冻存液加入到10倍体积的新鲜培养液中，以稀释dmso的浓度，避免细胞中毒，24小时后更换培养液。（不推荐先离心去处冻存液，因为刚复苏的细胞应将伤害降低到最小）

有什么漏误之处请各位战友指正

lumangmang：楼主，这样的帖子我搜了一下，还不少，建议你看看，

http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=522229&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#522229

不过你的方法也可以，我也一直这样做，我觉得还是要看细胞，不同的细胞采用不同的复苏方法，有的细胞如肿瘤细胞就可以不离心，24小时后（不一定，只要细胞贴壁了）就可以换液，但对比较敏感的细胞，就得先离心去除冻存液对细胞的毒性。

dxb77：细胞复苏时，加10倍体积培养液，离心后，添加新鲜培养液，24小时后换液一次，如果是贴壁细胞，则在贴壁后就可换液。如果是悬浮细胞，则倍量加液即可。

westernblot：可以直接融化后直接离心,用5000,1min,去上清后加新鲜培养基,省你的培养基.复苏的效率还可以,对喜欢偷懒的有用.

curiouschild：主要看细胞种类的,像有的细胞皮实，不用离心，也不用10ml培养基，加4ml培养基，将冻存管里的1ml细胞加进去就可以了。老师说离心即麻烦，且细胞怕振的，可以一贴壁就换培养基就好了

小白菜：不离心直接培养应该会好些，这样使对细胞的损伤降到最小。

sp2/0细胞复苏后第二天，发现培养基没加青链霉素，有影响吗

angeltou：如题，今天看复苏的细胞，有一些已经委缩，还有一些透亮，比较大，但发现培养基没加青链霉素，不知有没有影响？还有我的细胞情况正常吗？一般sp2/0复苏几天能正常的培养？

请各位战友不吝赐教，我复苏这个细胞已经很多次了，情况不好，实验缓慢，心情郁闷。

笑佛：细胞复苏的状态和细胞、冻存的状态、冻存复苏技术都有关。

对于青链霉素，我已经有年头不用了，个人习惯，你可以问问园子里的其它同志，可能有一些人也这样。对细胞培养没有如何影像。唯一的影像是如果污染的话，你会更快的发现（玩笑）。其实没有用的，试试吧。

bbiron： 对细胞不会有影响，sp2/0细胞比较好养，如果你复苏后细胞状态不是很好，可能有一些细胞悬浮在培养液中，这个并不要紧，可能是你，冻存过程中冻存的方法有一些问题，也可能向上面的哥们说的，冻存的时候细胞状态就不好，这个狠重要，如果你的培养条件都比较好的（培养基，培养箱等都没问题），你就少量的换下液，或是在培养瓶中加一些饲养细胞，主要是为了取出。死的细胞，有一些大的sp2、0细胞这个没多大影响，如果你要是做细胞融合，你就把这些细胞重新克隆一下，取几个生长较快。的和一下状态较好的细胞，重新扩大培养，这样你的细胞生长就均一了。一个原则就是细胞不要经常的处理，能不动就不要动，传代，或是其他的处理都会影响细胞状态，一般复苏一个星期。细胞就会有一个好的状态，当然有的也会时间长一些，耐心些，一旦细胞状态好了，它的繁殖速度是十分的快的。我这有这个细胞培养的照片，你可以看看它的密度。祝你有好的运气

happyms： 楼上的，你的细胞多常时间传一次？我的密度比你的大多了，基本上24小时传一代，这个正常吗？至于抗生素，我没有加过。如果污染了就重养了。

请问楼上的：如果你要是做细胞融合，你就把这些细胞重新克隆一下，取几个生长较快。

的和一下状态较好的细胞，重新扩大培养，这样你的细胞生长就均一了。怎么重新克隆？是不是加8氮鸟嘌呤？

笑佛 ：（TO happyms）SP 2/0 生长很快，半悬浮生长，换液的时候，全部倒

掉的话（只留贴壁的），24小时换液也是正常的，如果你多留一些，24小时就必须换液了。

3楼的同志说的很对，细胞要少动，尤其是状态不好的时候，更不能洗涤去死细胞等等，那一定没戏了。sp 2/0容易养过，如果想减少换液次数，就要把贴壁的细胞吹起，少留。

至于重新克隆，没有必要吧，应该是8AG筛选了。

Angeltou：感谢各位全面详细的回答，我的细胞本来想换一次液的，看来还是少动为好了。

bbiron ：抱歉，我的照片引起大家的误会了，这个细胞数量很少，这样数量的细胞估计还可以长2天，在处理，我想是这样，大家的实验经费不是很多，可以少留些细胞在培养瓶里面，你就不用24小时就搞它了，天天搞十分的烦人。这样的数量可以保证你过一个快乐的周末。

我说的克隆，是不用8－AG的，如果细胞大小不是很均匀，有的细胞十分的大，你就把它克一下，当然长的快的，和慢的不差多少，sp2、0细胞不是每个都能进行融合。保留各种生长状态的细胞，对于融合有一定好处，当然这存在一个问题就是养时间长了。长的快的细胞，就对长的慢的构成生长优势了。这个问题是存在的。

关于用8－AG筛选的问题。一般半年多时间对sp2、0细胞筛选一次就行了，一般不会有

不敏感的问题。其实让这个东西还是比较好养的。

feal：我也在养sp2/o细胞，长的特别快，每天都要换液，在高倍镜下看，细胞也不是很规则，过两天就要做融和了，有点担心啊，还有，我的细胞似乎不大能够吹的起来，每次吹打会有很多泡沫，吹的时间也有点长的，这样是不是对细胞损伤特别大啊，那有什么解决的办法么

细胞复苏

恋恋真言 ： 曾在园中看到过：不能使用与冻存前培养条件不同之培养基。那么冻存前使用DMEM（含10％胎牛血清Gibco）复苏后使用DMEM(含10％胎牛血清Hyclon)是不是绝对不允许

echo9450627 ：没有那么可怕啦，尽管做，应该没问题，你可以先分装100ml试一试啊，不过一般是没问题的！

idan： 我以前就用过不同的培养基，不过也没事。

ws_wibp：没事的,那这夸张,反心做吧

请教细胞复苏的问题

eming43：最近复苏了一些细胞，结果第二天换液的时候，大量的细胞都没贴壁，死亡了。不知道是冻存的时候出了问题还是我复苏时没有注意哪个环节 ？

我的复苏是半分钟内解冻 ，然后8－10ml 培养基洗脱DMSO，血清加到了15%，怎么

还有问题呢 ？当时冻的时候DMSO也是进口的 ，不过细胞就放在－80冰箱里，才一个月而已。

lunayan ：冻存应该慢冻块溶，你的问题可能是，冻存的时候应该先放到－80缓慢冻最好放到一个塑料泡沫盒中，12个小时，然后应该放入液氮－196中冻存。

tyro123 ：其实复苏时候很多细胞死亡也不是什么怪事，我觉得很正常，关键有一部分可以贴壁存活就行了。细胞不宜长时间放－80度，但一个月嘛也还马马虎虎。

qjzhou2000：－80冰箱只能暂时储存，时间尽量不要超过1个月，最多2个月，复苏出的死亡细胞很多，如果你的细胞量多还可以，细胞量少那就在－80冰箱放一晚，第二天放到液氮里。另外，细胞冻存前一定要消化成单个细胞，否则复苏效果十分差，几乎不可用，我就吃过这样的亏。

另你的复苏过程没问题。

eming43 ：谢谢大家解答 。我的冻存过程也是很规范的 ，看来我得要慢慢摸索了 ，实验就是这样roger0704：有一个办法不妨试一下，我是在液氮口放1小时左右，然后直接放入液氮中，做了几次效果不错，有80-90%的细胞能贴壁生长，应该讲存活率还是蛮高的了，DMSO问题不大，只要10%左右，加入培养基中就可以了。复苏细胞大伙讲得很对，快溶，37度。希望能有所帮助。

eosts:我目前还没有解冻放在液氮里的细胞，只是将－80里的几株拿出来解冻，就一个月而已，今天看几乎全都死了 ，真不知道是为什么 ？在洗脱DMSO时 ，大家洗几次啊 ，我就洗了一次，不知是不是DMSO的毒性作用？

codegreen：我觉得不是DMSO的问题，我的细胞不洗DMSO一样活得好好的，为什么就没有人考虑细胞培养瓶的问题呢，用进口的一次性培养瓶试试吧。

老园丁：我们复苏时DMSO要洗两次的。或是洗一次，第二天换液。

请教关于细胞复苏的问题

chill ：

细胞冻存时间：7月份

细胞类型：PA317细胞

复苏过程：从液氮中取出，用冰盒转移到实验室（约10分钟）。放入37℃水浴，融化后取出，未离心，将液体转移至培养瓶中。按此过程复苏了两次，第一次下午3点复苏，第二天上午10点观察细胞已死，无贴壁，液体中有细胞碎片漂浮。第二次有个别细胞贴壁，两周后观察细胞不大长。现实验停滞，不胜烦恼。不知复苏过程有何问题？

天之饺子 ：

1、用冰盒转移到实验室（约10分钟）。

你应该在从液氮中取出细胞前就准备好37度的水浴，取出后马上放入。

2、融化后取出，未离心，将液体转移至培养瓶中。

这是非常严重的错误！冻存液对细胞有毒性，解冻后必须用Dhanks洗两遍才能移入培养瓶中培养。培养液中血清不能太少。

icesugar75：细胞复苏后的效果好坏也跟冻存过程及冻存前细胞的长势有关，也许不全是你操作的问题。我们从液氮拿出来，以最快速度丢入37度水浴，等细胞液刚刚化完取出，加培养液稀释。这样可以避免复苏过程中细胞液中有冰晶的出现，冰晶会破坏细胞膜及细胞内部结构的。还有，细胞若要长得好，还要维持一定的密度，再好的细胞如果复苏后选用的培养液体积太大，细胞密度太低，也长不好。

prophecy ： 还有一点要注意的是，冻存液转到离心管后加培养基最初的几滴要边加边摇以免渗透压改变太快使细胞破裂。我们用的冻存液是9份血清加一份DMSO混合成的。细胞冻存时冻存液中的细胞密度不能太低，因为复苏时细胞会死掉一部分。

yoyo781206 ： 细胞冻存与复苏的过程：有条件的话，最好用DMSO做保护剂，液氮保存，方法是：

1、将细胞悬液收集至离心管中。

2、1000转/分离心10分钟，弃上清。

3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5*10的六次方左右

4、悬液分至冻存管，每管1ml。

5、冻存管口封严。

6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外栓一金属重物和一细绳。

7、按下列顺序降温：室温到4度（20m），到冰箱冷冻室（30m），到低温冰箱（-30度，1h），到气态氮（30m），到液氮。

复苏：

1、在一1000ml的烧杯中，装2/3的37度的温水。

2、从液氮中取出冻存管，迅速置于温水中并不断搅拌，使冻存管的冻存物在一分钟内融化。

总之，有个原则：缓冻速融，细胞最易受损的温度在-5度到0度（复苏时要快速通过

dbfpp ：（2、融化后取出，未离心，将液体转移至培养瓶中。

这是非常严重的错误！冻存液对细胞有毒性，解冻后必须用Dhanks洗两遍才能移入培养瓶中培养。培养液中血清不能太少。）我觉得并不是这样，我们一般采用冰箱中取出后立即放入37度水浴，融化后立即加入培养液。培养4-5个小时后，换液，除去死细胞，继续培养。我对比过比反复离心洗细胞的成活率高得多。（冻存液是9份血清加一份DMSO）个人认为这样反复离心会使脆弱的细胞死亡率大大增加。但是必须当天换液否则会对细胞生长产生很大影响。

dengfugang ：

1.细胞冻存时的状态要好，冻存的速度要快，我每次在加好冻存液后，1分钟之内放入液

氮罐的气层，4小时后放入液氮。

2.复苏的速度也要快（装有10MlPBS的离心管，离心机设定，培养液都要事先准备好）。我每次将冻存管取出，立刻放入40度左右的水中，在超净台中用已准备好的PBS吹打使其快速融化，然后离心，一般也在1－2分钟内完成。第二天一定要换液，细胞贴壁后可以摇一摇，完全倒掉液体，还新的液体。如未贴壁可用400－800低速离心。这样作我每次的细胞复苏，4－5天状态都会很好

3.原因：冻存液对细胞有一定毒性，所以动作要快，要洗。

0－5度时细胞容易被破坏，所以一定要使其最快度过这一温度，但不能用超过45度的水，对细胞的损害也很大。

dbfpp ：我觉得冻存地时候应该缓慢一些，否则会形成冰晶，对细胞有很大伤害，有条件地话应该采用程序降温，每分钟1-2度，条件我们采用4度30分钟，-20度一个小时然后转入－70冰箱或者液氮。关于复苏的问题，我做过实验。同一批冻存的细胞，我开始采用复苏后离心去冻存液的方法，死伤无数，复苏没有成功！然后我采用直接培养，短时间内换液的方法，成活率非常高。不过我们的细胞是冻存在-70度冰箱里，液氮的没有试过。

qingshi ：（TO dengfugang）

（1.细胞冻存时的状态要好，冻存的速度要快，我每次在加好冻存液后，1分钟之内放入液氮罐的气层，4小时后放入液氮。）我不同意你地一点的看法，我认为应该是缓冻速溶，冻存的时候速度不要太快，因为太快可是董存液体组织在细胞膜外，达不到冻存效果。可先防盗-20一小时，在-80度一小时，在转到液氮中。另外第二点也不同一个地方是：第二天的液体不

必再换。因为剩下的dmso对于细胞来讲，完全不是毒性的水平，而是促细胞生长的水平。DMSO很低水平是粗细胞生长的。

另外，细胞刚副出来，还很脆弱，在离心可能会造成他们的损伤，以外刚建立的生长环境被破坏，比如一些细胞银子也被焕夜时除掉了。另外，副细胞时候，刚刚加入培养也时候，一定要慢慢加入，且贴管壁加入，这样可以最大限度的保护细胞。

ncmc1999 ：我同意取出后立即放入37℃和离心除去冻存液，我们以前也是这样做到，每次都能成功复苏。而且我们的细胞有些已经冻存了一年多了，照样能复苏的。再试试吧。

yuanlinbo_2003 ：

1.取出冷冻管应立即放入37℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,否则冰晶形成会破坏细胞膜和细胞内部结构,就有可能形成你所说的细胞碎片.

2.目前使用的冷冻保护剂一般有两种:一种是渗透性保护剂,如DMSO等可渗入细胞内使水分大量溢出细胞;一种是非渗透性试剂,如Dextran等,在细胞外形成高渗,使细胞脱水,从而保护细胞不受冰晶的损伤.

3.DMSO常温下对组织细胞有毒性,须尽可能减少其回输量,单用DMSO一方面对细胞有毒性,另方面需DMSO量大,成本较高,故考虑合用DMSO和非渗透性保护剂.

4.解冻后是否要立即去除冷冻保护剂,依细胞而异,你所养的是PA317,这种细胞不需要立即去除冷冻保护剂,在解冻数日后更换培养基就可以了.

yoyo781206 ： 冻存细胞时要缓慢冷冻，因为细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻

时，细胞内外的水分都会很快形成冰晶，冰晶的形成将引起一系列的不良反应。首先细胞脱水使局部电解质浓度增高，PH值改变，部分蛋白质由于上述因素而变性，引起细胞内部空间的结构紊乱，细胞内冰晶的形成和细胞膜系统上的蛋白质、酶的变性，引起溶酶体膜的损伤使溶解酶释放造成细胞内结构成分的破坏，线粒体肿胀、功能丧失并造成细胞能量代谢的障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏引起胞膜通透性的改变、使细胞内容物丧失。细胞核内DNA也是冷冻时细胞易受损伤的部分，如细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成DNA的空间构型发生不可逆的损伤性变化，而引起细胞的死亡。故在细胞冻存时尽可能的均匀减少细胞内水分、减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤的关键。

而细胞复苏与冻存的要求相反，应采用快速融化的手段。这样可以保证细胞外结晶在很短时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成细胞内再结晶对细胞造成伤害。

请教细胞复苏的问题

xinghui ： 我冻存的大鼠血管内皮细胞和平滑肌细胞于-80摄式度中保存一个月后，复苏培养的几天， 有的只有一天便泥沙样物质在培养皿中，起初虽然像雾一样模糊，但是还可以看见细胞，细胞仍然贴壁，但过了两三天之后，细胞便不见，只见泥沙样物质；还有的情况是初次传代的细胞尚好，但是传到下一代便又出现泥沙样物质，细胞也不能生长。我最初以为是培养液，血清以及消化液污染了，但是当以上培养物重新配制后，仍然会出现这种情况，而冻存液是由培养液、DMSO、血清配制而成，而且经过过滤过的，我想不会污染，但这种情况的出现，不知道各位在细胞冻存和复苏的时候有没有遇到这种情况，究竟是什么原因呢？

icepiao ：很可能在冻存的时候带进去的,培养液混浊么？看样子好像是黑胶虫，有照片就好了

xinghui ： 细胞冻存前细胞生长情况非常好。复苏后有的前几天生长也很好，细胞液是清澈的，可是过了几天就不行了，开始是少量泥沙样混浊物，后来整个培养瓶都长的是，开始细胞还能看见， 后来细胞就看不见，怕都死了。不知道为什么？！

如果是黑胶虫的话，会出现什么情况呢？

细胞复苏后死亡怎么办？

jasmine79 ： 我养的乳腺癌细胞ZR-75-30最近从－70度冻存的条件复苏，第一天贴壁很好，可奇怪的是它连续不断的死亡。我开始怀疑是培基污染，于是重新换培基，并复苏液氮冻存的细胞，生长良好。但这一批细胞我冻存到－70度后一个月内再次复苏又出现了陆续死亡的现象。已经重复两次都是这样，刚买来时从未出现这种情况过啊！

风轻云淡 ：－70度冻存不宜长期保存细胞，细胞活力等都会受影响。若有－70度冻存的条件复苏细胞长不好的话可2天左右换液一次，把死亡细胞换掉。继续培养，到传代后细胞状态会有所好转。（适者生存，活力好的细胞增殖）

gene_ws ： 一般刚复苏的细胞换液和传代所用培养基都必须经过37度预热，因为刚复苏的细胞对温度很敏感。还有，考虑一下冻存时候细胞的状态是否很好。如果冻存时细胞的状态不好也会影响到复苏后细胞的状态。

细胞复苏后没见细胞

dingding2004 ：各位高手，我冻存细胞时没加封口胶，其他的都按照书上的来操作的，怎么不见细胞贴壁呢（极少的），好多细胞都漂在上面，请多多帮忙。

qyt：我觉得那可能是因为你冻存效率的问题，不知道你是按照什么程序冻存的，能否说出来一起探讨一下。

victoh 还有就是复苏操作情况和冻存时细胞状态。

dingding2004：

1 细胞融合后常规消化离心（细胞状态应该还可以），用10％DMSO＋40％FBS+50%培养液，制备1ML的细胞悬液，再转移到冻存管。

2 用棉花包住冻存管放置－20度冰箱，1－2小时，再放置－70度冰箱过夜。

3 第二天放到液氮中。

复苏时

1 用37度温水快速解冻在，1－2分钟之间完全融化，加至5ML培养液转移到离心管离心1000转/每分，5分钟。弃上清液，再加培养液吹打成细胞悬液接种到培养瓶放置培养箱培养，第二天发现许多细胞飘浮在培养液上面，只有几个细胞贴壁，请多多指教。谢谢！

难道非要细胞达到80％融合才是最佳的冻存时机？我养的是成纤维细胞，是疯长的，呵呵。

beyond2008 ：

我们用的是进口的冻存管，需要封口胶吗？我觉得不需要吧。

1.我们血清只需要20%就足够了，不过看别人经验甚至不需要加培养液，全加血清和DMSO。最近我冻存细胞也加大了血清量。不过这点应该看个人细胞的不同、冻存时间的长短以及个人习惯的不同吧。

2.有-70度冰箱啊，不错啊。不过是否可以在转至-20前先在4度做个缓冲，我觉得，半小时吧。

3.放液氮前可先在上方停留个几分钟，不过这点无所谓的。

复苏时，

尽量在1分钟内溶掉。水温不用非要37度，我每次在40度左右吧。至于离心，我觉得真的没什么必要，因为我老感觉这样对细胞损伤较大。细胞本就不多，离完心又要损失不少。

按您所说，死细胞不少，是不是可以考虑先不离心，然后第二天换液来去除DMSO。建议。

按理论是应该这样，不过我们冻细胞都是自己感觉状态最好时冻存，当然要在指数增长期了。

这样冻存+复苏，每次都没问题。不知道是不是我运气好一些。

仅供参考。

dingding2004 ：不离心？常温下DMSO不是对细胞有不好的影响吗！

293细胞复苏应注意事项

zhwdong9：复苏了几次293细胞都没有成功，郁闷，求助复苏293细胞的具体注意事项

丁香海豚：和其他的细胞复苏一样，关键是一个快字

wxling2205：293细胞对DMSO比较敏感，建议你融化后移入加有完全培养基(10ml)的离心管中，轻轻吹匀后，500-800rpm离心3-5分钟，轻轻去掉上清，再以完全培养基悬浮细胞，移入培养瓶培养。如果离心后沉淀太少(即冻存时细胞浓度偏低或冻存后细胞损失过多)，可以一次复苏两管，在同一离心管内离心，并在同一培养瓶内培养，以增加活细胞数量。293细胞密度高时，也容易复苏成功

rainingatnight： 293贴壁不是很牢固，我曾经试过在复苏时用明胶包被培养瓶，效果不错。

sp2/0细胞复苏培养

Jimlulu ： 复苏了两次，每次都是将冻存管在38-39水杯中摇晃2分钟左右溶解，并直接加到10ml的10%10培养液中培养，次日离心换液，除去dmso。不知为什么细胞存活率都不高，不到2天就都死了，细胞内含物都出来了，哪位大侠帮我指正实验中不当的地方，培养液的ph在7.3左右，用的是四季青的胎牛血清。

hujianjun021 ：复苏时，等溶解后，将其转移到有适量无血清的10中，混匀后离心，去除DMSO，然后加20%小牛血清的10培养即可

Jimlulu ：要用20％那么多 啊？是先离心再用10洗一次还是直接用10稀释后离

心呢？？不过看atcc上说直接培养次日后离心也可的那。真不知道什么问题

viruslt： 复苏后用40度水浴尽快溶解，连同冻存管离心，之后换新鲜含20%CS的10。次日换液。

hzhqquan ：复苏后用40度水浴在一分钟内快速溶解，直接用10稀释后离心（1-2次）。换新鲜含8-10%FCS的10培养就可。

monica1232：我们是用10%FCS+90%DMEM+1%L_g培养液。复苏时尽量在1分钟内静止融解,这点很重要.

soso_fan ：一般国内常用的方法是复苏过后离心然后培养，但是我们实验室用了一个德国的冻存KIt，说明书上还是推荐复苏后直接用带有血清的培养液稀释即可，上面认为离心不但损伤细胞，而且会导致细胞的损失。我们实验室经过试验和经验觉得两者复苏的效率是差不多的。

还有一条很重要复苏时不要等全部融解后在处理，大概到90％时然后摇动即可，因为DMSO在常温下对细胞的损伤是非常大的，更不要说37度了，要注意一点。

midas ：总之记住两点：

1、应该在尽可能短的时间内使冻存细胞融解 （as soon as possible）。

2、应该尽可能早地去除培养液中的DMSO。

happyms：静止融解是什么意思啊？不是需要搅动吗？直接放到37度水中就可以了？还

有一条很重要复苏时不要等全部融解后在处理，大概到90％时然后摇动即可，因为DMSO在常温下对细胞的损伤是非常大的，更不要说37度了，要注意一点。 大概到90％时然后摇动即可？？什么意思？等到融了90%才开始摇动？

danson ：我的意见与soso-fan 的一致，不能完全的溶解，要依靠余热。

细胞冻存

dwp123： 细胞冻存和细胞复苏，是否要求所使用的培养液是同一此配制的（相同的），不同对于细胞复苏后有没有影响

lyy0596：个人觉得影响不大，所使用的培养液是同一次配制的，当然最为保险了。倒是细胞冻存和细胞复苏需要注意以下的问题：

在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。

目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。

loyal1006 ：细胞冻存和复苏所用的培养液不需要同一次配制的，冻存和复苏的效果主要还是在于其过程，另外，各种细胞冻存的条件不完全一样，要注意查找资料，必要时自己摸索

条件。

冻存后最好近期内试行复苏一管，以确保冻存成功。

ypoplar： 能介绍一下冻存液中血清和培养基的作用么？用国产血清冻存细胞怎么样，安装7：2：1的比例来配冻存液的

hypesnow： 我们实验室冻存液是按照 培液：血清：DMSO＝7：2：1配成的，一般细胞冻存的时候要慢，就是先放在零下20度的冰箱中，一般过夜后转入液氮罐中，一般细胞在复苏的时候解冻的速度要快，然后最好先离心，除去DMSO,因为DMSO对细胞有毒害作用的，再换新的培液，一般细胞的存活数量都很多的。

[原创] 细胞冻存与复苏

sunjim： 细胞的冻存是保持细胞系的重要途径，因此掌握细胞冻存技术对实验研究者来说是不可缺少的，现介绍自己成功冻存的经验，与大家共享

1 冻存细胞健康程度 一般要求活细胞在95%以上，细胞活力差的在冻存后的成活机率很小，因此，一定要在细胞旺盛时期冻存

2 冻存细胞量要多，一般10*6-7/ml，冻存液比例培养基7：血清2：DMSO1，也有将血清比例加大的做法，有的甚至将血清提高到90%，具体浓度视经验而定

3 混合DMSO要快，因为DMSO对细胞有毒性，混合之后应尽快冻存

4 冻存 遵循缓冻速融原则，冻存步骤为-4度30分钟—— -20度1-2小时—— -80度

过夜——沉入液氮。也可以用棉花或泡沫塑料封好后直接-80过夜，然后沉入液氮

5 复苏 将冻存细胞取出，快速放入37度水浴中待细胞融化后立即取出，超净台上转至细胞瓶中，然后缓慢加入培养基，边加边摇动细胞瓶，最后加20%血清

6 后处理 复苏后1-2小时，待细胞贴壁后，缓慢将培养液倒出，加入新鲜培养基，血清（15%），培养3天观察

happyf：补充：悬浮细胞冻存时，DMSO的浓度为5％。血清浓度为10％

bengbu_bli ：能不能说明一下什么理由悬浮细胞就可以用5%的DMSO冻存，因为根据个人有限的资料好像还没有看到哪一本书或教材里提到可以用5%DMSO冻存悬浮细胞。

希望这个5%DMSO的细胞冻存液不会对新手起误导作用， 所以必须讲清楚原理。

lumangmang：现在我们这里许多人先直接－20度2小时，然后－70度，复苏后细胞也还可以，不过没有放在液氮里边好，供参考，各位认为有何不妥

山东小汉： 细胞冻存还是缓慢冻存好一些，-4度1小时， -20度4小时 ，-80度过夜，次日放入液氮中。一些简化的步骤有时也是可行的，但我感觉还是循规蹈矩点好，特别是有一些细胞比较娇气，经简化步骤冻存的细胞复苏后活性差的很！

yali ：我想请问一下，前日由于我的粗心，冻存的细胞放在4度十多个小时才记起,再放如-20和-70.不知这样的细胞,复苏好吗

topgun：冻存的技巧在于细胞的生长状态和冻存液的配制，DMSO的主要作用是防止冰

晶的形成，因此如果在4度放置过久，冻存的效果不会好！提醒各位注意的是加入冻存液后一定要混匀，防止DMSO沉淀。

山东小汉： （TO yali ）细胞在4度存放的时间过长，细胞的活性将受到很大的影响，复苏后死细胞特别多，即使有活细胞其活性也很差。你的细胞在4度已放了十多个小时了，建议废弃，以后注意就行了。

hue ：我冻存细胞时为保持细胞均一性，想一次多冻些细胞，请问用谁用过nunclon 的Triple flask，消化吹打是否容易控制，会不会消化过。谁还有别的方法能一次多冻些细胞？谢谢！

roger： 消化后直接用10%DMSO+90%血清冻存即可.....

helimei ：请教：本实验室没有液氮，担有-70度的冰箱，请问冻存步骤一样吗？

llqq：是呀，不明白为什么悬浮细胞冻存时，DMSO的浓度为5％。能解释一下吗？

hippoleo ：请教一个问题：我的悬浮细胞复苏后加入培养基后非常浑浊,并有云絮状悬浮物。请问这是正常现象吗？我当初冻存时没有注意调整细胞浓度，反正好多细胞都冻到一个管里了。

jzyxynwm ：虽然原则是慢冻快融,但冻存不能太慢,4℃一个小时足够,－20℃最好不要超过4个小时,细胞在－20℃到－30℃是个危险区域,容易死亡。有人喜欢复苏后离心去除DMSO，我觉得不好，刚复苏是细胞脆性大，很容易离碎细胞，等贴壁后在去最好。

way9815： 楼上的，我曾经试过，同一管细胞，同时用离心去冻存液和直接保留冻存液

培养，发现有冻存液的状态很不好！

风轻云淡 ：（TO jzyxynwm） DMSO4度以下对细胞毒性小，但4度以上对细胞毒性则显著增强，所以还是建议复苏后离心袪除冻存液，离心转速可以控制1000左右。复苏在于快，我一般是将其放入50度左右水浴中（37度水浴中冻存管内肯定不到37度），摇动不到1分钟，一成液状时就拿出水浴，（此时冻存管内温度还较低，避免DMSO对细胞毒性），这样复苏细胞活力与冻存前近似。

何时冻存较好

yuanstar ：刚刚买的已复苏的细胞株培养什么时候冻存最好？是不是以后传代长得较好时都可以冻一批啊？如果传久了冻的细胞复苏后好长吗？有别的影响吗？

blueflute： 在对数生长期冻存 最好！

qs ： 我的习惯是对珍贵或是刚买到的细胞：复苏后长满原瓶就冻存一半以防万一，另一半继续传代培养，至对数生长期可冻存一批，以后随着实验可选择状态好的进行冻存，最好作时间标记，自己可以把握传代的次数与复苏后细胞的状态之间的关系。传代多后冻的细胞再复苏状态有一定影响，象Bel-7402、MCF-7、K562都会出现胞浆颗粒增多、肿胀的现象。

细胞冻存

hujianjun021 ：我在做细胞冻存时，由于细胞培养不同步，分两批冻存了5株，第一批三株，做法如下：-4℃放1小时，-20℃过夜，再转入-80℃冰箱放了4天；第二批是直接放入-80℃冰箱过夜，第二天一起一早，我用冰埋好，放入保温瓶中，送到细胞所冻存，路上有将

近二个小时，到那时，我发现冻好的细胞已经融解，并直接放入了液氮罐，不知道这样的细胞冻存还有没有戏，我都急死了。

大灵通 ：路上溶解的细胞估计已不可用，细胞最怕的就是缓慢复温，因为在冰点左右的温度细胞内的冰晶会损伤细胞，所以复苏细胞都是要求细胞从液氮中取出后1分钟左右即复温到37度，就是减少在冰点附近时对细胞的伤害，你送细胞的时间近2个小时，这是相当于缓慢复苏，细胞很可能已死亡。

第二批细胞冻存方法不太合适，一般不会直接放入-80℃，要有温度的缓慢下降。

我不太清楚其他方法可以不可以，我是这样冻存的，效果很好。

冻存管最好用棉花包上，减慢降温速度。以1-2℃/min的速度降温。既4℃放10分钟，-20℃1小时，再转入-70 0℃冰箱放过夜，去除棉花后放入液氮保存。

你离细胞库有2小时路程，可在“-20℃1小时”时间段送细胞，2小时也不算长。到细胞库后直接放入-70 0℃冰箱放过夜，然后就放入液氮。应该没问题。你如果要求冻存的细胞将来必须成活，那我建议你放弃这批细胞，从来吧。

babyblue318 ：慢冻速融!!

细胞冻存

engla0931 ：90%全小牛血清制成的细胞悬液，加10%DMSO，先置之-20度冰箱2 小时 后放入-70度冰箱或液氮中保存，细胞悬液也可以用全培基制备，但我觉得不及全血清好。

风飞叶： 细胞的冻存

培养细胞维持传代以供实验用常遇到某些困难。首先，细胞株在传代中性质易发生改变；其次，在传代中有支原体污染的危险；第三，对有限增值细胞株，传代应维持在有限内期间传代，解决这些困难的办法就是将细胞冻存。细胞冻存在液氮中，储存时间几乎是无限的。

细胞冻存的原理与要求

1. 原理：在不加保护条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水会形成冰晶，能导致细胞内发生一系列的变化，如机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH值改变、蛋白质变性等，能引起细胞死亡。但如向培养基中加入保护剂（甘油或DMSO）,可使冰点降低，在缓慢的冻存条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外。储存在－130度以下低温中能加水冰晶的形成。溶解细胞时，速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0度后，细胞仍能生长，活力不受任何损害。当前使用的保护剂为DMSO和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，使用浓度范围在5～10％之间，常用10％。

2. 要求：为保护细胞最大存活率，一般采用慢冻快溶的方法。标准的冻存速度为－1～－2度/分钟，当温度达－25度时，下降率刻增至－5～－10度/分钟到－100度时则可迅速浸入液氮中。要适当掌握下降速度，过快能影响到细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成。但各种细胞对冻存速度要求不一样，上皮细胞和成纤维细胞的耐受性大些，骨髓干细胞－1～－3度/分钟较合适，胚胎细胞耐受性较小，总之，在一开始时下降速度不能超过－10度/分钟。另外，用什么保护剂合适和用量多大，要依细胞而定，初代培养用DMSO较好，一般细胞可用甘油。用量以较小为好，有人认为人皮肤上皮细胞储存在20~30%甘油中很好。原则上细胞在液氮中可储存多年，但为妥善起见，冻存一年后 ，应再复苏培养一次，然后再继续冻存。

冻存细胞的方法

1. 选用对数生长期细胞，在收集细胞24小时前换液一次。

2. 用常规方法将细胞消化下来，按（1～5）×106/ml浓度、悬浮于含有10％ DMSO的小牛血清或生长液中。冻存的细胞数量要充分，因复苏时接种的细胞数量应比平常多一些。

3. 用吸管吸取细胞悬液，分装于无菌安培管中(没管1ml)，严密封口，放入三层纱布小袋（内放铅块以防止漂浮）中，并系以线绳，末端扎有小牌，注明细胞名称和冻存时间，便于以后查找。

4. 冻存 当前已有专用细胞冻存器，能精确地控制冻存温度。在无冻存器的情况下，可用手工方法。从把安培悬液在液氮容器口开始，在30～40min内，下降到液氮表面，在停30min后，直接投入液氮中。或先将安培移入液氮罐口颈部气相中过夜，次日将纱布袋缓慢下降至液氮中，历时3分钟。在液氮中可长期保存。

qlevi：不想用对数期细胞，将想用的细胞即时冻存可以么？

engla0931： of course

复苏的细胞为什么死亡

knightzhao： 我进行鼠种WALKER256细胞的复苏。可是在细胞复苏后2-3天内细胞就会出现逐批死亡的现象。请教各位仁兄，这到底是什么原因??是不是冻存时的问题？为什么会出现分批死亡的现象？而不是一次性全部死亡？

就是那一只蟋蟀 ： 有可能是冻存的问题（DMSO的浓度还有你复苏时的操作)，还有就是你的培养液有没有什么问题，是不是ATCC上推荐的标准方法。

olivezrp ：细胞培养中的许多问题需要仔细的摸索，我的看法大致为

1）细胞冻存的问题

a冻存时一定注意细胞的数量，数量少时，复苏后会慢慢死亡。

b冻存液中DMSO的浓度一般为10％，不知你用的浓度是多少，而且这瓶D MSO必须是单独细胞冻存用的，不能与配药的混用。÷

2）培养液的问题

培养液是否受到了污染，是最常出现的问题。

3）复苏时离心了没有，如果没离心，要在细胞贴壁后尽快换第一次液，约为2小时；离心后一般24小时换液就可，一般离心一次，约5分钟，1200-1800转/分。

复苏细胞加入培养基后变浑浊,是污染吗

hippoleo ：我的细胞复苏以后加入培养基,结果看到细胞悬液浑浊，不知是什么原因。

我养的是悬浮细胞。镜下看到细胞背景有点乱，能看到有一些象头发似的东西，比细胞大，以前培养时也见到过，但似乎没有影响细胞的生长。有谁见过这种情况，是污染吗？

linxiaoyanyan： 要在观察一段时间，悬浮细胞如果细胞密度大，也可看到液体微微浑浊，不一定是污染，可能是细胞冻存时的状态或冻存过程操作不当引起的细胞损伤，细胞的破裂碎片。我得意见是在观察，如果细胞生长缓慢，液体浑浊加重，再丢弃不迟。

hippoleo：发现浑浊后我就以为是污染，所以扔掉了。重新复苏一管加入培养基后还是有浑浊。我的培养基瓶底看到一些细小的白色沉淀，但培养基仍然是澄清的。我再观察几天看看。

不过那几根黑色象头发似的东西是什么？我有点担心。现在拍不了相片，郁闷！

楚风 ：悬浮细胞如果生长较快，培养基可以表现为云絮状，但不是明显的浑浊。并且不会很快变黄（24H内）。至于头发状的东西，我认为是滴管内的棉絮丝。可以发几个高倍镜照片供大家参考。

olddream520 ：对于丝状物质不要掉以轻心，很可能是污染了，刚开始不会影响细胞的生长 ，但过几天就会长很多，细胞只有死路一条了！

MDCK复苏后出现很多碎片和贴壁的点状物

antitrust： 我做MDCK细胞复苏后,发现有很多碎片和贴壁的点状物,而且细胞的形态也不是很典型,生长也较慢.换液后,贴壁的物质,看起来象小泡,也不能洗掉。急问是怎么样回事.另外细胞的代数并不是太高.试剂方面和平时做细胞时所用的相同.

albertzlh：复苏细胞本来就生长缓慢,可以比平常晚一两天换液,传一两次代后状态就会好起来.如果换液过早,可能有的还没来得及贴壁,而且如果细胞密度低的话,换液早将生长的细胞释放的因子换掉后,不利于细胞生长.你只能看到象小泡的东西吗?具体什么状态,为何说象小泡,大

小与正常细胞相比是什么关系?那些比细胞小很多的圆球状物质应该是细胞破裂后释放的内容物.在复苏过程中一定要动作轻柔,新手更是如此.另外,也有可能复苏前细胞状态就不好,建议重新复苏,并且做细胞计数,看看是否有很多死细胞.新手一般要复苏几次后才容易成功.别着急,耐心些,并不难.

antitrust ：我所说的小泡分布很多,而且,换液后又发现有大的碎片把正常形态的细胞覆盖了。我觉得你说细胞破裂后释放的内容物有道理。另外，你能不能指点一下“在复苏过程中一定要动作轻柔”，具体操作上有什么要点。我以前只是注意冻存的状态，对在复苏过程的操作没有注意。

albertzlh：不知道你是怎样复苏的，做的次数多了就好些。可能你也知道，原则是慢冻速融，整个过程中都要轻柔细心些。复苏时先把超净台内准备好，快速从液氮中取出冻存管，放入37度水浴，不断摇动至融化，一分钟左右吧。然后用酒精擦后进台，移入离心管，加入培养液，建议滴加，在鄂征的组织培养书中是这样写的，这样可以让细胞逐渐适应，加完后，可以用吸管轻轻吹几次，离心的主要目的是清洗细胞，排除DMSO，轻吹有利于DMSO从细胞里出来。这里要注意，你所用的培养液最好与冻存用的血清浓度相近，这样更有利于细胞恢复。离心后最好用台盼蓝染色计数，一方面看细胞存活率，另一方面看细胞数量，接种过密也不利于贴壁。如果死细胞很多，可能你换也后还可以看见碎片。如果接种过密，细胞贴壁不牢，换液后可以漂起来。复苏细胞状态与冻存前状态关系密切。冻存时细胞最好处于对数生长期，冻存前24小时换液一次，长得过满容易老化，因此在细胞长到70%汇合时就换液，第二天冻存，细胞正好快长满（指3天传一次代的细胞，其他类推）。消化细胞时也要注意，胰酶尽量少加，可以先用D-HANK'S洗一次，这样可以减少胰腺酶用量，放温箱保温，30秒观察一次，及时终止，消化过度细胞状态就会差，平时传代可能没大碍，冻存就会有问题。再吹打细胞时要尽量轻柔些，离心后可以先计数，再离心后加冻存液，或者直接加并计数（DMSO应该不影响计数，这个问题没探讨过，这样可以少离心一次减少对细胞的损害），加的时候也最好滴加，让细

胞逐渐适应。冻存过程逐渐降温，这个你应该清楚。以上是我的心得，若有不妥之处请指出。

qllg ： 我做的细胞现在也出现类似的问题，更为不解的是，几乎所有的细胞，（不只是复苏之后的）都出现一些小黑渣渣样的东西，好像细胞上面也有；不知道，antitrust的问题解决了没有？

关于细胞解冻和复苏的问题

泉水鱼： 我马上要做细胞培养，但先要把细胞解冻，我以前没做过这种工作，怕出错，想请问各位前辈标准的操作是怎样的？操作中有什么要注意的吗？如何才能保持细胞的活性？

风尚的水瓶： 细胞冻存与复苏最重要得一点是慢冻快融，这样才不会因为小冰晶导致细胞破裂。具体方法有很多，许多资料和书上详记了许多经典得方法，你可以根据自己的条件选择。

毛猫 ： 提醒你注意一下，细胞复苏是速度一定要快，尤其是在-5℃～０℃这阶段，因为在这个温度阶段细胞最容易受损，如果复苏的步骤正确，细胞仍然仍然可以生长，细胞活性损失也不是太大。

细胞复苏的步骤是：一、准备一个1,000ml的烧杯,放入大概三分之二的37℃的温水。

二、从液氮中取出冻存管，迅速放入温水中震荡，尽可能在短时间内使其中的物质融化。

三、将冻存管中的细胞悬液转移到离心管中，然后在1,000转/分钟离心10分钟，弃去上清液。

四、在细胞培养瓶中加入培养液，然后把细胞放入培养瓶中，放入37℃温箱中培养。经过以上步骤,如果没有什么特殊情况细胞是可以生长的。

chenyizhi007 ：可以参考有关细胞培养技术方面的书籍，里面有很多的经典方法．我个人的经验是冻存时细胞密度大概要求５x１０６／ml以上,如果细胞冻存时间只要求半年到一年而已，我建议你用-８０度的冰箱即可，以免时不时需补充氮气．另细胞复苏时一般书籍推荐用37℃的水浴箱，我用的大概是４０℃，因为打开盖子时温度即降，此时能使冻存细胞更好的在半分钟至一分中内解冻。将含冻存液的细胞移至离心管，加入４倍的培养基，５００转/分钟离心10分钟，弃上清。用培养基调细胞密度，接种至培养瓶或所需的培养板中培养．

chenzi： 关于冻存

(1)最好选择对数生长期的细胞用于冻存,在冻存前一天换一次培养液.

(2)用胰蛋白酶消化贴壁生长的细胞,离心并计数,去除胰蛋白酶及培养液,加入配制好的冻存液(10%DMSO或甘油),冻存液中细胞的终密度为5x106／ml-5x107／ml,封好冻存管.

(3)标准的冻存程序是降温速率-1__-2℃/分钟;当温度降到-25℃以下时,可增至-5__-10℃/分钟;到-100℃时,可迅速浸入液氮中.要适当掌握降温的速度,总之,在开始降温时速度应小于-10℃/分钟.

细胞在液氮中储存时间理论上是无限的,,但很多未被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏一次,观察细胞堆冻存的适应性.

maokai123：你可以提高复苏细胞培养基得血清浓度，或者用高等级的血清来提高复苏效

率

zhizuchangl： 细胞复苏后不用急着去除DMSO，解冻后直接加到培养瓶中，多加点培养基稀释，到第二天再换液即可，因为复苏后接着离心，对细胞造成的机械损伤较大，若是贴壁细胞可能会影响细胞贴壁。

tonnyue： 请问细胞复苏后的存活率能达多少,我师兄们说很低,多半的死细胞.可书中又说能达百分之九十几.我现在都不敢直接冻存细胞了.

tonnyue ：另外,细胞冻存后对细胞mRNA有多大影响.

zhizuchangle ：复苏后存活率一般能达到百分之九十几，大胆的去复苏吧，不动手做做，怎么知道行不行呢，难道你就只有一管细胞吗？不行就再复苏一管嘛！

mylalexis： 我们实验室条件 所以我复苏细胞没有很严格的条件 只是做到尽量快 细胞状态也挺好的 我没用的冻存液是进口的一种 对细胞损伤小

easywood1980： 冻存细胞解冻后转移到离心管中，在加入5到10ml培养基时，还应注意滴加的速度要慢，以避免渗透压的变化过快导致细胞损伤，因此最好在1到2分钟内加入。另外，如果要省去离心的步骤，可以直接缓慢加入培养基，置于培养皿中培养，24小时后换液。当然，还要根据自己培养细胞的具体情况加以摸索，找到最好的办法。

小鸭： 这是我的复苏和冻存方法，效果不错，试一试吧。

一、复苏

1、从-196℃液氮罐中取出冻存管；

2、置37℃水浴快速复温，复温过程中轻轻摇动冻存管；

3、将细胞悬液分别移至两个10ml离心管中，添加培养基（含血清），至总体积10ml；

4、800转/min，离心10min，弃上清；

5、每管加入培养液5ml，用吸管吹打均匀，分装至4个25ml培养瓶中，37℃5%CO2条件下培养。

二、冻存

1、冷冻前一日前更换半量培养基，观察细胞生长情形。

2、配制冷冻保存溶液：将甘油加入新鲜培养基中，最后浓度为10％，混合均匀，置于室温下待用。

3、细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液计数细胞浓度为2×106 cells/ml；

4、离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为2×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial。

5、冷冻保存方法：冷冻管置于4℃ 4hours→ -20℃ 2hours→ -80℃16～18 小时（或过夜）→ 液氮槽vapor phase 长期储存。

还要注意，复苏的细胞在第1－2周的生长可能不是特别好，最好每天换液，细胞有50－60％融合时就可以传代，以后生长就比较好了。

greenhorn0820 ：我的方法是：在37读水浴锅中先温热培养基，大约15分钟，之后再无菌操作台中准备好培养瓶，吸管等。从液氮中迅速取出冻存管，70%乙醇消毒瓶口，从温热的培养基中吸取大约1.0毫升液体，迅速吹打到冻存管中，轻轻吹打，迅速转入培养瓶，再次用未接触过细胞的吸管吸取液体，重复上面操作，直至冻存管中细胞全部转移至培养瓶，最后用培养基补齐容量，放到培养相中培养。以上动作要快。防止损伤细胞膜。邮电是比方在水浴中队细胞损伤小，且融化快。复苏率极高。试试吧。呵呵！

youhh ：细胞复苏后存活率可能是冻存时细胞状态较差或是冻存、复苏操作不当使细胞活性受到影响。理想的作法是在细胞生长状态较好，也即在80%融合时最好。冻存操作以本人的经验来看，楼上小鸭的方法是可行的，也是较为经济适用的一种。复苏细胞可根据不同细胞的培养条件，一般37℃水浴，为更快解冻也可适当提高温度。本人在复苏人来源上皮细胞时用42℃水浴复苏效果不错。从液氮中取出安瓿后即刻投入水浴，并快速晃动使之能尽短时间内融化。用培养液洗至离心管，1000rpm离心5min，弃去上清，加培养液2~3ml，转移至培养瓶培养。待细胞贴壁后（约2~3h），换液一次以清除DMSO。以上本人经验，仅供参考。操作中多摸索一下条件，会找到最理想的方法和条件的。

mlfyandw2002 ：我建议你参考北京所的冻存方法，感觉不错可以有95%的活细胞率。

细胞死了，请大家帮忙找找原因

georgia116 ：前天复苏的细胞还没贴壁就死了，昨天又复苏了一支细胞，结果还是死了。

现在基本排除了培养基污染的问题，但也不是太肯定。请教了好些人都说不出是什么原因。有人怀疑是冻存的过程中出了问题。究竟是什么原因导致细胞死亡，请大家把把脉！

附：冻存过程

1.弃去旧培养液；

2.加入0.25％胰酶约2ml；

3.消化8分钟后（每隔2－3分钟观察一次），置于显微镜下观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大；

4.倒掉胰酶，加入少许含血清RPMI10培养液，以终止消化；

5.不断吹打瓶底细胞，使之成细胞悬液；

6.将细胞悬液转移至离心管，1000rpm离心8分钟；

7.吸除上清，加入冻存液约1.2ml；

冻存液的配制：1份DMSO＋4份血清＋5份RPMI10培养基

8.不断吹打冻存液，使细胞混匀；

9.将冻存液转移至冻存管，盖好瓶塞，用胶布密封；

10.将冻存管置于－20℃冰箱保存4小时；

11.再将冻存管置于－70℃冰箱，过夜保存；

12.取出冻存管，置于液氮中保存。

lrmoon：首先，从您的描述中看细胞冻存过程无误，唯担心DMSO的品质如何。

其次，您的细胞是何种类型，一般而言，如是野生株容易生长，但如果作过转染，则比较脆弱，容易死亡。再次，复苏过程有没有注意尽量缩短时间。

有关细节可到 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=360840&sty=1

我是小米： 胰酶消化后尽量不要使劲吹打细胞，过度吹打会破坏细胞。因为在温度高时，DMSO对细胞损伤大，只要细胞在DMSO里的时候，都应保证液体低温，包括冻存以及复苏的过程中。所以冻存的时候冻存液要凉一些，复苏的时候待到还剩余一个小小的冰粒时，即可从37度水中取出，加到培养液里面时最好一滴一滴地加。

ylcui：冻存温度控制不严格，一些肿瘤细胞系可以这样简化操作，但是很多培养细胞和娇气的细胞系，这样冻存，必然产生无法复苏的后果。

关于细胞冻存的详细操作方法，可以看看Corning和NUNC公司的一些商业资料，比中文的细胞培养参考书还好。当时我参考他们的资料冻存刚分离下来的细胞，一次成功，用了10个月都没用完。很容易做好的，关键是那个梯度降温的装置，如果实验室没有程序降温仪的话，就要费点心思自己做一个。当时我试验了两天，终于做了一个每分钟降温一度的保温装置，才保证试验成功。

我的降温装置就是用一个大小适中的泡沫塑料的盒子，里面填充适当的隔热材料（棉花、晴纶棉、棉布等），用双金属片温度计放在其中试验，将其放入-80度低温冰箱，调整填充隔热材料的加入量，直至使得降温速率恰好达到每分钟降温1摄氏度。然后，这个简易装置就可以用来替代程序降温仪了。但是，这个方法仍然不严格，如有条件，还是选用程序降温仪为好。

关于一些实验室常用的“简易”细胞冻存法，我也用过，效果也凑合，但是，我平时不用，也不推荐使用。

经常从事细胞生物学工作的朋友都有个感觉，就是国内的细胞系状态普遍不如国外刚引进的细胞系好。为什么呢？关键就是国内在维护细胞系的时候采用了太多的“简易”方法。

我们的研究经费不如国外同行们多，但是，我们的科学素养不应该比人家差，条件允许的情况下，还是应该尽量按照规范操作。

mike： 你的复苏细胞过程是什么?一般比较脆弱的细胞,从液氮中取出,置37摄氏度水中快速解冻后,可以不离心，直接加入细胞瓶中培养12小时左右(至细胞贴壁),换液.可以试试

ylcui ：（TO mike）赞同。就是需要多加一些培养液，培养液的血清浓度20%，效果好一些。

liuxiaohua8：看了你的方法,好像没有不对的地方.我提两点:

1 DMSO是不是进口的?国产的最好不用,进口贵,效果的确不一样.我有个师姐用国产的,没有一次细胞复苏后长得很好的,基本不能用了.

2 我觉得你的消化时间长了点,我消化成纤维细胞也只有2-3分钟,不敢时间长,胰酶对细胞

的损伤还是大,建议时间少点.

midas： 细胞的复苏同样重要！

georgia116：我的复苏过程是：

1.于液氮罐中取出冻存的小细胞肺癌细胞株（NCI-H446），立即投入37℃水浴中，不断摇动使其融化；时间可能有一分钟了，是不是太长了？

2.用吸管吸出细胞悬液于离心管中，并加入培养液约4ml；

3.混合后低速离心1000rpm 8分钟；

4.吸去上清液，加入新RPMI10培养液；

5.将细胞悬液转移至细胞瓶，置于37℃ 5％ CO2孵箱培养。

第一次我没去掉冻存液，直接就加入新鲜培养基培养，结果细胞死了；第二次我就是按照上述方法进行复苏的，但细胞还是死了！不知怎么回事？对了，我用的DMSO就是sigma的产品。

happyf： 我很同意我是‘小米的意见’，细胞冻存、复苏的过程，关键是看冻存，在冻存的过程中，一定不能象传代的时候那样吹打细胞，因为DMSO和冻存对细胞来说都是一个损伤；还有，注意冻存的时候细胞的密度，一般情况下细胞密度大些有利于复苏；我培养过得都是肿瘤细胞，按照我的经验，DMSO是进口，还是国产的，对冻存的影响不大。还有，在细胞复苏的过程中，去除不去除冻存液影响也不大，个人感觉不去除冻存液，感觉更好

icepiao： 对，冻存时细胞密度也很重要，我以前就是细胞冻存密度太低，所以怎么也复苏不活，后来加大冻存密度，就好了。因为不管怎么改善冻存条件，细胞都会死亡的。

qjzhou2000：复苏过程基本上问题不是很大，原则上要求从液氮中取出到完全融化最好控制在1min内。加培养液的时候最好稍稍摇匀，这样减轻环境（渗透压）突然变化带来的细胞死亡。

我个人认为可能冻存上有点问题，不知你刚刚复苏出来细胞内的黑色颗粒多不多？

icelawn： 给georgia116的建议：

我师兄的硕士课题用的就是NCI-H446细胞，感觉还是挺好养的。他的细胞也进行了转基因等实验，冻存后复苏细胞，状态相当好。

细胞冻存时的降温过程很重要，我们实验室都采取以下冻存方法，无论是肿瘤细胞还是平滑肌细胞复苏后状态都很好：

首先，细胞冻存前一天换新鲜培养液，这一点很重要！否则，细胞在陈旧培养液中已经状态不好，经过强烈的冻存刺激，复苏后是难以生长的。再次，冻存过程为4度过夜，—20度2小时，之后悬挂在液氮罐颈口1小时，最后将细胞沉于液氮中。这个冻存过程虽然没有达到ylcui朋友所说的严格的温度梯度，但是实践证明效果还是很好的。复苏时冻存细胞溶解后，可不必离心，将细胞悬液直接加入培养瓶补充培养液后置37度CO2孵箱培养。次日，待细胞贴壁后，及时更换新鲜培养液。最后，至于DMSO是不是进口的并不特别重要。消化时只要在显微镜下观察别消化过度，就可以，毕竟大家胰酶的配方都不是特别一样。

kinky：带我养细胞的老师一直强调DMSO要最后加，就是说，一定要在加入培养液后再加入DMSO。

另外我觉得你消化的时间太长了，不能每隔2-3分钟观察一次，必须不停的观察，因为消化的过程非常快，也许一不小心就过了。这个可能是最关键的地方，消化液也必须用移液管全部吸干净。另外，你复苏时候，离心8分钟，1000RPM好象太长了。一般可以不离心的。如果要离心，我一般都是刚上到1000RPM就停了，整个过程，就是3-4分钟吧 。

diasy： 我觉的冻存液的配置可能10％的DMSO＋90％的血清效果肯定比较好点，我有体会。

复苏细胞时到底离心好还是及早换液好

yuan007007： 看到国内的多数参考书中都提到细胞复苏后应尽快去掉DMSO,是因为常温下的DMSO对细胞毒性很大,所以多采用离心的方法. 但是国外的一些机构(如ATCC)和院校都不主张采用离心的方法, 认为离心对细胞的损伤远甚于残留DMSO的损伤(Centrifugation should not be performed to remove cells from the cryoprotectant cocktail. This action is more damaging than the effects of DMSO residue in the culture.)这里想问问各位有经验的细胞高手,你们习惯采用哪种方法?或者实际对比过两种方法的优劣?因为我们最近购买了一株细胞挺贵的,看到参考书莫衷一是,拿不定主意?听听各位的意见.

314159： 以前我都的3-4小时后换液的，一般细胞生长的都还可以，上一次我做了一个离心对照：低速离心后，用生长液洗一遍，再放入预先准备好的培养瓶。结果是后者的长得好，现在其他人也该用离心法 了。不过，我认为不管离心还是换液，重要的一步是刚从液氮拿出的时候动作一定要快，马上解冻，比较关键。

flare100： 依我的经验，离心好。第一次，没有离心，复苏的不错。第二次，细胞全死了，虽然后来想了一下，那一瓶DMSO量多，但由此可见，DMSO对细胞不好。所以，以后一直离心，没有任何问题出现。

anqi： to be or not to be这是一个永远也无法回答的问题，因为没有人能够说清楚。究其原因是因为每个实验室常用的细胞不同，所用培养液不同，每个人的习惯不同，不能一概而论。其实这也是一个个人的经验而已。你自己认为可以就行了。我们实验室有的人就喜欢离心，有的人不喜欢。我就图简单，拿出来复苏后直接放到瓶子里第二天换液，如果挺好的就第三天换液，没什么。你要是觉得不离心好像不行，那你就离心不就完了么。有什么难的。

wolfeye：用DMSO还是离心的好，为什么不用甘油，这样也就不用离心了，直接换液就行了

司马： 我用DMSO冻存，复苏时从来不离心，等细胞贴壁后换液。看许多书上说，DMSO只对少数敏感细胞有毒性，我也就省事不离心了。细胞复苏长的很好！

bioflow： 我们这里基本上复苏细胞也是不离心。

复苏时细胞极有可能被污染

cleanice ：复苏时因为冻存管管盖爆开，细胞极有可能被污染。现在已经复苏快48h了，细胞状态还可以，培养液也清澈，24-48h内出现的污染是细菌污染的可能性大，那么霉菌、支原体污染出现在什么时候呢？多长时间后，如果细胞状态依然良好，镜下也没有发现可疑，可以排除污染？

zbbnet： 首先，建议楼主继续关注。因为有如述操作上的重大失误，总让人不能完全放心。另外楼主也许真的庆幸，毕竟空气中的菌不是排得密不透风，何况细胞实验室本身做过消毒处理。再则，冻存如果冻存液是用DMSO配制的，还有一定的杀菌作用。

楼主在解冻时是不是在水浴锅中进行的，当管盖暴开时，有没有水浴锅中的水进入冻存管，如果有水进入，污染的系数就大了，因为水浴锅可以说是细胞实验室中的一个重要的污染源。我们实验室在做细胞复苏时，都要求做之前给水浴锅换水。

关于各中污染最有可能出现的时间，最常见的大肠杆菌能够在24小时内明显出现，但也有些细菌繁殖慢，既然楼主的细胞已经培养了48小时，建议在高倍镜下检查一下，看有没有可以物，尤其是会动的东西。霉菌孢子污染有一段时间的潜伏期，但其生长迅速，48小时也能形成明显的菌丝。支原体污染一般不易鉴别，楼主只有继续养着看。

cleanice：是用保温瓶自来水兑上开水配成37度，水极有可能进入了冻存管中，而且当时我特别心烦意乱，就把管开口放在了无菌操作室以外，本来都打算扔了的，过了几分钟，发现管底部还有一点液体，因为这是最后一支细胞了，实在很不甘心就这么绝种了，于是就把这么一点细胞养起来了。我现在分了一半出来，每天换液一次，加10倍双抗培养，准备冲击3天，看看能不能救回来。现在处理和未处理的细胞状态都还可以。

因为我的细胞是悬浮的，这样每天换液时，为了保证密度，都要离心换液，我担心每天离心对细胞不好，该怎么办呢？还要观察多长时间？

engla0931： 不用太紧张，如果不污染是因为你的运气好，再说每次放在外面都会污染的，有的时候我的操作也不是很严格，细胞也没什么问题，因为培基里面是有抗生素的。当然污染的几率很大，但绝不是100%。

你可以把你的细胞继续培养，一般来说3-4天如果真有污染的话，细菌会出现的，过一周你就可以放心大胆地做后面的实验了。如果有污染也没办法，但据你所说的情况，好象污染的可能性比较小。

如果是支原体之类的污染，细胞生长状态会明显变差，而且那也没好办法去除。

每天离心不会对细胞影响太大，只要你不要转速太高就行了。

zbbnet：将细胞分成两瓶应该是个不错的注意，一瓶正常培养，一瓶作防污处理。

楼主在冲击时不要太过头了，怕细胞没污染，反倒被冲击得状态不好了。

cleanice： 我看到精华区里说，一般防污都要每天换液至少2、3次，我每天一次会不会太少了，主要是悬浮细胞密度不大，不敢换液太频繁