咽喉清口含片HPLC特征图谱质量控制方法研究

咽喉清口含片ＨＰＬＣ特征图谱质量控制方法研究

李文周１ꎬ２ꎬ李一圣１ꎬ２ꎬ陈艳艳１ꎬ２ꎬ胡文会１ꎬ２ꎬ肖增丽１ꎬ２ꎬ范晓梅３ꎬ邱书奇１ꎬ２

(１.深圳市龙岗区耳鼻咽喉医院ꎬ广东深圳５１８１１６ꎻ２.深圳市耳鼻咽喉研究所ꎬ广东深圳５１８１１６ꎻ

３.暨南大学附属深圳市宝安区妇幼保健院ꎬ广东深圳５１８１３３)

摘要:目的　考察建立咽喉清口含片高效液相色谱(ＨＰＬＣ)特征图谱质量控制方法ꎮ方法　采用高效液相色谱法ꎬ色谱柱为ＷａｔｅｒｓＳｙｍｍｅｔｒｙＣ１８柱(４.６ｍｍ×２５０ｍｍꎬ５μｍ)ꎬ流动相为乙腈－０.４％磷酸水溶液ꎬ梯度洗脱ꎬ检测波长为２６０ｎｍꎬ流速为１.０ｍＬ􀅰ｍｉｎ－１ꎬ柱温为３０℃ꎬ测定１０批次咽喉清口含片样品ꎬ并将所获得的色谱图导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图相似度评价系统(２０１２版)”ꎬ经过多点校正和数据匹配生成色谱特征图谱共有模式ꎬ计算各批次样品图谱与标准图谱的相似度ꎬ并以色谱图中绿原酸峰为参照峰ꎬ计算各色谱峰相对保留时间ꎮ结果　得到咽喉清口含片特征图谱共有模式ꎬ确认了２０个共有特征峰ꎮ结论　经过方法学验证ꎬ所建立方法稳定可行ꎬ可用于咽喉清口含片的质量控制ꎮ

关键词:咽喉清口含片ꎻ高效液相色谱ꎻ特征图谱ꎻ质量控制

中图分类号:Ｒ９２７.１１　文献标识码:Ａ　文章编号:２０９５－５３７５(２０１９)０３－０１５２－００４ｄｏｉ:１０.１３５０６/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊｐｒ.２０１９.０３.００６

ＳｔｕｄｙｏｎＨＰＬＣｓｐｅｃｉｆｉｃｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆＹａｎｈｏｕｑｉｎｇＢｕｃｃａｌＴａｂｌｅｔｓ

ＬＩＷｅｎｚｈｏｕｇ１ꎬ２ꎬＬＩＹｉｓｈｅｎｇ１ꎬ２ꎬＣＨＥＮＹａｎｙａｎ１ꎬ２ꎬＨＵＷｅｎｈｕｉ１ꎬ２ꎬＸＩＡＯＺｅｎｇｌｉ１ꎬ２ꎬＦＡＮＸｉａｏｍｅｉ３ꎬＱＩＵＳｈｕｑｉ１ꎬ２

(１.ＳｈｅｎｚｈｅｎＬｏｎｇｇａｎｇＥＮＴＨｏｓｐｉｔａｌꎬＳｈｅｎｚｈｅｎ５１８１１６ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＳｈｅｎｚｈｅｎＥＮＴＩｎｓｔｉｔｕｔｅꎬＳｈｅｎｚｈｅｎ

５１８１１６ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＳｈｅｎｚｈｅｎＢａｏ′ａｎＤｉｓｔｒｉｃｔＭａｔｅｒｎｉｔｙａｎｄＣｈｉｌｄＨｅａｌｔｈＨｏｓｐｉｔａｌＡｆｆｉｌｉａｔｅｄ

ｔｏＪｉｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＳｈｅｎｚｈｅｎ５１８１３３ꎬＣｈｉｎａ)

Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｓｐｅｃｉｆｉｃｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓｍｅｔｈｏｄｆｏｒＹａｎｈｏｕｑｉｎｇＢｕｃｃａｌＴａｂｌｅｔｓｂｙＨＰＬＣ.

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＵｓｉｎｇａｎＨＰＬＣｍｅｔｈｏｄｗｉｔｈＷａｔｅｒｓＳｙｍｍｅｔｒｙＣ１８ｃｏｌｕｍｎ(４.６ｍｍ×２５０ｍｍꎬ５μｍ)ꎬｔｈｅｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅｗａｓａｍＬ􀅰ｍｉｎ－１ꎬａｎｄｔｈｅｃｏｌｕｍｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓ３０℃.Ｉｎｏｕｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔꎬ１０ｂａｔｃｈｅｓｏｆＹａｎｈｏｕｑｉｎｇＢｕｃｃａｌＴａｂｌｅｔｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒ￣ｍｉｎｅｄｔｏｇａｉｎｔｈｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓꎬｗｈｉｃｈｗｅｒｅｔｈｅｎｉｍｐｏｒｔｅｄｔｏｔｈｅＳｉｍｉｌａｒｉｔｙＥｖａｌｕａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃＦｉｎｇｅｒ￣ｐｒｉｎｔｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ(２０１２).Ｂｙｔｈｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍꎬｔｈｅｃｏｍｍｏｎｐａｔｔｅｒｎｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃｃｈｒｏｍａｔｏ￣ｇｒａｍｗａｓａｃｑｕｉｒｅｄꎬｔｈｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｂｅｔｗｅｅｎｓａｍｐｌｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆｅａｃｈｂａｔｃｈａｎｄｃｏｍｍｏｎｐａｔｔｅｒｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｗｅｒｅｆｉｇ￣ｕｒｅｄｏｕｔꎬａｆｔｅｒｗａｒｄｓｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｔｉｍｅｏｆｅａｃｈｃｏｍｍｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｐｅａｋｓｔｏｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃａｃｉｄｐｅａｋｗｅｒｅａｌｓｏｃａｌｃｕｌａｔｅｄ.Ｒｅ￣ｓｕｌｔｓ　ＴｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆＹａｎｈｏｕｑｉｎｇＢｕｃｃａｌＴａｂｌｅｔｓｗａｓａｃｑｕｉｒｅｄꎬ２０ｃｏｍｍｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｐｅａｋｓｗｅｒｅｃｏｎ￣Ｔａｂｌｅｔｓ.

ｆｉｒｍｅｄ.Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＴｈｅｍｅｔｈｏｄｗａｓｓｔａｂｌｅａｎｄｆｅａｓｉｂｌｅꎬａｎｄｃａｎｂｅａｐｐｌｉｅｄｔｏｃｏｎｔｒｏｌｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｏｆＹａｎｈｏｕｑｉｎｇＢｕｃｃａｌ

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＹａｎｈｏｕｑｉｎｇＢｕｃｃａｌＴａｂｌｅｔｓꎻＨＰＬＣꎻＳｐｅｃｉｆｉｃｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍꎻＱｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌ

ｍｅｔｈａｎｏｌ－０.４％ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃａｃｉｄｓｏｌｕｔｉｏｎꎬｗｉｔｈｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕｔｉｏｎꎬｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｗａｓ２６０ｎｍꎬｔｈｅｆｌｏｗｒａｔｅｗａｓ１.０

　　咽喉清口含片是由金银花、玄参、青果和胖大海等十多味药材组成的中药制剂ꎬ具有清热解毒、化痰利咽的功能ꎬ临床上用于外感风热型急性咽炎的治

疗ꎬ疗效确切[１]ꎮ目前ꎬ该制剂主要通过薄层鉴别及绿原酸含量测定来控制产品质量ꎮ然而ꎬ咽喉清口含片组方药味较多ꎬ制备工艺过程中各药味采用

　基金项目:深圳市科技计划项目－学科布局(Ｎｏ.ＪＣＹＪ２０１７０４１２１０３８４１３８６)ꎻ深圳市龙岗区科技发展资金医疗卫生项目(Ｎｏ.　作者简介:李文周ꎬ男ꎬ助理研究员ꎬ研究方向:药物开发ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｗｅｎｚｈｏｕｌｅｅ＠ｑｑ.ｃｏｍ２０１６０６０８１０４６０９２４４)ꎻ深圳市卫生计生系统科研项目(Ｎｏ.２０１６０５０２４)

药学研究􀅰ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ２０１９Ｖｏｌ.３８ꎬＮｏ.３􀅰１５３􀅰

分组处理方式ꎬ药效物质基础复杂ꎬ仅以单一成分的含量为指标进行质量控制存在明显不足ꎬ未能全面有效的控制该制剂的综合质量ꎬ已不能满足日益严格的药品质量控制要求ꎮ因此ꎬ我们开展咽喉清口含片的色谱特征图谱研究ꎬ并拟将其应用至该制剂的质量标准中ꎬ以期更好的对其质量均一性和稳定１　仪器与试药性进行控制ꎮ

２.３　测定法　精密吸取供试品溶液和对照品溶液各１０μＬꎬ注入高效液相色谱仪ꎬ测定ꎬ记录３５ｍｉｎ色谱图ꎮ２.４　方法学考察

２.４.１　精密度考察　取同一份供试品溶液(批号:１６０５１０１)ꎬ连续进样６次ꎬ考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性ꎮ结果各色谱峰的相对保留时间的ＲＳＤ均小于０.２６％ꎬ各色谱峰的相对峰面积的ＲＳＤ均小于２.７８％ꎬ表明仪器精密度符合特征图谱技术要求ꎮ

１.１　仪器　Ｗａｔｅｒｓ２６９５/２９９８高效液相色谱仪ꎬＥｍｐｏｗｅｒ３色谱工作站ꎬ国家药典委员会中药色谱特征图谱相似度评价系统(２０１２版)ꎬＫＱ３２００ＤＥ型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)ꎻ分析天平(ＳａｒｔｏｒｉｕｓＢＴ２５ｓ、ＳａｒｔｏｒｉｕｓＢＳＡ１２４ｓ)ꎮ

绿原酸对照品(批号:１１０７５３－２０１３１４)、次野鸢尾黄素对照品(批号:１１１５５７－２００６０２)均购于中国食品药品检定研究院ꎬ甲醇、乙腈为色谱级ꎮ咽喉清口含片１０批为深圳市龙岗区耳鼻咽喉医院院内制剂ꎬ由广东五虎山药业有限公司生产ꎬ样品批次见表１ꎮ

表１　１０批咽喉清口含片样品列表

编号批号编号批号Ｓ１Ｓ２１６０５１０１Ｓ３１６０８１０１Ｓ６１６１０１０２Ｓ４１６０８１０２Ｓ７Ｓ８１６１０１０３１７０４１０１Ｓ５

１６０８１０３１６１０１０１

Ｓ１０Ｓ９

１７０４１０２１７０４１０３

２　２.１　方法与结果

(４.６色谱条件ｍｍ×２５０　固定相为ｍｍꎬ５μｍ)ꎻＷａｔｅｒｓ流动相为乙腈ＳｙｍｍｅｔｒｙＣ－１８色谱柱０.４％磷酸水溶液ｍｉｎ:乙腈１３％ꎬ梯度洗脱~５７％ꎬ２８ꎬ０~~５２８.ｍｉｎ:０１ｍｉｎ:乙腈乙腈１３％ꎬ５５７％~２８１３％ꎬ２８.０１~３５ｍｉｎ:乙腈~

流速为１.０ｍＬ􀅰ｍｉｎ－１ꎻ柱温为１３％ꎻ３０检测波长为℃ꎮ

２６０ｎｍꎻ２.２　２.２.１　溶液的制备

衣ꎬ研细供试品溶液制备ꎬ精密称取１.５ｇꎬ　加入甲醇取咽喉清口含片ꎬ除去包３０ｍｉｎ(２５０Ｗꎬ５０ｋＨｚ)ꎬ滤过ꎬ滤液蒸干３０ｍＬꎬꎬ残渣加水超声提取２０取３ｍＬ次完全转移至分液漏斗中ꎬ每次２０ｍＬꎬ取乙酸乙酯层ꎬ加乙酸乙酯振摇提ꎬ合并ꎬ蒸干ꎬ加甲醇５ｍＬ使溶解并稀释至刻度ꎬ滤过ꎬ取续滤液ꎬ作２.２.２　为供试品溶液[２]对照品溶液制备ꎮ

素适量ꎬ分别加甲醇制成每　取绿原酸和次野鸢尾黄１ｍＬ含绿原酸３０μｇ、

含次野鸢尾黄素１０μｇ的对照品溶液[３]滤液ꎬ即得ꎮꎬ滤过ꎬ取续２.４.２　１６０５１０１)ꎬ稳定性试验察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的一致分别于０、２、４、８、１２、２４　取同一份供试品溶液ｈ时进行测定(批号ꎬ考:性０.３５％ꎬꎮ结果各色谱峰的相对保留时间的３.５８％ꎬ征图谱技术要求表明供试品溶液在各色谱峰的相对ＲＳＤ均小于ꎮ２４峰面ｈ内保持稳定积的ＲＳＤꎬ均符合特小于２.１６０５１０１)ꎬ４.３　重复性试验　取咽喉清口含片(批号:液６份ꎬ按按“２.３”“２.２.１”项下所述方法进行测定项下所述方法制备成供试品溶ꎬ考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性ꎮ结果各色谱峰的相对保留时间的ＲＳＤ均小于０.３１％ꎬ各色谱峰的相对峰面积均小于４.７２％ꎬ表明该方法具２.５　有良好的重现性特征图谱共有模式建立ꎬ符合特征图谱技术要求ꎮ[４]１０项下色谱条件进行高效液相色谱批(见表１)ꎬ分别制备供试品溶液　取咽喉清口含片(ＨＰＬＣ)ꎬ按上述分析“２.１”ꎬ记录色谱图ꎬ并导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图相似度评价系统(２０１２版)”ꎬ经过多点矫正和数据匹配生成色谱特征图谱共有模式ꎬ通过比对ꎬ确定２０个共有特征峰ꎬ以对照品进行指认ꎬ确定其中５号峰为绿原酸ꎬ２０号峰为次野鸢尾黄素ꎮ以绿原酸色谱峰为参照峰ꎬ计算各色谱峰的相对保留时间(各共有峰保留时间与绿原酸峰保留时间之比)及各批次样品图谱与标准图谱的相似度(由相似度评价系统计算导出)ꎮ结果１０批咽喉清口含片的ＨＰＬＣ色谱图如图１所示ꎬ其中Ｒ为共有模式标准图谱ꎮ各特征峰的相对保留时间见表２ꎬ相似度计算结果见表３所示ꎮ

结果显示ꎬ１０批咽喉清口含片样品图谱与标准图谱(见图２)对比ꎬ其相似度均不低于０.９７ꎬ表明该方法稳定可靠ꎬ可应用于该制剂的质量控制ꎮ根据试验结果ꎬ所有被测试的供试品图谱ꎬ均应有２０个特征峰ꎬ且各特征峰的相对保留时间应如表２所示ꎮ􀅰１５４􀅰药学研究􀅰ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ２０１９Ｖｏｌ.３８ꎬＮｏ.３

图１　１０批咽喉清口含片的ＨＰＬＣ色谱图及其共有模式图谱

图２　咽喉清口含片ＨＰＬＣ标准特征图谱及共有峰

表２　咽喉清口含片特征图谱中各共有特征峰的

相对保留时间表(ｘ±ｓ)

色谱峰编号

１２３４５６７８１０９

相对保留时间０.４４±０.００２９０.４９±０.００２１０.６５±０.００１００.７８±０.０００５１.００±０.００２８１.３８±０.００３５１.４９±０.００２９１.５６±０.００２３１.６１±０.００２２１.６８±０.００２１

色谱峰编号

１１１２１３１４１５１６１７１８１９２０

相对保留时间１.８０±０.００２３１.９１±０.００１９２.０２±０.００２６２.０８±０.００３５２.２１±０.００３５２.４７±０.００４１３.０７±０.００４９３.１８±０.００６０３.３０±０.００６９３.７６±０.００８６

方制剂成分复杂难明ꎬ以单一成分为指标对中药制剂进行质量控制的方法ꎬ常在科学性和合理性方面受到质疑ꎬ为此业界也在不断探索更加合理的质量控制方法ꎬ其中ꎬ色谱特征图谱质控技术作为一种能更好体现中药成分整体性的技术手段ꎬ近年来在中药制剂质量标准中的应用越见广泛[５]ꎮ咽喉清口含片处方由十多味中药组成ꎬ在制备时ꎬ考虑到各药味的不同性质ꎬ采用了分组处理工艺ꎬ金银花、玄参和青果等采用水提工艺ꎬ而射干、山豆根和锦灯笼等采用醇提工艺ꎮ分组处理工艺兼顾了组方药味各自所含有效成分的特点ꎬ同时也对其质量控制方法提出了更高的要求ꎬ尤其是在制剂制备过程的控制上ꎬ如何有效控制不同处理组中间产物的质量ꎬ是我们必须重点考虑的问题ꎮ

咽喉清口含片此前的质量标准主要依赖多味药材的薄层鉴别和绿原酸的含量测定ꎬ这显然无法满足我们对该制剂的质量控制要求ꎮ该标准中ꎬ绿原酸为处方中君药金银花的主要有效成分ꎬ其含量测定结果可一定程度上反映水提组工艺和质量情况ꎬ

表３　１０批样品图谱与标准图谱相似度

样品编号

Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４Ｓ５

相似度０.９７４０.９７４０.９７６０.９７９０.９７７

样品编号

Ｓ６Ｓ７Ｓ８Ｓ１０Ｓ９

相似度０.９８５０.９７７０.９７００.９７８０.９８８

３　讨论

３.１　相对于化学药品成分组成的清晰明了ꎬ中药复

药学研究􀅰ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ２０１９Ｖｏｌ.３８ꎬＮｏ.３􀅰１５５􀅰

但醇提组的相关情况则为监控盲点ꎬ那么是否再建立一个指标成分的含量测定方法?或者还有更合理的解决方案?基于此考虑ꎬ我们建立咽喉清口含片色谱特征图谱质控方法ꎬ并将其增补至制剂和中间品的内控标准中ꎬ应用于制剂制备的全过程控制ꎬ以期更好的保证所生产制剂质量的一致性和均一性ꎮ初步试验结果表明ꎬ该方法合理可行ꎬ其有效应用ꎬ３.２　必须指出ꎬ本试验仅使用连续生产的１０批产限于客观条件ꎬ咽喉清口含片虽已获得国家中药六类新药临床批件ꎬ并完成临床试验ꎬ但现阶段仍然仅为医疗机构制剂ꎬ生产批次不多ꎬ随着后续生产批次３.３　本试验初步以绿原酸和次野鸢尾黄素对照品进行色谱峰的指认ꎬ其中绿原酸为处方中君药金银花的主要有效成分ꎬ次野鸢尾黄素则为射干中主要有效成分之一[６]ꎮ两种成分可分别在一定程度上反映水提组药味和醇提组药味的工艺和质量情况ꎬ初步验证所建立的特征图谱质控方法ꎮ后续的试验中ꎬ考虑进一步进行多色谱峰归属指认ꎬ再分别于细胞水平和动物水平上ꎬ开展基于抗炎抗氧化作用的理性和组分作用机制ꎮ

谱效关系探讨[７－９]ꎬ以揭示咽喉清口含片的组方合３.４　由于成分的复杂性ꎬ多数中药制剂的ＨＰＬＣ特征图谱洗脱时间较长ꎬ考虑到药品生产过程中时间保证色谱峰分离情况的基础上ꎬ尽量缩短样品进样洗脱时间ꎬ控制整个过程的时长ꎬ以提高效率ꎮ当然ꎬ随着色谱技术的进步ꎬ控制时长提高效率的方法已经有了更多选择ꎬ如利用超高效液相色谱(ＵＰＬＣ)来进行分析等ꎬ但由于咽喉清口含片生产单位的条件ꎬ现阶段乃至未来一段时期内ꎬ成本和有机试剂耗用量的节约ꎬ建立方法时ꎬ我们在的不断增多ꎬ所建立的图谱仍需不断进行验证完善ꎮ可获得良好效果ꎮ

ＨＰＬＣ法仍然不可替代ꎬ因此我们只能尽量控制其３.５　试验过程中ꎬ我们曾以绿原酸和次野鸢尾黄素综合转移率为指标ꎬ对供试品溶液制备方法进行考察ꎬ比较了甲醇提取后乙酸乙酯萃取和乙酸乙酯直接提取的效果ꎬ结果乙酸乙酯直接提取所制备的供试品溶液ꎬ色谱信息不够丰富ꎬ部分色谱峰极小ꎬ不利于积分统计ꎬ因此确定先以甲醇提取后加乙酸乙酯进行萃取ꎮ在此基础上又考察了提取溶剂(水、甲醇)、提取方式(超声提取、加热回流提取)、提取时间、萃取次数、萃取溶剂用量等条件ꎬ结果确定供试品溶液制备方法如正文所示ꎮ

参考文献:

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曾浩涛ꎬ李一圣ꎬ李文周ꎬ等.ＨＰＬＣ法测定咽喉清口含片中次野鸢尾黄素的含量[Ｊ].药学研究ꎬ２０１５ꎬ３４(２):７２－７４.[３][４][５]

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洗脱时长ꎮ

品进行研究测试ꎬ样本量较少ꎬ考察仍然不够充分ꎮ

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