氨苄西林和庆大霉素体外诱导金黄色葡萄球菌耐药实验

柯莹莹

（茂名市茂南区高山镇动物卫生监督分所，广东茂名　525011）

摘　要：了解金黄色葡萄球菌在庆大霉素、氨苄西林钠最小抑菌浓度（MIC）下耐药性的产生，为临床用氨苄西林钠、庆大霉素治疗金黄色葡萄球菌用药疗程提供指导。本实验在1/4MIC浓度上递倍逐步升高药物浓度，用庆大霉素、氨苄西林钠诱导金黄色葡萄球菌的耐药性，并对比诱导前后MIC、细菌形态特征，进行体内耐药实验。经过体外诱导试验，庆大霉素的MIC由4μg/ml升到32768μg/ml，氨苄西林钠的MIC由1μg/ml升到16384μg/ml。由此可知金黄色葡萄球菌通过短期的体外诱导耐药内会对庆大霉素、氨苄西林钠产生稳定的耐药性。

关键词：金黄色葡萄球菌；氨苄西林钠；庆大霉素；体外诱导；耐药性

1　前言

金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，而且是革兰氏阳性菌的代表，其在自然界中，广泛存在于空气、土壤、水及物品上，特别是人和家畜的体表及外界相通的腔道检出率相当高[1]。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染[2]；同时金黄色葡萄球菌亦可引起食物中毒，因其在自然界中存在广泛，食品受到污染的机会很多。金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8～10h即可产生相当数量的肠毒素，导致食物中毒。

庆大霉素属氨基糖甙类抗生素，其抗菌谱广，主要作用于细菌的核糖体抑制蛋白的正常合成，使细菌细胞膜通透性增强，导致细胞内钾离子腺嘌呤核甘酸等重要物质外漏引起细菌死亡。对革兰氏阴性菌或阳性菌都具良好的抗菌作用，革兰阳性菌中，金黄色葡萄球菌对该品敏感[3]。

氨苄西林钠问世于20世纪70年代，氨苄西林钠是一种为广谱半合成青霉素类抗生素，作用与青霉素基本相同，但抗菌谱较青霉素为广，对革兰阳性球菌作用与青霉素相仿。通过抑制细菌细胞壁合成发挥抗菌作用，特别是对革兰氏阳性菌有很好的抗菌效果。

金黄色葡萄球菌是获得性感染最常见的致病菌之一，随着抗菌药物的广泛应用，尤其是随着广谱抗生素的广泛使用，使金黄色葡萄球菌的耐药菌株开始不断出现，且呈多重耐药性[4]。庆大霉素和氨苄西林钠对金黄色葡萄球菌均有抗菌作用，通过查询各种的资料发现现阶段没有人对庆大霉素、氨苄西林钠治疗金黄色葡萄球菌产生的耐药性进行研究。本实验利用庆大霉素、氨苄西林钠短期体外诱导金黄色葡萄球菌，了解金黄色葡萄球菌产生耐药性的过程，探讨其产生耐药性的浓度和速度，以便指导临床金黄色葡萄球菌的治疗。2　实验材料2.1　实验动物

家兔两只，体重分别为2.1kg和2.3kg。实验前饲予青草、粉碎后的玉米颗粒。临床检查健康后进行实验，试验期间自由摄食、饮水。

2.2　实验菌株

金黄色葡萄球菌冻干粉2.3　主要试剂、药品

药敏实验试剂盒 杭州天和微生物试剂有限公司生产2012-07-12生产

200

营养肉汤 北京陆桥技术有限责任公司，批号110321营养琼脂 北京陆桥技术有限责任有限公司2011-10-15生产革兰氏染色试剂盒 广东环凯微生物科技有限公司2012-08-21生产注射用氨苄西林钠 石药集团中诺药业（石家庄）有限公司硫酸庆大霉素注射液 上海同仁药业有限公司上海兽药厂

2.4　主要仪器、设备

生物显微镜（ECLIPSE E200） 日本Nikon公司

微量移液器（WKY） 上海求精生化试剂仪器有限公司BCM-1000型生物洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司SPX-250B-Z型生化培养箱 上海实业有限公司医疗设备厂手提式压力蒸汽灭菌器 上海实业有限公司医疗设备厂一次性注射器（2ml）、培养皿、烧杯、接种环、载玻片、盖玻片、容量瓶等。

3　实验方法

3.1 供试菌液的制备

用接种环挑取金黄色葡萄球菌放入营养肉汤，置于37℃生化培养箱中培养16～24h，第二天用接种环蘸取营养肉汤中的菌液在营养琼脂平板上划线培养16～24h，第三天条用接种环挑取单个菌落并用无菌肉汤稀释1000倍，用于药物MIC的测定。另外取菌种在普通琼脂平板上纯培养18h。以上操作均在超净工作台无菌的环境下进行。

3.2　供试药物最小抑菌浓度（MIC）的测定

分别取无菌带胶塞试管12支，在超净工作台无菌的环境下，将复壮后的金黄色葡萄球菌菌液用普通营养肉汤稀释为1×104CFU/ml，第一试管中加入1.8ml的稀释菌液，其余各管加1.0ml，将氨苄西林钠、庆大霉素药液（128ug/ml）分别取0.2ml加入第一管充分混合后，吹打均匀取1.0ml加入第二管，依次类推，直至第11管，混匀后自第11管弃去1ml。第12管不加药物为空白对照。12个试管内的肉汤中药物含量分别为128、、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0ug/ml。稀释完毕后，塞紧胶塞，置于37℃生化培养箱培养16-18h后查看结果。此试验每种药品均重复两次。

3.3　诱导耐药性实验

将实验菌接种于营养琼脂平板上，置于37℃生化培养箱培养16～24h，挑取取单个菌落制备1×108 CFU/ml细菌悬液，取细菌悬液接种于含药液的营养肉汤培养基中，使初始浓度为1/4MIC，每次传代逐步递增升高药物的浓度，于37℃培养24h为一代，继续进行药物诱导实验，当细菌生长抑制时可用同一浓度或降低其浓度再次进行培养。每增加药物浓度进行药物诱导实验的同时接种含耐药MIC浓度普通营养琼脂进行同期培养，观察细菌生长情况，无细菌生长，说明浓度达到最小杀菌浓度。

与此同时，将实验菌接种于不含药物的营养肉汤中作为质控菌进行连续同期培养。

3.4　诱导性耐药菌株的稳定性试验

将诱导出的高度耐药的金黄色葡萄球菌菌株接种于无抗菌药物的普通营养肉汤，于37℃培养每24h转种培养一代，连续培养10代。然后采用试管二倍稀释法测定供试药物对耐药供试菌株的MIC。

3.5　耐药菌的形态变化观察

用革兰氏染色法[5]对金黄色葡萄球菌进行染色、镜检，对比

www.sydkzz.com观察各组金黄色葡萄球菌的形态变化。3.6　体内耐药性实验

健康家兔2只，随机编号A、B，适应性喂养1周，观察采食情况。A兔予以腹腔注射经诱导的金黄色葡萄球菌菌株1ml，B兔腹腔注射等体积未经诱导的金黄色葡萄球菌菌株。并同时分别予以腹腔注射20mg剂量的氨苄西林钠。腹腔注射后观察各兔的行为表现，如发现死亡的家兔即进行剖检，进行病理学观察，未死亡兔96h后处死并留取病理标本。4　结果

4.1　诱导前后各组金黄色葡萄球MIC的测定结果

诱导前金黄色葡萄球菌、同期传代培养的金黄色葡萄球菌和诱导后的金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）的详细对比见表1。

表1 诱导前后各实验组的MIC

金黄色葡萄球菌

MIC（μg/ml）

庆大霉素

氨苄西林钠

诱导前41同期传代培养41庆大霉素诱导后32768-氨苄西林钠诱导后

-16384

由表1可以看出，金黄色葡萄球菌经同期传代培养后测定MIC，结果与传代前原株比较无明显变化；而经庆大霉素诱导后的金黄色葡萄球菌与原株比较，耐药株的MIC增加了8192倍；经氨苄西林钠诱导后的金黄色葡萄球菌与原株比较，耐药株的MIC则增加了16384倍，诱导后的耐药株全部为高度耐药株。4.2　诱导耐药性实验结果

表2 金黄色葡萄球菌药物诱导过程（d）

药物浓度（μg/ml）

0.250.512481632庆大霉素 111111111氨苄西林钠111111111无药

1

1

1

1

1

1

1

1

1

续表2 金黄色葡萄球菌药物诱导过程（d）

药物浓度（μg/ml）

12825651210242048409681921638432768庆大霉素111112333氨苄西林钠111123333无药

1

1

1

1

1

1

1

1

1

注：图中数字表示对应药物浓度诱导金黄色葡萄球菌天数。由表2可以看出，未加药品同期传代金黄色葡萄球菌进行传代期间生长均未受抑制，在营养肉汤中生长迅速，管底常有多量白色沉淀。

经庆大霉素诱导后的金黄色葡萄球菌，体外诱导耐药至第13代（4096µg/ml）时细菌的生长开始受到抑制，随着药液浓度的升高，在普通肉汤中生长变缓慢；诱导至16代细菌即MIC达到32768µg/ml时金黄色葡萄球菌基本停止生长。

而经氨苄西林钠诱导后的金黄色葡萄球菌于第14代（2048µg/ml）时细菌的生长也开始受到了抑制，随着药液浓度的升高，在普通肉汤中生长变得缓慢；体外诱导耐药至17代即MIC达到16384µg/ml时金黄色葡萄球菌基本停止生长。4.3　诱导前后金黄色葡萄球菌形态变化

诱导前金黄色葡萄球菌：于37℃生化培养箱培养24h后，金

2019年2月下实验研究黄色葡萄球菌在琼脂平板上即形成大量湿润、光滑、隆起的圆形菌落，菌落颜色呈白色，直径1～2mm。在营养肉汤中生长迅速，管底有多量白色沉淀，经震荡后沉淀物上升，旋即消散，肉汤即变浑浊。经革兰氏染色后镜检，金黄色葡萄球菌呈紫色，菌体圆形，葡萄串状排列，排列较松散。

诱导后金黄色葡萄球菌：于37℃生化培养箱培养24h后，高度耐药的金黄色葡萄球菌在琼脂平板上形成少量白色湿润、光滑、隆起的菌落，菌落颜色呈白色，直径小于1mm。在普通肉汤中生长缓慢，管底有极少量白色沉淀，轻摇后即消散，肉汤不浑浊。经革兰氏染色后镜检，诱导后的金黄色葡萄球菌呈紫色，菌体圆形，葡萄串状排列，排列致密。

同期传代培养未经诱导的金黄色葡萄球菌：于37℃生化培养箱培养24h后，琼脂平板培养、营养肉汤培养和革兰氏染色镜检均与诱导前金黄色葡萄球菌形态无明显差异。4.4　体内耐药性实验结果

实验组A兔腹腔注射高度耐药金黄色葡萄球菌后4～5d拒食，便软，不愿动，逐渐消瘦，于第7d死亡。对照组B兔腹腔注射未经诱导的金黄色葡萄球菌后未死亡，于第10d人为处死。

剖检A兔，发现其凝血不良，心包、胸腔均有积液，心、肺充血严重，肺表面有明显出血性病灶；肝脏体积增大，淤血，色暗红；肾脏体积轻微增大，色暗红；腹腔淋巴结肿大。剖检B兔未发现异常。

分别取A、B兔心血和脾组织进行涂片，革兰染色后镜检，结果从A兔病理组织中检出金黄色葡萄球菌；B兔组织中未检出。5　讨论

庆大霉素和氨苄西林钠为临床常用药，对革兰氏阳性菌具有一定的抗菌作用。本试验通过对金黄色葡萄球菌短期内是否会对庆大霉素、氨苄西林钠产生稳定的耐药性进行了探讨。

由诱导耐药性实验结果可以看出，在氨苄西林钠、庆大霉素药物压力条件下，金黄色葡萄球菌在短期内就能迅速被诱导产生耐药性，氨苄西林钠和庆大霉素的MIC分别增加了16384倍和8192倍。且在经诱导性耐药菌株的稳定性试验获得稳定耐药菌株后，在无药物压力的条件下进行细菌培养实验发现，诱导后的耐药金黄色葡萄球菌生长缓慢，倍增时间延长；其与文献报道[6]结果描述的耐药菌株的MIC值与其生长速率呈负相关，即细菌获得的耐药性越强，生长越缓慢现实相符。通过镜检各组金黄色葡萄球菌，发现原菌株与连续传代培养的金黄色葡萄球菌形态上并无明显差异，初步排除了连续传代培养对金黄色葡萄球菌可导致耐药性产生的可能。动物体内耐药性试验结果表明了实验过程中注射正常剂量的药品对诱导后金黄色葡萄球菌无明显疗效，再一次证明金黄色葡萄球菌经诱导后已形成高度耐药菌。

该研究结果证实了金黄色葡萄球菌可在短期接触庆大霉素、氨苄西林钠这两种抗菌药物后产生耐药性变异，形成耐药菌株。因此，为了和减缓金黄色葡萄球菌耐药性的产生和发展，在临床抗感染治疗中应该遵循抗菌药物使用原则，合理使用抗菌药物[7]。为了防止耐药菌株的产生，应特别注意使用的治疗药物剂量要够，用药疗程要恰当。不要长期固定使用某一类或某几种药物，要有计划地分期、分批交替使用不同类或不同作用机理的抗菌药[8]。

此结果对于临床防治金黄色葡萄球菌感染具有一定的临床参考价值。6　结论

经过体外诱导金黄色葡萄球菌耐药试验，庆大霉素的MIC由4µg/mL增加到32768µg/mL，氨苄西林钠MIC由1µg/mL增加到16384µg/mL。本试验证实了用庆大霉素、氨苄（下转第199页）

201

www.sydkzz.com2019年2月下实验研究在第35min后加入乳酸使溶液里乳酸浓度为20 mM；④Lac-10组、Lac-20组和Lac-30组在第15min后均加入高钾缓冲液，在第35min后加入乳酸使溶液里乳酸浓度分别为10、20和30mM。各组实验总时长均为65min。1.6　统计学处理

应用SPSS 19.0统计软件分析数据，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，各组大鼠一般情况比较和各组组间比较采用两样本t检验，均以P<0.05为差异有统计学意义。2　结果

各实验组的大鼠体重和肌肉长度差异无统计学意义（P=0.736>0.05）。

高钾对照组肌力在第15-65min内呈缓慢下降趋势，至第35min下降至约20%，在第40-65min各时点较正常组显著降低（P<0.05）；乳酸对照组肌力在实验开始至第35min各时点均维持在50%以上，加入乳酸5min后呈下降趋势，在第55和第60min时点较正常组显著降低（P<0.05），见图1。

Lac-10、Lac-20和Lac-30组肌力在实验开始至第35min各时点较高钾对照组差异无统计学意义（P>0.05）；Lac-10组肌力在第40min至第65min呈持续下降趋势，各时点较高钾对照组差异无统计学意义（P>0.05）；Lac-20组肌力在加入20mM乳酸后10min内无明显下降趋势，在第45min显著高于高钾对照组（P<0.05），在第50min至第65min呈下降趋势各时点较高钾对照组差异无统计学意义（P>0.05）；Lac-30组肌力在加入30mM乳酸后10min内无明显下降趋势，在第40min至第60min各时点显著高于高钾对照组（P<0.05），见图2。3　讨论

自20世纪以来，人们普遍认为剧烈运动时骨骼肌产生的乳酸是导致运动性疲劳的主要因素。1978年Fabiato等人研究表明，肌肉中的乳酸可使兴奋-收缩脱偶联，从而降低骨骼肌的收缩能力。也有学者提出，”乳酸-酸中毒-肌疲劳”三者之间存在因果关系：肌肉生成乳酸，细胞内pH下降，肌肉的收缩效能下降。而近年来，有学者对乳酸与骨骼肌疲劳的关系提出新的观点：乳酸不是影响骨骼肌收缩的负面因素，反而对缓解骨骼肌疲劳有一定的积极作用，可以增强骨骼肌的收缩力。乳酸伴随运动产生，且随运动强度的增加而增加。它在运动性疲劳中，究竟是起促进作用还是抑制作用，目前还不明确。在现代体育竞技中，运动员的表现与骨骼肌运动性疲劳息息相关。故探讨乳酸是否能缓解疲劳骨骼肌收缩效能的降低趋势具有重要意义：为阐明乳酸对缓解骨

骼肌疲劳的机制以及为预防和治疗运动所致的骨骼肌疲劳提供实验依据。

研究结果（见图1）显示，高浓度K+可明显降低骨骼肌的收缩效能，导致骨骼肌疲劳。因此，本研究疲劳骨骼肌模型的制备具有一定的可行性。在剧烈运动后机体K+浓度升高，同时肌肉会通过无氧酵解产生乳酸，我们猜测后者并非是导致肌肉疲劳的因素，而是机体在运动性疲劳中产生的一种保护性物质，能使肌肉在疲劳的状态下（即收缩效能出现持续降低趋势）仍能保持收缩性能（即抑制收缩效能降低的趋势）。

如图1所示，乳酸对照组加入乳酸后对比正常组肌力下降幅度增大，在第55和第60min时点显著降低（P<0.05），说明乳酸会降低大鼠正常骨骼肌的收缩效能。这一点与传统的\"乳酸-酸中毒-肌疲劳\"观点相符。再如图2所示，加入乳酸后，Lac-20组的肌力在第45min显著高于高钾对照组（P<0.05），Lac-30组的肌力在第40min至第60min各时点显著高于高钾对照组（P<0.05），可看出乳酸浓度越高，抑制疲劳骨骼肌收缩效能降低的效果越明显。首先，由此可知乳酸在一定程度上能缩小高钾状态下骨骼肌收缩效能的下降幅度，符合我们提出的实验猜想。再者，有实验表明，在剧烈运动后，大鼠骨骼肌肌乳酸可超过30mM；人在高强度运动后，肌肉肌乳酸也可达25mM，即生理状态下乳酸可达到抑制疲劳骨骼肌收缩效能降低的有效浓度。以此我们推测，在人正常运动过程中，乳酸逐渐积累，对疲劳骨骼肌收缩效能的降低抑制越明显，而保证骨骼肌在疲劳时仍具有一定的收缩性。最后，结合上述结果分析，我们提出乳酸对骨骼肌的作用具有双重性：乳酸虽然可以降低正常骨骼肌的收缩效能，但也能抑制高钾引起的疲劳骨骼肌收缩效能的降低趋势。

综上所述，在运动过程中，乳酸和K+浓度升高到一定水平时，乳酸可以拮抗高钾导致的骨骼肌疲劳，这为运动员高强度运动后如何维持骨骼肌更好的收缩效能提供了理论依据。但其具体作用机制，需要进一步研究。

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（上接第201页）

西林钠诱导金黄色葡萄球菌的耐药性，短期内会使金黄色葡萄球菌产生稳定的耐药性，为临床用庆大霉素、氨苄西林钠治疗金黄色葡萄球菌病提供了一定的理论依据。

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