第24卷第4期 2012年7月 肝胆胰外科杂志 Journal of Hepatopancreatobiliary Surgery Vo1.24 No.4 Ju1.2012 ・实验研究・ TGF B,对脓毒症大鼠肝脏M D 2表达的影响 李楠,张或,邢静,方晓君 (大连医科大学第一附属医院急诊科,辽宁大连116011) 『摘要1目的建立大鼠脓毒症模型,观察不同时间点大鼠肝脏髓样分化蛋白2(Myeloid Diferential protein一 2,MD2)表达情况和NF—K B含量动态变化,并给予外源性TGF B 干预,探讨TGF B 对大鼠脓 毒症的作用及可能机制,为I临床脓毒症的治疗提供思路。方法健康雄性CL级SD大鼠120只随机分为三 组:对照组4O只,脓毒症模型组40只,TGF B,干预组40只。按2 h、6 h、12 h、24 h、48 h时间 点活杀大鼠取肝脏.HE染色光镜观察肝脏组织形态改变;用ELISA法检测肝脏组织匀浆上清液NF-K B 含量;1LT—PCR法检测肝脏MD2 mRNA的表达。结果模型组较对照组组织损伤严重,炎症细胞浸润 多,伴有出血;TGF B,组较对照组仍有炎细胞浸润,但较模型组炎症细胞浸润减少,损伤减轻;NF— K B在模型组(6 h、12 h、24 h、48 h)较对照组合量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05), 并且在24 h达到最高,48 h进入平台期。TGF B,组(6 h、12 h、24 h)较模型组含量减少,差异 有统计学意义(P<0.05);MD2 mRNA在在模型组(6 h、12 h、24 h、48 h)较对照组表达明 显增加,差异有统计学意义(P<0.05),并且在24 h表达达到最高,48 h进入平台期;TGF B.组(12 h、 24 h)与模型组比较表达减少,差异有统计学意义(P<0.05 o结论MD2 mRNA脓毒症时表达明 显增加,提示LPS信号转导增强。TGF B.可能通过抑制LPS的信号转导,减轻炎症反应。 『关键词1 脓毒症;转化生长因子B,;髓样分化蛋白;核因子Kappa B;内毒素;大鼠 『中图分类号1 R975+.5 『文献标识码1 A f文章编号1 1007—1954(2012)一0301・04 Research on the impact of TGF B l on liver MD2 expression in sepsis rats LI Nan,ZHANG Yu,XINGJing,etaL DepartmentoiEmergencv,the FirstAttiliatedHospitalotDah'an Medical Um'versitv,Dalian, Liaoning116011,China Objective To establish rat model of sepsis,observe the expression of rat liver mveloid differentiation protein一2(MD21 at different time points and the dynamic changes of the content of NF—k B and give exogenous TGF B, intervention,to explore the role and the possible mechanism of TGF B in rat sepsis mode1 for the treatment of sepsis. Methods One hundred and twenty healthy male SD rats were randomly divided into three groups.The sham group,the sepsis group and the TGF B,treated group(each group 40 rats).Rats were sacrificed at 2 h,6 h,12 h,24 h and 48 h and liver was taken out.The morphological changes of liver tissue stained with HE were observed under light microscope. The content of NK—K B in the tissue supernatant was detected with ELISA.The expression of liver MD2 mRNA was detected with RT—PCR method.Results The tissue damage of the model group was severer than that of the control group.The infiltration of the inflammatory cell was much more and accompanied with bleeding.Compared with the control group,there was still infiltration of the inflammatory cell in the TGF B,group,but the infiltration of the inflammatory cell and the tissue damage was milder than that of the model group.The content of NF—K B in the model group(6 h,12 h,24 h and 48 h)was obviously increased than that of the control one,and the diference was statistically significant(P<0.05),and the content at 24 hour was the highest,48 hour was arrived the platform stage.The content at 5 h,1 2 h and 24 h of the TGF B was reduced than that of the model group,and the difference had statistically significant fP<0.05).The expression of MD2 mRNA at 6 h,12 h,24 h and 48 h in the model group was dominantly increased than that in the control one.and the difference was statistically significant rJp<0.05).The expression at the 24 h was the highest,those at the 48 h entered into the platform stage.Compared with the model group,the expression at 1 2 h and 24 h in TGF B was reduced,the difference was statistically significant(P<0.05).Conclusion In septic 收稿日期:2012—03-15 基金项目:辽宁省教育厅高等学校科研项目(2009A205 o 作者简介:李楠(1 975-),女,辽宁大连人,副教授,博士生。 301—— 第24卷 肝胆胰外科杂志 第4期 model,expression of MD2 is significantly increased,suggesting that LPS signal transducfion enhanced.TGF 8 may inhibit LPS,reduce inflammatory reaction. IllIll衄sepsis;transforming gr。wth fact。r B,(TGF B );myel。id differentia1 pr。tein一2(MD2); nuclear factor Kappa B fNF K B);endotoxin;rats 脓毒症(sepsiS)发生率高,病情凶险,病死率 高。特别是由其导致的脓毒性休克(septic shock)及 多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction 于离心管中,一80℃冰箱保存。 1.2 MD2 mRNA测定 逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)法。肝脏组 织的裂解,肝脏组织总RNA的提取,cDNA第一链合 成(逆转录RT)及PCR扩增,RT-PCR产物凝胶电 泳分析。 1.3 NF—K B检测 syndrome,MODS)已成为危重患者的主要死亡原因 之一。目前认为,由脂多糖(1ip叩olvsaccharide,LPS) 介导的Toll样受体4(Toll—like receptor 4,TLR4)/ 髓样分化蛋白2(myeloid differential protein 2, MD2)信号通路参与脓毒症的发生。其主要的信号分 子通过核因子Kappa B(NF-K B)、丝裂原活化 蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇(PI3K)活化产生, 并使机体产生免疫应答”]。NF—K B的活化促进各种 炎症因子的释放,产生炎症瀑布效应,使全身炎症反 应失控 1,发展成SIRS,甚至MODS。许多研究表 明转化生长因子13(transforming growth factor B,TGF B)参与调节脓毒症炎症反应,减少前炎症因子释 ELISA法。 1.4肝脏组织形态 光镜下观察。 1.5统计学方法 CurveExpert 1_3软件拟合ELISA标准曲线,并计 算回归方程,统计各孔浓度。统计分析应用SPSS11.0 统计软件包进行,各组数据均以f ±s)表示。多组均 数比较采用单因素方差分析(One—wav ANOVA),各 组间两两比较采用成组设计的两样本均数检验 (Independent Sample T—test o采用SPSS 1 1.0统计软件 放,对机体有抗炎症反应过度的作用 1。病理状态 下,肠道中存在的大量革兰氏阴性菌产生内毒素可对 机体造成损害。而肝脏是清除内毒素的重要器官,也 是首先遭到攻击的器官。本实验通过大鼠盲肠结扎穿 孑L(CLP)制备脓毒症模型I引,测定不同时间点脓 毒症大鼠MD2 mRNA表达情况,观察肝脏TLR4/ 分析,Jp<O.05为差异有统计学意义。 2结果 2.1肝脏病理切片观察 MD2信号通路活化情况,及下游主要活化底物NF— K B的含量,同时给予外源性TGF B 干预,探讨 TGF 13.在脓毒症的信号传导通路中的作用及可能机 制,以期为临床治疗脓毒症提供思路和策略。 1对象和方法 1.1 动物分组与模型复制 对照组大鼠各时间点肝脏组织结构未见明显异 常;模型组较对照组组织损伤严重,炎症细胞浸润 多,伴有出血改变。TGF 13,组病理改变明显减轻, 仍与正常组有差别。较模型组炎症细胞浸润减少,损 伤减轻。 2.2 NP-KB检测结果 表1列出了肝脏中NF—K B在不同组不同时间点 健康雄性CL级SD大鼠120只,体重220~250 g, 随机编号分为3组。对照组(假手术组)40只:腹正 的含量,其中对照组各时间点之间方差分析无差异 (19>0.05),NF—KB含量无明显变化。模型组肝脏 组织中NF—KB的浓度从6 h起较对照的浓度明显增 中线做2 cm的切口暴露盲肠,翻动后还纳、关腹。模 型组(脓毒症模型组)40只:建立盲肠结扎穿孔模型 (CLP模型),于CLP模型后0.5 h尾静脉注射生理盐 水1 mL/250 g。TGF 8,组(TGF B 干预组)40 只:建立盲肠结扎穿孔模型(CLP模型),于CLP模 型后0.5 h尾静脉注射TGF 13 120 ng/mL/250 g。各 组在造膜或假手术后2 h、6 h、12 h、24 h、48 h 5 加,并在24 h达到最高,48 h进入平台期,24 h与 48 h之间无明显差异(19>0.05)。对照组与模型组 肝脏组织中NF—K B的浓度比较,在6 h、1 2 h、 24 h、48 h时间点含量增加,差异有统计学意义(尸 <O.O5 o TGF 13,组与模型组NF—K B的浓度检测结 果比较,在6 h、12 h、24 h时间点含量减少,差异 有统计学意义(P<0.05)。 个时间点各随机活杀5只大鼠,无菌条件取肝脏存放 一302一 注:TGF B 组与模型组同一间点NF-K B浓度比较, 尸<O05;模型组与对照组同一间点NF— B浓度比较, P<O.05 2.3 MD2 mRNA表达水平结果 表2列出了肝脏中MD2 mRNA在不同组不同时 问点的表达水平,其中对照组有少量表达,各时间点 之间方差分析无差异(尸>0.05),MD2 mRNA表达 与48 h之间无差异(P>0.05)。在6 h、12 h、24 h、 48 h时间点模型组较对照组MD2 mRNA表达水平增 加,差异有统计学意义(JD<0.05)。与模型组比较, TGF 13 组在12 h、24 h时间点MD2 mRNA表达水平 水平无明显变化。模型组在6 h表达开始明显增 加,并在24 h达到最高,48 h进入平台期,24 h 表2各组不同时间点MD2 mRNA平均光密度比值 ±s) 下降,差异有统计学意义,2 h、6h、48 h组之间MD2 mRNA表达水平无统计学差异(P>0.05)。 滓:TGF B,组与模型组同 时间点MD2mRNA表达水平比较, 足005;模型组与对照组同一间点MD2mRNA表达水平比较, P<O.05 3讨论 本实验通过建立大鼠CLP脓毒症模型,观察脓 毒症状态下MD2 mRNA、NF—K B的动态表达情况; 同时给予外源性TGF B 干预,以MD2 mRNA、NF- 脓毒症是当前临床医师所面临的棘手难题,是 危重患者的主要死亡原因之一。近年来,对感染和脓 毒症的研究已成为危重病医学中十分活跃的领域之 一K B及组织病理为观察指标,探讨TGF p 对脓毒 症的作用及可能机制。从病理切片可以看出,模型组 比对照组炎症细胞浸润明显,伴有出血,组织损伤 。近年来对细菌感染,机体免疫反应和脓毒症三者 之间“交互对话”的认识主要从信号转导途径人手。 细菌/LPS的刺激后,TLR4/MD2受体复合物接收该信 号刺激,引起下游炎症介质释放,也启动了抗炎系 统。1999年Shimazu等 l最先报道了MD2的氨基酸序 重。TGF B 组也有炎症细胞浸润,但是炎症细胞数 目少,浸润较轻。进一步的检测表明,对照组有少量 的MD2 mRNA表达,而且方差分析结果显示各个时 列。他们发现MD2 n…v,与TLR4结合,锚定于细胞表面, 形成同源二聚体或更大的复合体,从而提供多个 TLR4结合位点,易化TLR4的铰链反应,由此导致了 更强的NF—K B激活。Pugin等 1发现,严重脓毒症 及脓毒症休克患者血浆(而不是正常血浆)对表达 TLR4的上皮细胞的LPS激活具有支持作用。正常血 问点之间没有差异,说明正常情况下即有少量的 MD2 mRNA表达。模型组MD2 mRNA的表达2 h就 开始增加,6 h、12 h、24 h、48 h组均与对照组有差 异。其在24 h组达到高峰,48 h组与24 h组没有差 异,认为MD2 mRNA的表达达到平台期。由于模型 组48 h大鼠死亡率高达100%,是否存在表达下降时 相(如72 h,96 h),本实验中未能测得。 浆中加入重组可溶性髓样分化蛋白2(sMD2),对上 皮细胞的LPS激活有允许作用,激活水平与脓毒症血 浆相当;可溶性sMD2缺失血浆则无此效应。因此认 本实验结果提示TGF B 可能具有抑制炎症反应 的生物学作用,检测MD2 mRNA的表达情况,在12 h、 24 h组与模型组有差异(P<0.05),但是2 h、6 h组没有统计学差异(尸>0.05),提示TCF 13,有一定 为MD2的基本功能就是与TLR4的胞外区结合,赋予 TLR4对LPS的反应性。TGF 13是目前经研究证实具 有免疫抑制功能的细胞因子,在先天性及获得性免疫 的起效时间,其具体机制目前还不清楚,需进一步深 入研究。TGF B 组12 h、24 h时间点的MD2 mRNA 中都发挥重要的作用 1。Ahmad等 的研究发现,发 生脓毒症时,TGF 13在脾巨噬细胞产生,并以旁分泌 的方式作用于T细胞,通过抑制IL一2 mRNA表达, 减少IL一2的产生。 一表达水平下降,而48 h却没有继续下降。部分研究 指出TGF B 可能参与促炎症反应过程。Wang等 研究发现角质细胞过表达TGF B 时导致伤口愈合延 303一 第24卷 肝胆胰外科杂志 第4期 迟。Garcia—Lazaro JF等 lOl研究发现在大鼠c反应蛋 白启动子下游表达活性TGF B 基因,得到不同表 参考文献 Coskun AK,Yigiter M,Oral A,et a1.The effects of montelukast on antioxidant enzymes and proinflammatory cytokines on the heart,liver,lungs,and kidneys in a rat model of cecal 达水平的TGF 13 ,发现TGF p.过表达能增加LPS 诱导的前炎症因子生成,呈剂量依赖性的使实验大 ligation and puncture—induced sepsis[J].ScientificWorld— Journal,201 1,7(1 1):1341—1356. 『21 鼠更容易进展为脓毒症休克。本实验中48 h组MD2 mRNA表达没有下降是否与TGF B.的远期促炎反应 有关,还需进一步研究。 NF—K B是多种促炎症基因高度转录的必需因 庄永敬,曹云飞,吴桂荣,等.缺血预处理对大鼠肝脏缺血/再 灌注早期核因子K B活性及细胞凋亡的影响….肝胆胰外科 杂志,2009,21(6):431-434. 『31 White M,Lawless MW,O’Dwyer MJ,et a1.Transforming 子,也是LPS/TLR4/MD2信号通路下游重要的激活 底物。本组研究检测NF—K B结果表明TGF B 组在 6 h、12 h、24 h与相应时间点的模型组有差异,说 1 growth factor beta—l and interleukin一1 7 gene transcription in peripheral blood mononuclear cells and the human response to infection[J].Cytokine,20l0,50(3):322—327. 明TGF 13.可以通过抑制TLR4/MD2信号通路,进 而抑制NF—K B的活化,进一步抑制各种炎症因子 的释放,发挥其抗炎症作用。与48 h组MD2 mRNA 表达无差异一样,NF—K B在TGF B 组48 h时间点 与模型组也无统计学差异(P>0.05),而且48 h组 【6] 『51 张萌,蒋龙元,周天恩,等.脓毒症大鼠肠黏膜免疫屏障功能 的变化叭中华急诊医学杂志,2010,19(3):264—268. Shimazu R,Akashi S,Ogata H,et a1.MD2,a molecule that confers lipopoly saccharide respon siveness on Toll—like receptor 4[J].Exp Med,1999,189(11):1777—1782. Pugin J,Stern-Voeffray S,Daubeuf B,et a1.Soluble MD2 activity in plasma from patients with severe sepsis and septic 死亡率高达100%,说明TGF B 的抗炎作用有限, 尤其是远期抗炎效应。 综上所述,MD2 mRNA在正常生理条件下可少 shock[J】.Blood,2004,104(1 3):4071—4079. tynn K,Tok D,Vatansever S,et a1.Levosimendan [7] Erbtup・-regulates transforming growth factor・-beta and smad signaling in the aorta in the early stage of sepsis[J].Ulus Travma Acil Cerrahi Derg,2010,16(4):293—299. 量表达,脓毒症时表达明显增加,提示LPS信号转导 增强。脓毒症大鼠模型组NF—K B含量增加,提示 炎症介质释放增加,炎症反应失控。外源性应用TGF B,后,使脓毒症大鼠肝脏MD2 mRNA表达减少, NF—K B含量减少,提示TGF B.可能通过抑制LPS 的信号转导,减轻炎症反应。但是TGF B 的抗炎症 [8] Ahmad S,Choudhry MA,Shankar R,et a1.Transforming growth factor—B negatively modulates T-cell responses in sepsis[J]. FEBS Lett,1997,402(3):213-218. 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(本文编辑:鲁翠涛,毛文明) (上接第300页) PEPCK mRNA的过度表达,进而抑制糖异生过度增 强,以达到控制血糖浓度的目的。由于梗阻性黄疸 时,影响血糖的因素众多且发生机制复杂,仍需进 一 K,Yamashita A,Mutoh K.Morphological changes in 【3] Taniguchithe endocrine and exocrine pancreas of rats after experimental obstructive jaundice[J].J Vet Med Sci,201l,73(2):16l一168. on DS,Ramnanan CJ,Grueter CA,et a1.Effects of insulin [4] Edgerton the metabolic control of hepatic glucOneOgenesis in vivo 步研究其分子机制。 [5] [J].Diabetes,2009,58(12):2766—2775. 参考文献 Isaksson B,Rippe C,Simonoska R,et a1.Obstructive jaundice results in increased liver expression of uncoupling protein 2 Inoue H,Ogawa Asakawa A,et a1.Role of hepatic STAT3 in brain-insulin action on hepatic glucoseproduction【J].Cell Metab,2006,3(4):267—275. 『6] 罗海峰.梗阻性黄疸对各脏器功能的影响及其防治….中国 医刊,201 l,46f41:11—15. and intact skeletal muscle glucose metabolism in the rat[J]. Scand J Gastroenterol,2002,37(1):104—1 l 1. 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