荧光光度分析法测定维生素B2的含量

引言

荧光分光光度法简介

有些物质，当用紫外光反射时，它稀释某种波长之后还可以升空出来各种颜色和强度相同的光；而当紫外光暂停反射后，这种光线也随之消失，这种光线称作荧光。荧光的波长比稀释的紫外光波长略长。

由于物质分子结构不同，所吸收的紫外光波长和发射的荧光波长也有所不同。利用物质的这个特性，可以对物质进行定性分析。同一种分子结构的物质，用同一种波长的紫外光照射，可发射相同波长的荧光；若该物质的浓度不同，所发射的荧光强度也不同，利用这个性质可以对物质进行定量分析。这种定量方法称为荧光分析法，简称荧光法。测量荧光的仪器有滤光片荧光计，滤光片―单色器荧光计和荧光分光光度计。荧光法的选择性好，灵敏度比紫外-可见分光光度法高2~3数量级，检出限低，可以达到10~12g／m1，线性范围宽。现在主要应用的是荧光分光光度计。【实验目的】

1.自学荧光光度法测量维生素b2的含量的基本原理和方法。2.熟识荧光光度计的结构及采用方法。【实验原理】

在经过紫外光或波长较短的可见光照射后，一些物质会发射出比入射光波长更长的荧光。在稀溶液中，荧光强度if与物质的浓度c有以下关系： if?2.303?i0?bc

当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系： if?kc

这种以测量荧光的强度和波长为基础的分析方法叫做荧光光度分析法。荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度，可成倍提高荧光强度。同时，提高仪器灵敏度，可提高荧光光度法的灵敏度。而吸收光度法，无论是提高激发光强度还是提高仪器灵敏度，入射光和出射光同时增大，其灵敏度不变。因此，荧光光度法比吸收光度法灵敏度高。 vb2(即为核黄素)在430～440nm蓝光反射下，收到绿色荧光，其峰值波长为535nm。vb2的荧光强度在ph6～7时，在ph=11时基本消失。

维生素b2（又叫核黄素，vb2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：

vb2易溶于水而不溶乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中平衡，光照极易水解，对热平衡。

维生素b2溶液在430～440nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535nm。维生素b2的荧光强度在ph=6～7时最强，在ph=11的碱性溶液中荧光消失，所以可以用荧光光度法测定维生素b2的含量。

维生素b2在碱性溶液中经光线反射可以出现水解而转变为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光弱的多，故测量维生素b2的荧光时溶液必须掌控在酸性范围内，且在贮藏条件下展开。

【仪器与试剂】1.仪器

荧光光度计；容量瓶(50、1000ml)；吸量管(5ml)；棕色试剂瓶；洗瓶2.试剂 vb2对照品；市售vb2片；1％hac溶液【实验步骤】 1.标准系列溶液的酿制

(1)10.0mg／lvb2标准溶液的配制

精确称取10.0mgvb2，将其熔化于少量的1％hac溶液中，迁移至1000ml容量瓶中，用1％hac溶液吸收至刻度，容器。该溶液应装于棕色试剂瓶中，复置阴凉处留存。 (2)标准系列溶液的配制

精确移取1.00ml，2.00ml，3.00ml，4.00ml和5.00ml的标准vb2溶液，分别重新加入5个整洁的50ml容量瓶中，用蒸馏水吸收至刻度，容器。 2.待测样品液的配制

挑市售vb2一片，用1％hac溶液熔化，定容变成1000ml，储藏于棕色试剂瓶中，复置阴凉处留存。 3.标准溶液的测定

打开仪器，预演。用蒸馏水并作空白，再分上样品室砌，拨打电源，阳入读数至“0”。用标准溶液中最淡的溶液，调节“满度”旋钮并使其荧光读数为八十刻度，用此做为荧光测量的基准；然后，从稀至淡的顺序分别测量系列标准溶液的荧光强度。 4.未知试样的测定

取待测样品液2.50ml放在50ml容量瓶中，用蒸馏水吸收至刻度，容器。用与测量标准溶液相同的条件，测量试样样品液的荧光强度，平行测量其荧光强度3次。 【数据记录和结果处理】 1.标准曲线绘制。管号123456

2.根据待测样品液的荧光强度，从标准曲线上求得样品液的浓度。样品编号i（荧光强度）样品液的浓度

123平均值vb2标准溶液（ml）012.03.04.05.0蒸馏水（ml）504948474645vb2浓度（mg/ml）00.00020.00040.00060.00080.001i（荧光强度）3.排序药片中vb2的含量：_____________mg／片。【注意事项】

1.在测量荧光强度时，最好用同一个荧光皿，以避免由于荧光皿之间的差异而引起的测量误差。

2.挑荧光皿时，手指拎居住棱角出来，切勿碰到光面，以免污染荧光皿，影响测量。【思考题】

1.荧光法对物质进行定性，定量的测定与紫外分光光度法的异同？2.荧光法测定过程中应注意哪些问题?

3.试表述荧光光度法比稀释光度法灵敏度低的原因?