实验8 植物组织中可溶性糖含量的测定(蒽酮比色法)

实验方案

一、 实验目的

通过实验，掌握测定萝卜品质的方法

（一） 萝卜外部形态的测定

1、 实验材料

取鲜样3个∕小区

直尺、蒸馏水、笔、记录本、吸水纸 2、 实验方法

．用自来水将各组萝卜洗净后，再用蒸馏水洗涤，擦干表面水分．每个小区取3个重复，用电子天平称量每株的鲜重，用直尺测量植株的茎长、茎粗、叶长，取平均值作为指标值

实验(二) 植物体内可溶性糖含量的测定（蒽酮法）

一、实验目的

了解蒽酮法测定可溶性糖含量的原理；掌握分光光度计的使用 二、实验原理

糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一，也是新陈代谢的主要原料和贮存物质。不同载培条件，不同成熟度都可以影响水果、蔬菜中糖类的含量。因此对水果、蔬菜中可溶性糖的测定，可以了解和鉴定水果、蔬菜品质的高低。

蒽酮比色定糖法是一个快速而方便的定糖方法，在强酸性条件下，蒽酮可以与游离的或多糖中存在的己糖、戊糖及己糖醛酸（还原性和非还原性）作用生成蓝绿色的糖醛衍生物，其颜色的深浅与糖的含量在一定范围内成正比。蒽酮也可以和其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。当存在含有较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。上述特定的糖类物质，反应较稳定。该法特点：灵敏度高，测定量少，快速方便。

三、材料、仪器及试剂

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1.材料：植物种子、白菜叶、柑桔

2.仪器：分光光度计；恒温水箱； 20ml具塞刻度试管（3支） 漏斗；100ml容量瓶；刻度试管；试管架；剪刀；研钵 3.试剂

（1）200μg/ml标准葡萄糖：AR级葡萄糖100mg，蒸馏水溶解，定容至500ml。

（2）蒽酮试剂：1g蒽酮，用乙酸乙酯溶解，定容至50ml，棕色瓶避光处贮藏； （3）浓硫酸 四、实验方法

1.葡萄糖标准曲线的制作

取6支20ml具寒试管，编号，按下表数据配制一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液。在每管中均加入0.5ml蒽酮试剂，再缓慢地加入5ml浓H2SO4，摇匀后，打开试管塞，置沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却至室温，在620nm波长下比色，测各管溶液的光密度值（OD），以标准葡萄糖含量为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线。 管 号 1 2 3 4 5 6 标准葡萄糖原液0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 (ml)(200μg/ml) 蒸 馏 水 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 葡萄糖含量（μg） 0 40 80 120 160 200 2.样品中可溶性糖的提取 称取1克白菜叶，剪碎，置于研钵中，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆，然后转入20ml刻度试管中，用10ml蒸馏水分次洗涤研钵，洗液一并转入刻度试管中。置沸水浴中加盖煮沸10分钟，冷却后过滤，滤液收集于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。 3.糖含量测定

用移液管吸收1ml提取液于20ml具塞刻度试管中，加1ml水和0.5ml蒽酮试剂。再缓慢加入5ml浓H2SO4（注意：浓硫酸遇水会产生大量的热！），盖上试管塞后，轻轻摇匀，再置沸水浴中10分钟（比色空白用2ml蒸馏水与0.5ml蒽酮试剂混合，并一同于沸水浴保温10分钟）。冷却至室温后，在波长620nm下比色，记录光密度值。查标准曲线上得知对应的葡萄糖含量（μg）。 五、结果计算

样品含糖量（g/100g鲜重）=查表所得糖含量（μg）×稀释倍数×100/样品重（g）×106 六、注意事项

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（1）加浓H2SO4时应缓慢加入，以免产生大量热量而爆沸，灼伤皮肤，如出现上述情况，应迅速用自来水冲洗。 （2）水浴加热时应打开试管塞。

实验（三） 维生素C的定量测定（2,6-二氯酚靛酚滴定法）

一、目的要求:

（1）学习并掌握定量测定维生素C的原理和方法。 （2）了解蔬菜、水果中维生素C含量情况。 二、实验原理:

维生素C是人类营养中最重要的维生素之一，缺少它时会产生坏血病，因此又称为抗坏血酸（ascorbic acid）。它对物质代谢的调节具有重要的作用。近年来，发现它还有增强机体对肿瘤的抵抗力，并具有化学致癌物的阻断作用。

维生素C是具有L系糖型的不饱和多羟基物，属于水溶性维生素。它分布很广，植物的绿色部分及许多水果（如橘子、苹果、草莓、山楂等）、蔬菜（黄瓜、洋白菜、西红柿等）中的含量更为丰富。 维生素c具有很强的还原性。它可分为还原性和脱氢型。金属铜和酶（抗坏血酸氧化酶）可以催化维生素C氧化为脱氢型。根据它具有还原性质可测定其金属含量。 还原型抗坏血酸能还原染料2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），本身则氧化为脱氢型。在酸性溶液中，2,6-二氯酚靛酚呈红色，还原后变为无色。因此，当用此染料滴定含有维生素C的酸性溶液时，维生素C尚未全部被氧化前，则滴下的染料立即被还原成无色。一旦溶液中的维生素C已全部被氧化时，则滴下的染料立即使溶液变成粉红色。所以，当溶液从无色变成微红色时即表示溶液中的维生素C刚刚全部被氧化，此时即为滴定终点。如无其它杂质干扰，样品提取液所还原的标准染料量与样品中所含还原型抗坏血酸量成正比。

本法用于测定还原型抗坏血酸，总抗坏血酸的量常用2,4-二硝基苯肼法和荧光分光光度法测定。

OCHOHOHHOCOCCl+ONOHH+CCCH OH2ClOHCl色)2，6－二氯酚靛酚(红还原型抗坏血酸OCOOHHOCOCCOClNO(蓝色)Cl+OClNHOHCCH OH2(无色）还原型2，6－二氯酚靛酚坏血酸 氧化型脱氢抗

三、试剂和器材: （一）试剂

2%草酸溶液: 草酸2g溶于100ml蒸馏水中。

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1%草酸溶液: 草酸1g溶于100ml蒸馏水中。

标准抗坏血酸溶液（1mg/ml）: 准确称取100mg纯抗坏血酸（应为洁白色，如变为黄色则不能用）溶于1%草酸溶液中，并稀释至100ml，贮于棕色瓶中，冷藏。最好临用前配制。

0.1% 2,6-二氯酚靛酚溶液: 250mg 2,6-二氯酚靛酚溶于150ml含有52mg NaHCO3的热水中，冷却后加水稀释至250ml，贮于棕色瓶中冷藏（4℃）约可保存一周。每次临用时，以标准抗坏血酸溶液标定。 （二）材料

辣椒、苹果、卷心菜等。 （三）器材

锥形瓶（100ml），组织捣碎器，吸量管（10ml），漏斗，滤纸，微量滴定管（5ml），容量瓶（100ml，250ml）。

四、操作方法: 1.提取

水洗干净整株新鲜蔬菜或整个新鲜水果，用纱布或吸水纸吸干表面水分。然后称取20g，加入20ml 2%草酸，用研钵研磨，四层纱布过滤，滤液备用。纱布可用少量2%草酸洗几次，合并滤液，滤液总体积定容至50ml。 2.标准液滴定

准确吸取标准抗坏血酸溶液1ml置100ml锥形瓶中，加9ml 1%草酸，用微量滴定管以0.1% 2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至淡红色，并保持15s不褪色，即达终点。由所用染料的体积计算出1ml染料相当于多少毫克抗坏血酸（取10ml 1%草酸作空白对照，按以上方法滴定）。 3.样品滴定

准确吸取滤液两份，每份10ml, 分别放入2个锥形瓶内，滴定方法同前。另取10ml 1%草酸作空白对照滴定。 4.计算

维生素C含量（mg/100g样品）＝(VA-VB)CT100DW

式中：VA为滴定样品所耗用的染料的平均毫升数；

VB为滴定空白对照所耗用的染料的平均毫升数； C为样品提取液的总毫升数；

D为滴定时所取的样品提取液毫升数；

T为1ml染料能氧化抗坏血酸毫克数（由操作二计算出）； W为待测样品的重量（g）。 五、注意事项:

1.某些水果、蔬菜（如橘子、西红柿等）浆状物泡沫太多，可加数滴丁醇或辛醇。

2.整个操作过程要迅速，防止还原型抗坏血酸被氧化。滴定过程一般不超过2min。滴定所用的染料不应小于1ml或多于4ml，如果样品含维生素C太高或太低时，可酌情增减样液用量或改变提取液稀释度。

3.本实验必须在酸性条件下进行。在此条件下，干扰物反应进行得很慢。 4.2%草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用，而1%草酸无此作用。 5.干扰滴定因素有：

若提取液中色素很多时，滴定不易看出颜色变化，可用白陶土脱色，或加1ml氯仿，到达终点时，氯仿层呈现淡红色。

＋＋＋Fe2可还原二氯酚靛酚。对含有大量Fe2的样品可用8%乙酸溶液代替草酸溶液提取，此时Fe2不会很快与染料起作用。

样品中可能有其它杂质还原二氯酚靛酚，但反应速度均较抗坏血酸慢，因而滴定开始时，染料要

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迅速加入，而后尽可能一点一点地加入，并要不断地摇动三角瓶直至呈粉红色，于15s内不消退为终点。

6.提取的浆状物如不易过滤，亦可离心，留取上清液进行滴定。 六、思考题：

1．为了测得准确的维生素C含量，实验过程中都应注意哪些操作步骤？为什么？ 2．试简述维生素C的生理意义。

实验（四） 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G－250法）

一、目的

1.学习一种蛋白质染色测定的方法

2.掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法 二、原理

蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。

考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。2～5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。在0.01～1.0 mg蛋白质/ml范围内均可。该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测

定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。 三、器材与试剂 1.仪器

（1）分析天平；（2）具塞刻度试管10ml×8；（3）吸管 0.lml×I，lml×Z，5ml×I；（4）研钵；（5）漏斗；

（6）离心管10ml；（7）容量瓶10ml；（8）离心机；（9）721型分光光度计 2.试剂

（1）标准蛋白质溶液 称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成 100 pg／ml的原液。

（2）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂 称取100mg考马斯亮蓝G－250，溶于50ml 90％乙醇中，加入 85％（m／v）的磷酸 100ml，最后用蒸馏水定容到 1000ml。

此溶液在常温下可放置一个月。 3.材料 植物种子

四、操作步骤

1.标准曲线的制作 取6支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。

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操作项目 标准蛋白质溶液(ml) 蒸馏水(ml) G-250试剂(ml) 蛋白质含量（μg） 管 号 1 2 3 4 5 6 0 0.2 0.4 0. 6 0.8 1.0 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 各5 0 20 40 60 80 100 盖上塞子，摇匀。放置2min后在595 nm波长下比色测定（比色应在 l h内完成）。以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。 2.样品中蛋白质含量的测定

（1）准确称取约200mg绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入5ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆，离心（4000r／min，10min），将上清液倒入10ml容量瓶，再向残渣中加入2ml蒸馏水，悬浮后再离心10min，合并上清液，定至刻度。

（2）另取1支具塞试管，准确加入0.l ml样品提取液，再加入0.9 ml蒸馏水，5ml考马斯亮蓝G－250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线1号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。 3.结果处理

根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（μg），按下式计算： 样品蛋白质含量（μg／g鲜重）＝（查得的蛋白质含量（μg）×提取液总体积（ml））／（样品鲜重（g）×测定时取用提取液的体积（ml））

六、注意事项

1.由于染料本身的两种颜色形式的光谱有重叠，试剂背景值会因与蛋白质结合的染料增加而不断降低，因而当蛋白质浓度较大时，标准曲线稍有弯曲，但直线弯曲程度很轻，不致影响测定

2.测定工作应在蛋白质染料混合后2min开始，力争1hr内完成，否则会因蛋白质一染料复合物发生凝集沉淀而影响测定结果。

3.样品中的Tris、乙酸、2-巯基乙醇、EDTA等物质对实验结果有少量颜色干扰，可以在做标准曲线时可以用缓冲液代替蒸馏水，就可以将干扰扣除，

（五）有机酸含量的测定

一、实验目的

1.掌握强碱滴定弱酸的基本原理和指示剂的选择； 2.学会有机酸含量的测定方法； 3.进一步熟练滴定操作技术。 二、实验原理

大多数有机酸是弱酸，如果某有机酸易溶于水，解离常数〉〉10-7，用标准碱可以直接测其含量，反应产物为强碱弱酸盐。本实验我们选用的有机酸是苯甲酸，其解离常数Ka为6.2×10-5，若CspKa≥10-8

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采用指示剂判断终点时,直接准确滴定某一元弱酸的可行性判据。Csp是计量点时体积计算被滴定物质的分析浓度。如果我们配制的苯甲酸浓度不是特别小，就可以用标准碱溶液直接测定其含量，计量点时反应产物为强碱弱酸盐，滴定突跃在碱性范围内，可以选用酚酞指示剂，滴定溶液由无色变为微红色即为终点。根据NaOH标准溶液的浓度c和消耗的体积V计算该有机酸的浓度：

三、主要试剂和仪器

0.1 mol·L-1NaOH溶液(上次实验标定好的).；酚酞指示剂(0.2%乙醇溶液)；有机酸试样。 电子天平；试剂瓶（带橡胶塞）；碱式滴定管(50mL)；锥形瓶(250mL)。 四、实验步骤

①准确称取苯甲酸试样0.24～0.30g三份于250mL锥形瓶 ②加20～30 mL水溶解（可以加热，但须等凉后再滴定） ③加入酚酞指示剂1～2滴

④用NaOH标准溶液滴定至溶液呈微红色，30s不褪色，即为终点。记下NaOH用量，平行滴定3次，计算有机酸质量分数w。 五、数据处理

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