论文定稿-曾艳红

重庆工商大学 生物工程 09级 生物班 曾燕红

指导教师 殷菲

摘要：2 型糖尿病主要发生于成年人,是一种常见的代谢性疾病，其主要的特点是胰岛素抵抗和胰腺β细胞功能下降或数量减少导致胰岛素分泌不足，是具有明显异质性的多因素、多基因遗传病,环境因素和遗传因素的共同作用促进了糖尿病的发生。由于胰腺β细胞在胰腺细胞中的比例很低，观察和定位胰腺β细胞是考察一些药物对β细胞数量和活力的影响具有十分重要的作用，本文利用免疫组织化学方法测定胰腺中胰岛β细胞。通过多实验条件和方法的反复摸索，我们成功的用免疫组化方法观察到胰岛β细胞，并用双标的方法进行了确定。

关键词：2型糖尿病，胰腺β细胞，免疫组织化学

Abstract: Type 2 diabetes mellitus occurs mainly in adults and is a metabolic disorder that is characterized by high blood glucose in the context of insulin resistance and relative insulin deficiency caused by decrease of pancreatic β cells mass or the increase of β cells apoptosis. Type 2 diabetes is a significant heterogeneity of multi-factor, multi-gene genetic diseases, environmental factors and genetic factors together contributed to the occurrence of diabetes. because the ratio of beta cell is really low in pancreatic cells, which is around 1%, so observation and identification is very important to revalue the effect of some compounds on pancreatic cells. In this study, we constructed a useful method to observe the pancreatic beta cells with immunohistochemistry staining. After tried again and again, we found pancreatic beta cells, which were made sure by double-staining with DAPI and antibody for insulin. We also analyzed the factors that interrupted this experiment.

Key words: Type 2 diabetes mellitus; pancreatic beta cells; Immunohistochemistry

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目录

1前言 .................................................................... 3

1.1 2型糖尿病的概述 .................................................. 3

1.1.1 2型糖尿病的发病人群 ......................................... 3 1.1.2 2型糖尿病的发病机制 ......................................... 3 1.2 2型糖尿病的研究进展 .............................................. 3

1.2.12型糖尿病的遗传学研究 ........................................ 3 1.2.2 2型糖尿病的治疗研究新进展 ................................... 4 1.3 2型糖尿病的其他治疗方法 .......................................... 6 1.4胰岛β细胞的研究 ................................................. 6

1.4.1胰岛β细胞功能评价的方法 .................................... 6 1.4.2胰岛β细胞功能评价的相关指数 ................................ 7 1.4.3用于评估胰岛素敏感性的相关指数 ............................... 8 1.5 本课题研究的主要内容 .............................................. 8 2实验部分 ................................................................ 9

2.1 主要材料 .......................................................... 9

2.1.1 实验动物 .................................................... 9 2.1.2 实验药品及试剂 .............................................. 9 2.1.3实验仪器和设备 .............................................. 10 2.2 实验原理 ......................................................... 10

2.2.1 免疫组化概念 ............................................... 10 2.2.2 免疫组化实验所用的组织和细胞标本 ........................... 11 2.2.3免疫组化实验所用的抗体 ...................................... 11 2.2.4免疫组化实验常用的染色方法 .................................. 11 2.3 常用试剂的配制 ................................................... 11

2.3.1 浓缩缓冲液TBS的配制（10×） ............................... 11 2.3.2多聚甲醛（PFA）的配制 ....................................... 11 2.3.3 DAPI 的配制 ............................................... 12 2.4 免疫组化实验操作步骤 ............................................. 12 3 实验结果与讨论 ........................................................ 13 3.1实验结果 ......................................................... 13 3.2讨论 ............................................................. 18 4结论与展望 ............................................................. 18

4.1结论 ............................................................. 18 4.2 展望 ............................................................. 19 参考文献 ................................................................ 19 致谢 .................................................................... 22

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1前言

1.1 2型糖尿病的概述

1.1.1 2型糖尿病的发病人群

2型糖尿病占糖尿病的95%以上，可发生在任何年龄，但多见于40岁以上的成年人。2型糖尿病起病缓慢且“三多一少”症状较轻，发病时多数体型肥胖或超重。诊断糖尿病时，常发现存在血管并发症，表现患者可能已有5~10年的病程。此间病人的胰岛β细胞还存在一定功能，口服降糖药可降糖。在没有特殊情况下不用胰岛素治疗，少数病人口服降糖药效果不佳时需加用胰岛素。2型糖尿病的主要病理生理改变了以胰岛素抵抗为主伴随胰岛素分泌不足到以胰岛素分泌不足为主伴随胰岛素抵抗。 1.1.2 2型糖尿病的发病机制

2型糖尿病的病因和发病机制非常复杂，至今还没有完全阐明。糖尿病并非单一的疾病，而是复合病因引起的综合征，它包括遗传及环境因素在内的多种因素都起到非常重要的作用。

2型糖尿病的发病机制被认为有以下四个原因：（1）肝糖生成增加；（2）肌肉葡萄糖摄取减少引发的胰岛素抵抗；（3）胰岛β细胞功能受损；（4）脂肪组织存在胰岛素抵抗，使脂肪细胞的脂解作用增强，游离脂肪酸（FFA）释放入血增多。

1.2 2型糖尿病的研究进展

1.2.1 2型糖尿病的遗传学研究

2型糖尿病的发病率持续上升，目前是全球死亡的首要原因。2型糖尿病是多因素疾病，其中风险因素作用较强的有性别、年龄、家族史、肥胖和缺乏运动。已知遗传因素是糖尿病的发病中的遗传学基础，随后确定了2型糖尿病的特异基因。这些遗传学研究发现提示遗传基因可以用来推测2型糖尿病的遗传易感性，从而可以用于糖尿病的预测、预防和早期判断。 （1）单基因2型糖尿病

运用经典的定位克隆和候选基因方法成功的确定了单基因糖尿病基因[1]。大多数单基因糖尿病病因是β细胞基因，导致β细胞功能异常，而非胰岛素抵抗。同时治病基因的确定也导致某些临床亚型的发现。青年发病成年型糖尿病是常非胰岛素依赖、染色体显性遗传的早发型糖尿病，目前发现至少有8个亚型，相关的基因包括CEL（<1%）、NeuroD1（1%）、HNF1A(6%)、未知基因（11%）和GCK（占22%）[2-7]。确定新生儿糖尿病（NDM）有三种亚型，包括胰腺发育不良和症状型（10%）、暂时型（TNDM，45%）和永久型（PNDM，

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45%）。出了青年发病成年型糖尿病，对其他类型的单基因糖尿病的研究也有了一定的进展，其中CEL基因是家族性糖尿病的罕见原因[8]。 (2)多基因2型糖尿病

单基因糖尿病只占糖尿病的小部分，而大多数患者表现为常见典型的2型糖尿病。大量证据提示2型糖尿病的个体易感性是由多位点遗传变异及一系列环境因素共同决定的，寻找常见的2型糖尿病的特异基因变异的难度较单基因糖尿病要大。近几年在这方面的研究取得了显著进展，大规模的相关研究和应用全基因组相关研究确定了17个2型糖尿病易感性变异[9,10]。其中大多数易感性变异影响了β细胞的功能或功能团，有中度影响的多基因决定了个体遗传易感性，但对个体的预测作用却有限。由于研究的人群基因型测定误差、种族背景复杂等有可能得出相关的令人惊喜的结果，因此必须进行重复基因型测定及在不同人群中证实，才可以认为是成因变异。在过去几年里，研究者们在糖尿病的遗传学研究中取得了长足进展，所采取的基因组筛查方法也将有助于进一步探索2型糖尿病的发病机制。

1.2.2 2型糖尿病的治疗研究新进展

2型糖尿病常常是直到出现并发症才得以确诊，大约三分之一的患者可能没有被发现。虽然还没有决定性证据表明，针对无症状人群进行大规模的筛查仪早期发现糖尿病前期和糖尿病的效果如何，然而，早期筛查还是非常有必要的。糖尿病前期和糖尿病都是常见病并且发病率逐渐上升。这都给公共卫生系统带来了很大负担。2型糖尿病在确诊之前一般要经历长期的无症状阶段。另外，高血糖持续时间长短是相关不良预后的强预测因子，目前有一些有效的干预措施用来预防糖尿病前期进展为糖尿病，从而降低糖尿病并发症风险[11]。

到目前为止许多降糖药物大多都是初始降糖作用不错，但由于β细胞功能障碍很难维持。但却伴随常见的副作用——低血糖、潜在的心血管风险、消化道不适、体重增加和周围水肿。因此，新的治疗方法只能平稳控制血糖，逆转或阻止β细胞功能衰竭，帮助减轻体重，促进胰岛素作用，有益于心血管系统，同时避免低血糖。目前，对于2型糖尿病的治疗药物研究已经有了新的进展。胰岛β细胞功能衰竭是2型糖尿病 治病机制的核心。在治疗药物的开发上，重点针对胰岛β细胞功能改善及再生的药物开辟了2型糖尿病治疗的新篇章。在2011年6月刚刚结束的第68届美国糖尿病学会年会期间，治疗2型糖尿病的新一类口服药物二肽基肽酶4（DPP-4）抑制剂再次成为被关注的焦点，其相关的医学继续教育会议也备受关注。DPP-4抑制剂反映了当前2型糖尿病治疗的新方向，即从单纯控制HbAIC向避免低血糖、改善β细胞功能和稳定控制血糖的目标前进。

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(1)肠促胰岛素与2型糖尿病

胰高血糖素样肽（GLP-1）主要有远端肠道的L细胞分泌。葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)主要有存在于近端肠道的K细胞分泌。GLP-1和GIP分泌后由DPP-4快速裂解从而失去生物学效应。GLP-1不仅可以促进β细胞葡萄糖依赖性地释放胰岛素，还可以通过葡萄糖依赖模式一直α细胞分泌胰高血糖素，从而一直肝脏葡萄糖产生。GIP可促进β细胞葡萄糖依赖性地释放胰岛素，即此种促进胰岛素释放的作用在血糖水平升高时非常明显，而血糖水平恢复正常时则消失。

(2) GLP-1和GIP与2型糖尿病

在健康个体中，大约60%~70%餐后胰岛素分泌反应（肠促胰岛效应）与GLP-1和GIP相关。2型糖尿病患者肠促胰岛效应仍然存在，但与健康个体相比有明显的降低，尤其是GLP-1的分泌水平显著下降。

(3)胰岛素及其类似物在2型糖尿病治疗中的应用

胰岛素临床上按其作用时间长短分为：长效胰岛素；中效胰岛素，代表药物为诺和灵N；短效胰岛素，代表药物为胰岛素注射液、诺和灵R。以上药物除普通胰岛素可以静脉使用外，其他均为餐前30分钟皮下注射。由于有些患者使用胰岛素后会出现胰岛素过敏、体质增加和血糖波动大等不良反应，并且不能真正模拟人体生理性胰岛素的分泌模式，科学家研发出胰岛素类似物，为糖尿病的治疗提供了新的选择[12]。

胰岛素类似物是通过对肽链修饰，改变其细化和生物学特征，可模拟正常胰岛素的分泌模式，且结构相似，更适合人体生理需要。现在，用于临床的有预混门冬30胰岛素、赖脯胰岛素、甘精胰岛素、门冬胰岛素和地特胰岛素等。

赖脯胰岛素和门冬胰岛素具有与INS类似的生物效应，不易于INS抗体结合的特性，这就避免了抗体引起INS耐药，适用于各型糖尿病患者。这两种速效胰岛素类似物注射后由于较快解聚所以起作用持续时间短、效较快、达峰早，并且能在餐前即刻注射，这就很好地模拟餐后胰岛素的分泌模式，与餐前30分钟注射的常桂荣胰岛素相比，控制餐后血糖效果更好；而且由于其作用持续时间的缩短，显著减少了低血糖的发生率。同时，注射时间的灵活性也明显改善了患者的依从性，能使患者获得接近正常的血糖控制，延迟并发症的发生和进展[13]。

地特胰岛素和甘精胰岛素的皮下注射后作用可持续24小时，且没有谷峰浓度变化，使用方便安全，可作为基础胰岛素使用，同时也可与其他降糖药联合使用。于学静等[14]应用甘精胰岛素联合口服药物治疗2型糖尿病肥胖患者20例，对照组20例采取诺和灵30R治疗方案。观察12周后，有研究认为该类药与IGF21有一定亲和力，所以不适用于儿童

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及孕妇。

预混门冬30胰岛素其分泌模式接近人生理状态，早晚餐前皮下注射。如果午餐后血糖控制不佳，可用于午餐前加服双胍类或葡萄糖苷酶抑制剂。有研究证实，预混门冬30每天三次餐前即刻皮下注射，与基础加餐时胰岛素注射强化方案比较，也有降低餐前喝餐后血糖的作用。

(4)磺酰脲类药物与2型糖尿病

磺酰脲类药物作用强，起效快，作用维持时间短，导致低血糖的可能性减少。通过刺激胰岛β细胞，使胰岛素分泌增加，适用于胰岛β细胞功能尚未完全丧失的患者。

1.3 2型糖尿病的其他治疗方法

糖尿病发病早期，胰岛β细胞功能损害是可逆的，因此改善早期胰岛素分泌缺陷，保护胰岛功能就成了延缓糖尿病的展的重点[15,16]。糖尿病并发症及控制实验（DCCT）[17]和英国糖尿病前瞻性研究（UKPDS）[18]研究均表明控制血糖使之达到理想水平是减少和预防糖尿病的各种并发症的重要措施，而胰岛素是糖尿病治疗中的重要手段，因此对于2型糖尿病患者强化治疗使血糖控制达标具有重要意义。

有研究表明，多次胰岛素皮下注射者与胰岛素泵两种治疗方法均能有效控制上围胰岛素治疗的2型糖尿病患者的血糖，促进短期血糖达标。但胰岛素泵治疗在缩小血糖波动和整体血糖控制方面比多次胰岛素皮下注射治疗更为显著。并能够缩短血糖达标时间，减少胰岛素用量和降低低血糖的发生率。同时，该研究还显示，用胰岛素泵强化治疗2型糖尿病能显著锁定降糖病程、及时纠正高血糖，获得良好的血糖控制水平，同时改善胰岛细胞功能，有利于血糖长期稳定控制，从而减少并发症的发生。

1.4 胰岛β细胞的研究

1.4.1 胰岛β细胞功能评价的方法

胰岛β细胞功能是指胰岛素脉冲样分泌以及对各种刺激物引起的胰岛素释放或分泌反应以及分泌其他多肽的能力。检测胰岛β细胞功能有很多方法,包括胰岛β细胞分泌刺激试验和胰岛素脉冲样分泌模式的检测。人体中的胰岛素分泌呈脉冲式分泌模式,胰岛素的脉冲分泌包含两个组分: (1) 快速脉冲模式:振幅小,周期短,为5～10 min,在慢速脉冲基础上出现,主要抑制肝糖输出；(2) 慢速脉冲模式:振幅大,周期长,为50～120 min,主要介导外周组织对葡萄糖的利用 [19]。脉冲式的分泌模式对胰岛素发挥正常的降糖作用意义重大，总量相等的胰岛素,当以脉冲式分泌时,其降糖效率与持续恒速分泌相比提高了30 %。2型糖尿病患者的脉冲式胰岛素分泌,其频率未变,但振幅降低[20]，

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动物实验也证明β细胞数量减少能引起脉冲振幅降低,但其周期和规律仍正常[21]。2型糖尿病患者的胰岛素脉冲规律性与正常人相比有明显下降,胰岛素敏感性下降与胰岛素分泌规律减弱呈正相关。由此可见,胰岛素快速脉冲分泌的检测有助于β细胞损伤及其相关疾病的早期发现和诊断,胰岛素脉冲周期改变可能是2型糖尿病的预测因子。体内试验往往采用静脉输注葡萄糖、持续小肠营养或混合餐给予机体一定的能量负荷,10～30 分钟从外周静脉置管或门静脉置管取血1 次,测定相应时刻的C肽浓度、血糖、胰岛素,连续观察18～48 小时。

β细胞功能检测方法各有特点,选择合适的方法是正确评估β细胞功能的前提。目前国内外的研究显示,胰岛素脉冲样分泌的测定、高葡萄糖钳夹技术是评估β细胞功能敏感性最高的试验,其他试验的敏感性由低到高依次为胰高血糖素试验、精氨酸试验、OGTT。由于各种β细胞功能试验方法在检测β细胞功能损伤的敏感性方面存在差异,所以在糖代谢异常的不同临床阶段,并不是所有的试验方法都会得到与病程一致的结果。当方法选用不适时,常会造成低估或高估。

大量研究提示（1）正常糖调节阶段：高糖钳夹实验可发现潜在的β细胞功能减退，了解高危人群β细胞可能存在的潜在缺陷。(2)β细胞逐渐减退阶段：此阶段可出现胰岛素脉冲式分泌异常,可选用OGTT早期评价胰岛素分泌的指标。(3)糖尿病阶段：可将精氨酸试验及OGTT的两个时相胰岛素分泌反应的变化作为判断β细胞损伤程度或病情轻重的指标。β细胞衰竭阶段：多选择胰升糖素试验来判断其衰竭程度。 1.4.2 胰岛β细胞功能评价的相关指数

近几年运用用OGTT 5个时间点的C肽值、血糖及胰岛素，借助数学模型和数学软件，建立评估胰岛素敏感性和胰岛β细胞功能的指数成为研究者们正在努力研究的方向

[23,24]

。

(1)稳态模型胰岛素分泌指数(HOMA-B)

计算公式:HOMA-B=20×FINS/(FPG-3.5)，其中FINS 为空腹胰岛素, FPG为空腹血糖,

在胰岛β细胞功能评估中可以同时调整胰岛素敏感性影响而使结果更接近于真实情况。因为胰岛β细胞衰竭只有在葡萄糖负荷下才能充分暴露,而空腹状态只能部分地反映胰岛β细胞功能,因此该公式的缺点是容易高估胰岛β细胞功能,因此在使用中需予以注意[25]。

(2)早期相胰岛素分泌指数(△Ins30/△G30)

早期分泌相对于调节正常人葡萄糖代谢有重要作用，是β细胞功能受损的敏感指标。△Ins30/△G30= ( Ins30- Ins0) / (G30- G0 )，这个时间点所反映的早期相胰岛

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素分泌以第一相胰岛素分泌为主，但第二相胰岛素分泌也有部分贡献。这个指标在糖耐量减退阶段就发生改变，到糖尿病阶段则更加显著[26]。该指数可较好地反映早期胰岛素分泌功能[27] 。其存在的主要问题是评估时受胰岛素抵抗的干扰。

(3)李-Bennett胰岛β细胞功能指数

(MBCI) MBCI=(FPG×FINS)/( PG2h+ PG1h-2×FPG),其中FPG可用3.5 mmol/L，即MBCI=(FPG×FINS)/(PG2h+PG1h-7.0)，胰岛素分泌指数MBCI对血糖水平的贡献与△I30/△G30、AIR、HOMA-B等诸多胰岛素分泌指数对血糖变化贡献的总和相当。前瞻性研究资料显示在皮马印第安IGT 人群中, MBCI和AIR能预测糖尿病的发生,但HOMA-B不能有效地预测糖尿病的发生 [28]。 1.4.3 用于评估胰岛素敏感性的相关指数

(1)稳态模型评估胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）

HOMA-IR=FIns×FPG/22.5，其中FIns单位为mU/L,FPG单位为mmol/ L，HOMA-IR作为一种非侵入性评估胰岛素抵抗、简单可靠的方法被广泛应用于流行病学研究。而且在有大量样本存在的情况下,它与正糖钳夹结果密切相关，在糖尿病人群中其相关性亦存在

[29]

,适用于大样本的流行病学调查。 （2）线性最小模型(LMM)

在Bergman最小模型的基础上建立的线性最小模型(linear minimal

model,LMM),LMM 将糖尿病诊断与数学模型有机结合，测定OGTT 5个时间点的血糖和胰岛素,借助计算机评估胰岛素敏感性及分泌功能(LMM-ISI和LMM-BCI)。LMM 与△I0/△G0、Defronzo-ISI和HOMA等相关性均较好。

（3）OGTT中血糖曲线下面积

AUCG/AUCI是基于葡萄糖-胰岛素反馈环所建立的。在国内外临床特别是流行病学评估胰岛素抵抗的研究时常用的方法，由Himsworth等提出。但由于葡萄糖-胰岛素反馈的量效关系是呈函数关系，因此依据葡萄糖-胰岛素反馈关系建立AUCG/AUCI仍然不够准确。

以上是一些胰岛素敏感性指数，胰岛素敏感性的临床评估是非常复杂但却是非常重要的问题,目前仍没有一致的意见，人们也只是根据自己的认知去选择。整体而言目前HOMA的应用最为广泛, 胰岛素抵抗和胰岛素敏感性是两个概念，胰岛素抵抗则更偏向于描述胰岛素作用的发挥受到的阻碍，胰岛素敏感性偏向描述胰岛素的作用。

1.5 本课题研究的主要内容

随着2型糖尿病的发病率的急剧升高，不论其临床治疗还是相关的科学研究，胰岛

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β细胞功能评价都显得非常具有必要性，但由于胰岛β细胞有2个胰岛素分泌时相，存在时限和分泌量的变化，并且受胰岛素抵抗和糖负荷刺激的双重调节，以及对不同的刺激物反应不同，这些都决定了胰岛素分泌方式的复杂性。因此测定胰岛β细胞对于治疗2型糖尿病具有十分重要的意义。本研究初步探讨通过免疫组织化学方法测定胰腺中胰岛β细胞。从而为2型糖尿病的进一步研究奠定基础。而胰岛β细胞功能评价的方法及相关指数合理的应用，取长补短，才能给我们的2型糖尿病的临床科研工作带来更大的贡献。

2实验部分

2.1 主要材料

2.1.1 实验动物

取小鼠若干只（重庆医科大学实验动物中心提供）体重80~120 g,。动物单独饲养，室温20±2℃，12:12小时昼夜循环光照，自由进食、饮水。动物于实验前适应实验室环境1周。

2.1.2 实验药品及试剂

名 称

多聚甲醛(4%,PFA) 无水乙醇 15%蔗糖溶液 30%蔗糖溶液 OCT包埋剂 Tris Tris-HCl 氯化钠 10%驴血清 Anti-insulin Alexa

Fluro@555

donkey

生 产 商

天津大茂化学试剂厂

重庆川东化工（集团）有限公司 化

学试剂厂

成都科龙化工试剂厂 成都科龙化工试剂厂

Jung Tissue Freezing Medium 生工生物工程（上海）有限公司 生工生物工程（上海）有限公司

重庆川东化工集团有限公司

成都市科龙化工试剂厂

SC-9168 Santa Cruz Blotechnolgy

Eugene.OR.USA Sigma,D-9452 Sigma,F4680-25ML

anti-rabbit IgG(H+L)

DAPI

Fluromount封片剂

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2.1.3实验仪器和设备

名 称 电子天平 纯水机

酸度计（pH计）

型 号 FA1604s

DELTA320

生 产 商

上海天平仪器厂

美国Millipore公司

梅特勒-托利多仪器（上海）有

限公司

恒温干燥箱 冰箱 通风柜

平板加热磁力搅拌器

调速多用振荡器 Leica1850切片机 防脱载玻片（Poly-L-lysine）

CS101-1AB BCD-208A DFT CL—4A型

重庆银河试剂有限公司 青岛海尔股份有限公司 长海实验设备有限公司 郑州长城科工贸有限公司

HY-2 CM-1850 CAT.NO7150

金坛市晶波实验仪器厂

徕卡仪器有限公司

北京金麦克生物技术有限公

司

2.2 实验原理

2.2.1 免疫组化概念

免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAPI）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中

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凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 2.2.2 免疫组化实验所用的组织和细胞标本

免疫组化实验所用的主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。

其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。

2.2.3免疫组化实验所用的抗体

免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。

2.2.4免疫组化实验常用的染色方法

根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素—抗生物素染色法最常用。

2.3 常用试剂的配制

2.3.1 浓缩缓冲液TBS的配制（10×） Tris 29.92g Tris-Hcl 118.72g Nacl 180g

蒸馏水 定容至2000ml 调节pH=7.2-7.4

2.3.2多聚甲醛（PFA）的配制 (1) PB的配制

Na2HPO4•12H2O 87g NaH2PO4•2H2O 8.2g

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蒸馏水 定容至3000ml 调节pH=7.2-7.4 (2) 4%PFA的配制

PFA 120g

PB 定容至3000ml 2.3.3 DAPI 的配制

在荧光显微镜观察下，DAPI染剂是利用紫外光波长的光线激发。当DAPI与双股DNA结合时，最大吸收波长为358nm，最大发射波长为461nm，其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。DAPI也可以和RNA结合，但产生的荧光强度不及与DNA结合的结果，其发散光的波长范围约在400nm左右。

DAPI的发散光为蓝色，且DAPI和绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)或Texas Red染剂(红色荧光染剂)的发散波长，仅有少部分重叠，研究员可以善用这项特性在单一的样品上进行多重荧光染色。

DAPI能快速进入活细胞中与DNA结合，因此DAPI对生物体而言，也被视为一种毒性物质与致癌物。使用过程中应注意操作与抛弃的处理程序。 DAPI的配制方法

（1） 0.1mg DAPI 加入10ml双蒸水中，用微波仪充分溶解DAPI，可能需要几个小时。4℃可以保存6个月

（2） 在染色的当天，取100μl存储液，按照1:10的比例稀释到1000μl，此时的工作液浓度为1μg/ml。稀释液可以选用PBS。

（3） 可以按照浓度需要，加入不同量的存储液，从而配置出浓度不同的工作液。比如，500μl存储液加入500μl PBS就可以配成浓度为5μg/ml的工作液。

2.4 免疫组化实验操作步骤

（1）对小鼠脱颈处死

（2）打开腹腔，取脾脏下缘胰腺组织 （3）将胰腺组织置于4%PFA中过夜

（4）将胰腺组织置于15%蔗糖溶液 4小时 （5）将胰腺组织置于30%蔗糖溶液至沉底 4℃ （6）OCT 包埋，置于-20℃冰箱中冷冻备用

（7）取胰腺头部、中部、尾部切片，各切4片，4块组织/片，5μm/片，置于4℃冰箱中保存。

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（8） 取头部、中部、尾部各两片切片室温下风干 20分钟 （9） 65℃烤片1小时，切片自然冷却恢复至室温；

（10）TBS缓冲液冲洗 10分钟×3次 （11）10%驴血清 3小时

（封闭的作用是先封闭带电荷的部位，避免或减少非特异性染色的发生） （12） 加一抗（anti-insulin, 1:100 ） 4℃ 过夜 （13） 室温静置 40分钟 （14） TBS缓冲液冲洗 10分钟×3次 （15） 加二抗（驴抗兔/桃红色液体，Alexa@555,1:200） 3小时 （16） TBS缓冲液冲洗 10分钟×3次 （17） 加DAPI（1：200） 10分钟 （18） TBS缓冲液冲洗 10分钟×3次 （19） Fluromount封片 （20） 荧光显微镜下观察结果

3 实验结果与讨论

3.1实验结果

本实验主要是利用免疫组织化学方法测定胰腺中胰岛β细胞。并且通过多实验条件和方法的反复摸索，成功的用免疫组化方法观察到胰岛β细胞，并用双标的反复进行了确定。实验结果如图1、图2、图3、图4、图5、图6所示。

在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一样品存或同一细胞存，因此出现了免疫组织化学双重染色。本实验采用的是不同种属来源的抗体双重染色。不同种属来源的抗体双重染色，两种抗体间无交叉反应。特异性较高，即使细胞内抗原量很少也能检测。但是，当两种抗原存在于同一部位而其中之一浓度较高，占绝对优势时将妨碍另一种抗原染色，此种情况应分别染色，首先染色含量较少的抗原，再显示含量丰富的抗原。在该方法中应用最多的是把SABC法或SP法的实验流程重复两次，其中两种不同特异性抗体与一抗对应的不同种属生物素化二抗和两种不同显色系统。即可将不同部位或相同部位的两种抗原显示出来。该方法用于石蜡切片时应考虑所选择的两个抗体的修复方法应该一致或一个抗体的修复对另一个抗体的染色结果没有影响。

在进行双重染色之前，必须对所选择的一抗分别进行单独染色预实验，预实验条件必须与双染条件相同，在观察预实验结果和抗体定位正确后，再进行双染实验。

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1.如图1和图4所示，是insulin免疫着色结果。其中图1是200×下观察的结果，图4是400×下观察的结果。切片在TRITC（550-620nm）呈红色荧光。如图所示，胰岛主要存在于细胞浆中，呈团状结构，周围是背景染色。可以明显看到，胰岛颜色比背景颜色亮。

2.如图2和图5所示，是DAPI染色结果。其中图2是200×下观察的结果，图5是400×下观察的结果。实验时将切片置于荧光显微镜下用359nm激发光观察结果：DAPI染色呈蓝白色荧光。组织中的细胞核被染色。从图中可以观察到小鼠胰腺组织之细胞的细胞核核型完整，染色质均匀。

3.如图3和图6所示，是双标染色结果。其中图3是200×下观察的结果，图6是400×下观察的结果。从图中可以看到，胰岛组织中的细胞核部分没有被染色，而其他背景部分可以清楚地看到细胞核和胞浆组织。

如图所示，实验利用免疫组织化学方法测定胰腺中胰岛β细胞。并且通过多实验条件和方法的反复摸索，成功的用免疫组化方法观察到胰岛β细胞，并用双标的反复进行了确定。基本完成了实验目的。

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图1 正常小鼠 insulin 200× 箭头所指为小鼠的胰岛

图2 正常小鼠 DAPI 200× 箭头所指为小鼠的胰岛

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图3 正常小鼠 merged 200× 箭头所指为小鼠的胰岛

图4 正常小鼠 insulin 400× 箭头所指为小鼠的胰岛细胞

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图5 正常小鼠 DAPI 400× 箭头所指为小鼠的胰岛

图6 正常小鼠 merged 400× 箭头所指为小鼠的胰岛细胞

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3.2讨论

1.实验时第一次切片为10μm/片，实验结果发现只有DAPI染色而不见阳性染色。经查阅相关文献后分析可能是由于切片太厚，细胞膜没有破裂，而insulin是大分子物质，细胞膜没有破裂则insulin不能进入细胞染色，因此不见insulin染色。于是在第二次切片时，依据文献所记载取5μm/片。染色观察实验结果发现有阳性染色和DAPI染色。

2.实验过程中发现组织掉片严重，以至于到封片时载玻片上基本没有胰腺组织。在查阅相关文献和充分分析实验过程后，分析可能有以下几个原因：(1)胰腺组织本身比较弥散，组织之间交联度不够，再加上切片只有5μm厚度，使得组织在用TBS缓冲液清洗时容易掉片。(2)切片时，立即将切片放入4℃冰箱，切片没有充分风干，导致切片组织没有充分附着在防脱载玻片上，因此清洗时容易掉片。(3)从冰箱中取出切片时直接清洗，而没有经过风干，组织与载玻片的缝隙存在水分，组织与载玻片粘贴不牢，这使得清洗时容易掉片。（4）再次查阅文献后，分析可能是由于组织经过15%和30%的蔗糖溶液脱水后导致脱水严重，所以清洗时会掉片。

针对上述分析，有一下解决方法：(1)切片时，尽量保持每片组织充分展开，贴片时尽量时组织充分附着在载玻片上。(2)片切好后，先在室温下风干数小时后再置于冰箱中，实验前，取出切片，室温下风干40分钟或置于65℃恒温烤箱中烘烤1小时。(3)取材时不用15%和30%的蔗糖脱水而直接OCT包埋。

3.实验时观察结果时很难找到胰岛。由于胰腺β细胞在胰腺细胞中的比例很低，所以发现胰岛的概率就相对较低。并且在本实验中，胰腺组织切片时并不是取所有的组织，这就可能错过胰岛。再者，在实验过程中，掉片严重，也有可能胰岛已被冲洗掉，所以观察结果时找不到胰岛。

4结论与展望

4.1结论

本文研究发现在采用免疫组织化学测定胰腺中胰岛β细胞时，主要的难点就是如何防止胰岛组织掉片。另外，如果取胰腺的所有部分进行实验，则实验量将会很大，所需抗体量也很大，这将会花费大量的人力和物力。本实验虽然时间有限，但是还是观察到胰岛和胰岛β细胞。这就为以后研究胰岛β细胞的功能、胰岛素及其类似物的研究以及胰岛β细胞与2型糖尿病的关系提供了实验基础和方法借鉴，甚至将会把研究深入到京尼平苷调节INS-1细胞胰岛素分泌的分子机制等研究，从而将研究应用到2型糖尿病的临床治疗研究上，为2型糖尿病患者带来的福音。

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通过实验中采用不同的实验步骤发现，实验前将切片置于65℃的恒温箱中烘烤1小时，实验中掉片程度相对没有烘烤的条件下有所减轻。而对比用15%和30%蔗糖溶液脱水和没有脱水的切片发现，二者掉片程度相差不大，所以掉片与是否经过蔗糖脱水无直接关系。

4.2 展望

由于知识与时间有限，本次研究工作还不够深入，今后将借鉴本次论文的经验和教训，对免疫组织化学测定胰腺中胰岛β细胞做更进一步研究。同时研究也不仅限于测定胰岛β细胞，而是进一步研究京尼平苷对于β细胞凋亡的影响，为2型糖尿病的临床治疗研究提供实验方法和借鉴。

当然，实验中也存在一些不足：由于实验时间的，对于实验中组织掉片的问题依然没有得到解决，所以实验结果还不尽如人意；在切片时没有取到胰腺的所有组织，所以实验中没有找到更多的胰岛。

由于掉片严重，在每次实验中就会浪费大量的抗体，增加实验成本，因此，以后的实验可以先进行HE染色，经过观察结果，发现有胰岛后再对其进行免疫组织化学染色，这样目标更明确，就可以避免抗体的浪费，缩小实验成本。

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致谢

本次毕业实验是在指导老师殷菲老师、刘建辉老师和孔淑贞老师在课题设计、实验策略拟定、实验操作中给予的悉心指导和严格要求以及欧阳菱子同学在实验中给予的帮助下完成的。在实验过程中每一步成功都包含着老师们的帮助和教导，使我受益匪浅，并激励我在以后的学习工作中以踏实认真的态度去面对一切。在此，向我尊敬的殷老师、刘老师和孔老师致以深深的谢意。

衷心感谢天然药物中心的陈刚老师、高雪老师、郭莉霞老师、殷钟意老师、汪程远老师、蒋彦可老师和蒋和彦老师在实验操作和药品供应提供的诸多帮助和便利下，我完成了自己的毕业实验和论文。各位老师学识渊博、思路宽广、勇于创新，对科学洞察深刻，对学生孜孜不倦的教诲和激励，将使我铭记终生。在这个过程之中我将自己学到的知识和实践结合在了一起，许多实验技能也得到了完善。我还要深深感谢大学四年来授我以知识的各位老师，感谢他们四年来孜孜不倦的教育，从他们身上，我学到的不仅是专业知识，更多的是待人处世的方法方式。

最后，向所有给予过我支持和鼓励的老师、同学、朋友们致以我最衷心的感谢和良好的祝愿！衷心地感谢在百忙之中评阅论文和参加答辩的各位专家、教授！

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