５ ２０１１．４ｏｌ ｌ １：１—４． 巫热带粒 讲学 ；ｚ： Ｓｅｅｅ，ｃｅｅ 拟南芥春化相关基因ＶＲＮ２的克隆及其 植物表达载体的构建 张文惠，洪丽萍，曾碧玉 （福建省亚热带植物研究所福建省亚热带植物生理生化重点公共实验室，福建厦门３６１００６） 摘要：本文利用特异性引物，从拟南芥ＲＮＡ中提取春化相关基因ＶＲＮ２ ｃＤＮＡ序列，ＧｅｎＢａｎｋ登录号 ＡＹ０６３０４７。该基因序列大小为１ ３５４ ｂｐ，编码区为１ ３２３ ｂｐ，编码氨基酸４４１个。将克隆片段插入中间载体 ｐＢＰＦＯ ７，经ＰｓｔＩ酶切回收带有Ｐ３５Ｓ启动子和ｎｏｓ终止子片段，连接ｐＢＩ１２１载体，构建ＶＲＮ２基因的植物表 达载体。 关键词：春化相关基因；ＶＲＮ２；春化作用；拟南芥 Ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００９—７７９１．２０１１．０１．００１ 中图分类号：Ｑ８１２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９—７７９１（２０１１）０１—０００１—０４ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅ ＶＲＮ２ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ Ｐｌａｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ ｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＺＨＡＮＧ Ｗｅｎ—ｈｕｉ，ＨＯＮＧ Ｌｉ—ｐｉｎｇ，ＺＥＮＧ Ｂｉ—ｙｕ （Ｆｕｊｉａｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ Ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ Ｐｌｎｔａ，Ｆｕｊｉａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ Ｂｏｔａｎｙ，Ｘｉａｍｅｎ ３６１００６，Ｆｕｊｉａｎ Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｔｈｉｓ Ｐａｐｅｒ’ｔｈｅ ｖｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ．ｒｅｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ⅳ２ ｃＤＮＡ ｆｒｏｍ ＲＮＡ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｌ．．ＧｅｎｅＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＹ０６３０４７ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｌｏｎｅｄ．Ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ⅳ２ ｗａｓ １ ３５４ ｂｐ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｇｉｏｎ ｉｎ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｗａｓ １ ３２３ ｂＤ Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ Ⅳ２ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ４４ １ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．Ｔｈｅ ｃｌｏｎｅｄ ｃＤＮＡ ｏｆ ＲⅣ２ ｗａｓ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎｔｏ ａ ｍｉｄｄｌｅ ｖｅｃｔｏｒ ｐＢＰＦＯ ７． Ｔｈｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｐ３５Ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ｎｏｓ ｗｅｒｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ＰｓｔＩ，Ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ ｔｏ ｐＢＩ１２１ ｖｅｃｔｏｒ，ｇｉｖｉｎｇ ｐｌａｎｔ ｅｓｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ 州２ ｇｅｎｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｖｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ； Ⅳ２；ｖｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ 春化作用是低温需求型植物成花所必需的发育阶段，是此类植物从营养生长向生殖生长转换的关 键程序之一，也是低温诱导体内特异基因表达的过程 Ｊ，春化作用主要通过相关基因对ＦＬＣ表达的抑 制实现对其开花的促进。研究表明，拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）有５１个位点与开花有关，其中２７ 个位点与春化有关 Ｊ，与春化反应直接相关的５个基因是ＶＲＮ１、ＶＲＮ２、ＶＲＮ３、ＶＲＮ４和ＶＲＮ５。其中， 拟南芥ＶＲＮ２的主要作用是降低开花阻抑因子ＦＬＣ的ｍＲＮＡ水平，从而缩短开花所需低温处理的时间 和强度，促进开花。本试验以拟南芥为材料，通过克隆ＶＲＮ２基因和结构分析，并构建其植物表达载 体，拟将ＶＲＮ２基因转化蝴蝶兰，研究其在调节花期中的作用，为进一步探讨春化基因在植物成花途 径中的作用奠定基础。 ｌ材料与方法 １．１材料 １，１．１菌株及载体Ｅ ｃｏｌｉ ＤＨ５和载体ｐＢＰＦＯ７由厦门大学生命科学学院细胞与分子生物学实验室提 收稿日期：２０１０—０９—２９ 基金项目：福建省自然科学基金项目（２００７Ｊ０２５０）、福建省省属公益类科研院所基本科研专项（２００９Ｒ１０００５．４） 作者简介：张文惠（１９７２ ），女，内蒙古呼盟人，副研究员，博士，从事基因工程、植物抗逆性及遗传育种研究。 ２ 亚熬带槛纳讲学 第４Ｏ卷 供，ｐＭＤ１８一Ｔ载体及ｐＢＩ１２１载体购自ＴａＫａＲａ（大连宝生物公司）。 １．１．２主要试剂盒及试剂ＴＲＩＺＯＬ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＰｏｌｙＡＴｔｒａｃｔ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ和Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲｉｂｏＣｌｏｎｅ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ购自Ｐｒｏｍｅｇａ。Ｔａｑ ＤＮＡ聚合 酶、限制性内切酶ＥｃｏＲ Ｉ、ＢａｍＨ１ Ｉ、Ｈｉｎｄ口、ＤＬ一２０００ Ｍａｒｋｅｒ和ＲＮａｓｅ Ａ（ＴａＫａＲａ），Ｗｉｚａｒｄ Ｍ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ—ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ回收试剂盒（Ｐｒｏｍｅｇａ），氨苄青霉素（Ｓｉｇｍａ）；其他常用试剂均为国产分析纯。 １．１．３供试材料拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）厦门大学生命科学学院细胞与分子生物学实验室提供。 １．２方法 １．２．１ ＶＲＮ２基因扩增拟南芥处理：拟南芥种子在冰箱低温春化处理后，灭菌后播种于改良培养基中， ２５ ｃＣ光照培养箱中培养，取幼叶提取ＲＮＡ。 按照ＴＲＩＺＯＬＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ操作手册分离总ＲＮＡ，根据Ｇｅｎｅｂａｎｋ登录的 ＶＲＮ２（基因登录序列号ＡＹ０６３０４７）序列，设计特异引物： Ｐ １ ＧＣＧＧＱＴＣＣＧＡＡＣＡＡＧＡＡＴＧＴＧＴＡＧＧＣＡＧ； Ｐ２ ＧＧＴＣＴＡＧＡＴＦＡＣＴＦＧＴＣＴＣＴＧＣＴＧＴＩ＂ＡＴｒＧ 引物由上海生物工程公司合成。ＰＣＲ反应条件：９４℃５ｍｉｎ，９４ ｃｃ ３０ Ｓ，５９℃３０ Ｓ，７２℃１３０ Ｓ， ３２个循环后７２℃再延伸７ ｍｉｎ。酶切位点为ＢａｍＨＩ和ＸｂａＩ。 １．２．２鉴定及序列对比琼脂糖凝胶电泳回收ＰＣＲ扩增的目的条带，用ＢａｍＨＩ和ＸｂａＩ双酶切连接到 ｐＭＤ１８一Ｔ载体中，连接产物转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５，ＰＣＲ验证后将阳性克隆送往上海生物工程公司测序。使 用ＤＮＡＭＡＮ６．０分析核苷酸和氨基酸序列，在美国国家生物信息中心ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ． ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏＶ／）利用ＢｌａｓｔＮ和ＢｌａｓｔＸ工具进行搜索比对ｐＪ。 １．２．３ ＶＲＮ２基因植物表述载体的构建和鉴定用ＢａｍＨＩ和ＸｂａＩ双酶切带有ＶＲＮ２基因的ｐＭＤ１８一Ｔ质 粒，连接经ＢａｍＨＩ和ＸｂａＩ双酶切的中间载体ｐＢＰＦｏ７，构建重组质粒ｐＢＰＦ－ＶＲＮ２。用风Ⅱ单酶切ｐＢＰＦ－ ＶＲＮ２质粒，回收目的片段，再连人同样 Ⅱ单酶切的ｐＢＩ１２１载体，构建植物表达载体ｐＢＰＦ－ＶＲＮ２一 ｐＢＩ１２１，将其转化至Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５，提取质粒，进行ＰＣＲ及酶切鉴定并测序。 ２结果与分析 Ｍ １ ２ ２．１ ＶＲＮ２基因克隆及序列分析 以拟南芥总ＲＮＡ为模板进行ＲＴ－ＰＣＲ反应，扩增出 长约１ ３５４ ｂｐ的目的基因片段（图１），经ＤＮＡＭＡＮ６．０ 分析，其核苷酸序列与ＧｅｎｅＢａｎｋ中登录号为ＡＹ０６３０４７ 的ＶＲＮ２基因序列的一致性为９９％，经分段测序，不一致 的部分可能是误测，且不在编码区内，不影响基因的表达。 推导的氨基酸同源性为９８％，该基因序列全长大小为１ ３５４ ｂｐ，编码区为１ ３２３ ｂｐ，编码氨基酸４４１个。核苷酸 和推导的氨基酸序列如图２。 ２．２ ＶＲＮ２基因植物表达载体的ＰＣＲ和酶切检测 ２０００ｂｐ ｌＯ００ｂｐ ７５０ｂｐ ５００ｂｐ ２５０ｂｐ １００ｂｐ 图１ ＶＲＮ２基因的ＰＣＲ扩增 Ｍ．ＤＬ２０００；１．阴性对照：２．ＶＲＮ２基因的ｃＤＮＡ 用ＢａｍＨＩ和ＸｂａＩ双酶切植物表达载体 注 ｐＢＰＦ—ＶＲＮ２一ｐＢＩ１２１质粒，得到长１４ ７６５ ｂｐ的片段（包含 ｐＢＩ１２１载体１３ ｋｂ和Ｐ３５Ｓ启动子及终止子１ ７６５ ｂｐ），以及长约为１ ３５４ ｂｐ的ＶＲＮ２基因片段（图３）ｏ Ⅱ单酶切ｐＢＰＦ—ＶＲＮ２一ｐＢＩ１２１质粒，得到长约３１９９ ｂｐ的ｐＢＰＦ—ＶＲＮ２片段和１３ ｋｂ的ｐＢＩ１２１载体 片段（图３）ｏ植物表达载体ｐＢＰＦ—ＶＲＮ２一ｐＢＩ１２１质粒的ＰＣＲ鉴定结果如图３（用设计的特异引物扩增）， 酶切和ＰＣＲ结果表明：ＶＲＮ２基因成功连接到中间载体ｐＢＰＦＯ７和表达载体ｐＢＩ１２１上，经测序与前一 致，其植物表达载体构建图如图４。 第１期 张文惠，等：拟南芥春化相关基因ＶＲＮ２的克隆及其植物表达载体的构建 ＾个ＧＴｅ；Ｔ＾ＧＧｃＡ ＡＡＴ｜ｒ６Ｔｃ ＧｃＧＡＡＡ ＧＴＧＡ寸Ｔ ＡＡｅＴＣ￣ＡＴＧＡＧ ３ Ｍ ６１ ２１ Ｃ Ｒ ０ Ｎ Ｃ Ｒ Ａ Ｋ Ｓ ８ ｐ Ｅ Ｅ Ｖ Ｉ Ｓ Ｔ Ｄ Ｅ ＡＡＴＣＴＣＴＴＧＡＴＡＴＡＴＴＧＴ ＡＴＡＴＡＡＣＡＴＣＴＴＴＣＡＣＣＴＴＣＧＣＴＣＴＣＴＡ Ｎ Ｌ Ｌ 工 Ｙ Ｃ Ｋ Ｐ ｖ Ｒ Ｌ Ｙ Ｋ 工 Ｆ Ｈ Ｌ Ｒ Ｓ Ｉ， １２王 ４１ ＧＧＣＡＡＣＣＣＡＴＣＧＴＴ Ｇ ｐ Ｓ ＡＴ０ＣＴＴＧ＾ＡＣＴ＾ＣＡＡＡＡＴＴＧＧＧＣ；Ｃ ＡＡ ＳＣＣ－ＣＡ＾卫＾ＧＡ Ｌ Ｐ Ｒ ＴＡ Ｃ Ｌ 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３用性对照：Ｍ１．Ｄ１２０００；Ｍ２１５０００； ４．ＢａｍＨＩ和ＸｂａＩ酶切ｐＢＰＦ－ＶＲＮ２一ｐＢＩ１２１质粒； ５． Ⅱ酶切ｐＢＰＦ－ＶＲＮ２质粒； ６．阴性对照 图４植物表达载体ｐＢＰＦ－ＶＲＮ２一ｐＢＩ１２１ 质粒载体图 ４ 巫熬带槛纳钭 第４Ｏ卷 ３讨论 本研究在植物表达载体的构建中，从中间载体ｐＢＰＦＯ７中引入植物表达启动子Ｐ３５Ｓ和ｎｏｓ终止予， 以及一个０７增强子。增强子是基因表达的重要调节元件，能显著增强启动子的表达效率。同时构建载 体的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子与ＧＵＳ报告基因的融合体，在后期的农杆菌转化中，可以使农杆菌转入靶细胞 后，能通过ＧＵＳ瞬时表达系统在短时间（共培养３ ｄ）内检测出来。 植物春化作用是某些重要的基因在特定的条件下按照一定的时空顺序、不断解除阻遏而得到程序 性表达的结果【６ 川。ＶＲＮ２基因编码一个核定位蛋白，是一种转录因子，属于Ｐｌｏｙｃｏｍｂ蛋白家族，与 拟南芥的ＦＩＳ２、ＥＭＦ２蛋白和果蝇ｓｕ（ｚ）１２蛋白类似。ＶＲＮ２虽然不是低温负调控ＦＬＣ表达所必需的 因子，却能够维持ＦＬＣ低水平表达的稳定性ｆ１¨，ＶＲＮ１和ＶＲＮ２对于ＦＬＣ表达抑制的维持是通过对其 组蛋白Ｈ３的甲基化使其染色质异化来实现的。春化作用是个多基因协同控制，通过基因间的相互调节， 以染色质修饰改变的方式实现对ＦＣＬ转录的关闭，进而实现下游开花控制基因相应的开启和关闭。目 前有关春化作用的研究很多，其中春化途径中的关键基因ＦＬＣ的分离及其在春化中的表达方式为春化 的分子机理提供了新的信息，ＦＬＣ为拟南芥的开花抑制因子，在开花途径中起到变阻器作用，但对于 春化基因本身在开花途径中的作用机理及其相互之间的联系还有待于探索。本试验构建了春化基因 ＶＲＮ２的克隆和植物表达载体，并将其转化到植物中，对进一步研究春化基因对开花途径的调控具有重 要作用。 参考文献： 【１】种康，等．高等植物开化调控的分子基础［Ｍ］，／余叔文，等．植物生理与分子生物学．北京：科学出版社，１９９９：１－５． ｆ２］赵大中，等．植物春化作用的生理、遗传与分子基础研究［ＮＪ／／＃忠平．走向２１世纪的植物分子生物学．北京：科学出 版社，２０００：３０．３２． ［３］种康，等．植物春化作用及其相关过程的分子生物学研究进展［Ｊ】．植物学集刊，１９９４，７：２１—２８． ［４］ＬｅｖｙＹＹ ｅｔａ１．Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｉｔｏｎ ｏｆｆｌｏｗｉｎｇ￣］．Ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ，１９９８，１０（１２）：１ ９７３—１ ９９８． ［５】Ｒｅｎ Ｈ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｈｅｐｃｉｄｉｎ—ｌｉｋｅ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｃＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｊａｐａｎ ｓｅａ ｂａｓｓ，Ｌａｔｅｏｌａｂｒａｘ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ［Ｊ］．Ｆｉｓｈ Ｓｈｅｌｌｉｓｈ Ｉｍｍｕｎｏ１ｆ．，２００６，２ｌ（３）：２２１—２２７． ［６】谭克辉．春化过程中特异蛋白质合成【ＪＪ＿植物学集刊，１９９２，６：１３—１６． 【７】李振刚．分子遗传学【Ｍ】．北京：科学出版社，２０００：２０６—２２０． ［８】Ｍｉｃｈａｅｌｓ Ｓ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｌｏｓｓ ｏｆ ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＬＯＣＵＳ Ｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｅｌｉｍｉｎａｔｅ ｔｈｅ ｌａｔｅ ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ＦＲＧＩＤＡ ａｎｄ ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｐａｔｈｗａｙ ｍｕｔａｎｔｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ｒｅｐｏｎ ｓｉｖｅｎｅｓｓ ｔｏ ｖｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｌｎｔ ａＣｅｌｌ，２００１，１３：９３５—９４１． 【９】Ｓｈｅｌｄｏｎ Ｋ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｌｆｏｗｅｒｉｎｇ ｂｙ ｖｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏ１．，２０００，３：４１８—４２２． 【１０］Ｆｉｎｎｅｇａｎ Ｅ Ｊ，ｅｔ ａ１．ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ ｂｙ ｖｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｉｌ Ａｃａｄ ＵＳＡ， １９９８，９５：５８２４—５８２９． 【ｌ １】Ｇｅｎｄａｌｌ Ａ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ Ｖｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ２ ｇｅｎｅ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｅ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ， ２００１，１ ０７（４）：５２５—５３５．
