乳制品中三聚氰胺检测方案 乳制品中三聚氰胺检测方案 一、标准品及溶液配制标准品及溶液配制：溶液配制： 1. 三聚氰胺标准储备液：准确称取100 mg（精确到0.1 mg）标准品于100 mL容量瓶中，用50：50甲醇：水（体积比）溶解并定容至刻度，配制成浓度为1 mg/mL的标准储备液，于4℃避光保存。【使用时间为三个月】 2. 流动相配制： a) 准确称取2.10 g柠檬酸（不含结晶水）和2.16 g辛烷磺酸钠（不含结晶水），加入约980 mL水溶解，然后定容至1L，【说明：如果柠檬酸或辛烷磺酸钠中含有结晶水，需要进行换算】，用0.45um水性滤膜过滤 b) 将a）和乙腈按照90：10的体积比进行混合，作为流动相（可以根据三聚氰胺出峰时间以及和杂质的分离情况对体积比进行调节） 3. 标准工作液配制： 用流动相将标准储备液逐级稀释得到的浓度为0.5，1，2，5，10 µg/mL的标准工作溶液，浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度做图，得到标准曲线回归方程。 4．5％氨水甲醇溶液： 将氨水（分析纯，浓度25％）和甲醇以5：95的体积比混合。 二、样品前处理步骤（SPE净化过程） 样品前处理步骤：步骤：取样品2g，加入15mL 1％三氯乙酸和5mL乙腈，蜗旋,超声提取10min，1％三氯乙酸定容至25mL，以4000转/min速离心10min，移取上清液5毫升进行SPE。 将Oasis MCX小柱 （3 cc，60 mg）依次用3 mL甲醇和5 mL 水进行活化，将5mL上清液上样，然后依次用3 mL水和3 mL甲醇进行淋洗，抽干10s；最后用6 mL 5％氨水甲醇溶液进行洗脱；50℃氮气吹干，用流动相2 .b）定容至 1 mL。 三、液相色谱条件液相色谱条件 I. HPLC方法 仪器配置：Alliance 2695 ＋ 2489 紫外检测器 色谱柱： Symmetry C8, 4.6x 250mm, 5µm （订货号：WAT054270） 流动相： 2，b） 流 速： 1.0 mL/min 柱 温： 40℃ 进样量： 20µL 检测波长：240nm 样 品： 巧克力早餐奶，香草冰淇凌 固相提取小柱: Waters Oasis® MCX 3cc(60mg） P/N:186000254 两类样品分别进行基质空白加标处理（添加水平2 mg/kg，此水平下重复3次，考察方法准确度和精密度）。 分析结果：分析结果： 图1 三聚氰胺标准品色谱图 0.0080.0060.004AU0.000-0.0020.002.004.006.008.0010.0012.0014.00Minutes16.0018.0020.0022.0024.0026.0028.0030.0020.59022.8470.002melamine - 22.19121.239 图2 空白巧克力奶样品色谱图 0.0080.0060.004AU0.000-0.0020.002.004.006.008.0010.0012.0014.00Minutes16.0018.0020.0022.0024.0026.0028.0030.0020.6500.00221.220melamine - 22.187 图3 空白巧克力奶样品 2 mg/kg添加色谱图 0.0080.0060.004AU0.000-0.0020.002.004.006.008.0010.0012.0014.00Minutes16.0018.0020.0022.0024.0026.0028.0030.0022.6770.00221.157melamine - 21.987 图4 空白冰淇凌样品色谱图 0.0060.004AU20.3170.000-0.0020.002.004.006.008.0010.0012.0014.00Minutes16.0018.0020.0022.0024.0026.0028.0030.0022.8370.00221.133melamine - 22.079 图5 空白冰激凌样品 2 mg/kg添加色谱图 600000400000Area20000000.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.00Amount5.506.006.507.007.508.008.509.009.5010.00 图6 校正曲线 表1 实际样品定量实际样品定量结果定量结果 表2 巧克力奶样品巧克力奶样品加标回收率样品加标回收率 添加2mg/kg spike 1-1 Spike 1-2 spike 1-3 回收率(%) 98.3 96.8 95.0 96.7 平均回收率平均回收率(%) 表3 冰激凌样品加标回收率冰激凌样品加标回收率 添加2mg/kg Spike 2-1 spike 2-2 spike 2-3 回收率(%) 89.8 93.5 103.6 95.6 平均回收率(%) II. UPLC方法 方法1：反相离子对方法 色谱系统： ACQUITY UPLC + TUV紫外检测器 色谱柱： ACQUITY BEH C8，2.1×100 mm I.D.，1.7 µm 流动相： 2，b） 流 速： 0.5 mL/min 进样量： 5 µL 柱 温： 40 ℃ 检测波长： 240nm 分析样品： 巧克力早餐奶，香草冰激凌 分析结果 图7 三聚氰胺标准品色谱图 图8 空白巧克力奶样品色谱图 图9 空白巧克力奶样品 2 mg/kg添加色谱图 图10 空白冰淇凌样品色谱图 图11 空白冰激凌样品 2 mg/kg添加色谱图 图12 校正曲线 表4 实际样品定量结果实际样品定量结果 表5 巧克力奶样品加标回收率巧克力奶样品加标回收率 两个平行加标 Spike1-1 Spike1-2 回收率(%) 89.5 87.9 平均回收率(%) 88.7 表6 冰激凌样品加标回收率冰激凌样品加标回收率 三个平行加标 回收率(%) 平均回收率(%) Spike2-1 Spike2-2 Spike2-3 88.0 101.0 92.8 93.9 方法2：HILIC方法 色谱系统： ACQUITY UPLC + TUV紫外检测器 色谱柱： ACQUITY BEH HILIC，2.1×50 mm I.D.，1.7 µm 流动相： 乙腈/甲醇/10mM甲酸铵 86/7/7 流 速： 0.5 mL/min 进样量： 10 µL 柱 温： 35 ℃ 检测波长： 240nm 分析样品：巧克力早餐奶，香草冰激凌 分析结果 图13 三聚氰胺标准品色谱图 图14 空白巧克力奶样品色谱图 图15 空白巧克力奶样品 2 mg/kg添加色谱图 图16 空白冰淇凌样品色谱图 图11 空白冰激凌样品 2 mg/kg添加色谱图 图12 校正曲线 表7 实际样品定量结果实际样品定量结果 表8 巧克力奶样品加标回收率巧克力奶样品加标回收率 三个平行加标 Spike1-1 Spike1-2 Spike1-3 Recovery(%) 94.3 90.9 87.8 Average Recovery(%) 91.0 表9 冰激凌样品加标回收率冰激凌样品加标回收率 三个平行加标 Spike2-1 Spike2-2 Spike2-3 Recovery(%) 83.0 95.1 86.5 Average Recovery(%) 88.2 四、结论 1. Oasis MCX 3cc/60mg固相萃取小柱对于不同奶制品的净化和前处理过程是有效的，在实验室测试了包括纯牛奶、酸奶、冰淇凌、巧克力奶基质，Oasis MCX小柱可以获得80％以上的回收率，而且数据稳定，采用4000转/min转速离心也不会发生小柱堵塞的问题。对于婴幼儿奶粉，建议采用8000转/min以上的转速进行离心，同时，我们建议采用真空固相萃取装置进行净化处理，避免过柱困难。 2. 使用Symmetry C8色谱柱，在90％离子对缓冲溶液和10％乙腈的条件下可以将三聚氰胺和杂质峰较好地分离，但分析时间较长。可以有两种选择来缩短分析时间：一种是将乙腈的浓度增加至15％，这样会牺牲一些分离度，但仍然可以满足分析定量要求；另外的方法就是使用Symmetry C8, 150-4.6mm, 3.5um（订货号：WAT200630）可以在保持同等分离度的情况下将分析时间缩短40％。 3. ACQUITY UPLC BEH C8色谱柱在90％离子对缓冲溶液和10％乙腈的条件下可以将三聚氰胺峰和样品中的基质杂质较好地分离，4min可以完成一个分离，适合用于样品量大的实验室。我们建议每连续运行8个小时后，将乙腈比例升高至60%清洗色谱柱，以避免样品中的非极性污染物在色谱柱内堆积造成柱效下降并影响色谱柱寿命。同时我们建议每运行24小时需要彻底清洗色谱柱，清洗最好在40℃条件下进行。 4. 本实验比较了沃特世公司不同种类的反相色谱柱运行离子对方法的分离情况，我们发现离子对方法很容易造成样品基质中的干扰组分和三聚氰胺发生共“流出”，这是方法本身存在的缺陷，对分析结果会造成“假阳性”。使用反相离子对方法，所测出的不同样品中的三聚氰胺的含量基本上是在0.6~1.0ppm，有时高达1.7ppm；当我们采用HILIC方法重新分析这些样品，发现三聚氰胺含量远远低于用反相离子对方法测出的结果，说明反相离子对方法中基质干扰组分和三聚氰胺发生了共流出，从而造成分析结果偏高。仅仅通过增加色谱柱的柱效（如增加柱长或减小颗粒度）并不能将三聚氰胺和干扰组分分开，而且不同基质样品中的干扰物也大不相同。 5. 我们在实验室对HILIC方法进行了系统的验证工作，证明此方法能够有效的将样品中的三聚氰胺和基质干扰物分开，最大程度的避免了假阳性结果的出现，同时HILIC方法结合ACQUITY UPLC系统还可以大大提高实验室检测效率和数据的质量。
