第３ ９卷 第８期 ２ Ｏ １ ２ 年８月 湖南大学学报（自然科学版） Ｖｏ１．３９。Ｎｏ．８ Ａｕｇ．２ ０ １ ２ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ） 文章编号：１６７４—２９７４（２０１２）０８—００５２—０５ 人膜蛋白ＣＤ８１的原核表达与纯化 朱海珍”，雷少华 ，刘春艳 ，焦 宇。，于晓妍 ，高益敏 （１．湖南大学生物学院，湖南长沙４１００８２； ２．内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古包头０１４０００） 摘 要：以高效原核表达载体ｐＣｏｌｄ ＴＦ为载体骨架，应用ＰＣＲ、限制性酶切、连接等分 子生物学方法，将ｐＣｏｌｄ ＴＦ中的六聚组氨酸（Ｈｉｓ—Ｔａｇ）序列替换为限制性酶切位点Ｓｐｅ Ｉ 序列ＡＣＴＡＧＴ，构建不合Ｈｉｓ－Ｔａｇ序列的新载体ｐＬ１１８．以此载体表达蛋白时，通过ＰＣＲ 引物在目的基因３ 端添加Ｈｉｓ—Ｔａｇ以利于融合蛋白的纯化以及融合蛋白中的Ｔｒｉｇｇｅｒ Ｆａｃ— ｔｏｒ（ＴＦ）助溶蛋白的去除．应用ｐＬ１１８对人膜蛋白ＣＤ８１进行原核表达与纯化，并使用Ｆａｃ— ｔｏｒ Ｘａ蛋白酶去除ｃＤ８１融合蛋白中的ＴＦ助溶蛋白，获得３ 端含有Ｈｉｓ—Ｔａｇ的ＣＤ８１蛋 白．人膜蛋白ＣＤ８１的表达纯化，为ＣＤ８１靶向药物筛选、抗体制备及深入研究ＣＤ８１的功能 奠定了基础．ｐＬ１１８载体的构建以及ＣＤ８１蛋白的表达纯化为表达困难的基因实现原核表 达提供了一种新的思路和方法． 关键词：载体；人ＣＤ８１；蛋白表达；纯化 中图分类号：Ｑ８１６ 文献标识码：Ａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８１ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｚ Ｈ Ｕ Ｈ ａｌ—ｚｈｅｎ”，ＬＥＩ Ｓｈａｏ—ｈｕａ ，ＬＩＵ Ｃｈｕｎ—ｙａｎ ，Ｊ ＩＡＯ Ｙｕ ，ＹＵ Ｘｉａｏ—ｙａｎ ，ＧＡＯ Ｙｉ—ｒａｉｎ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｎａｎ Ｕｎｉｖ，Ｃｈａｎｇｓｈａ，Ｈｕｎａｎ ４１００８２。Ｃｈｉｎａ；２．Ｂａｏｔｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ｕｎｉｖ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。Ｂａｏｔｏｕ，Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ ０１４０００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＣｏｌｄ ＴＦ，ａ ｎｅｗ ｖｅｃｔｏｒ ｐＬ１ １ ８ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ｔｈｅ Ｈｉｓ—Ｔａｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｓｉｔｅ ｏｆ Ｓｐｅ Ｉ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｈｉｓ—Ｔａｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ３ ｅｎｄ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ， ａｎｄ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔａｇ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｕｍａｎ ＣＤ８１一Ｔｒｉｇｇｅｒ Ｆａｃｔｏｒ（ＴＦ）ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ．Ｈｕｍａｎ ＣＤ８ １ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｒｅｍｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ＴＦ ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔａｇ ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ．Ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｈｕｍａｎ ＣＤ８ １ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌａｉｄ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｒｕｇｓ，ｍａｋｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８１．Ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｗ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＬ１１８ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉ— ｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ８１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈａｖｅ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｖｅｃｔｏｒｓ；ｈｕｍａｎ ＣＤ８１；ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐＣｏｌｄ ＴＦ原核表达载体是一种插入蛋白可溶 性标签的融合型冷休克表达载体，空载体融合表达 收稿日期：２０１２－０２—１２ 基金项目：国家重大科技专项（２００９ＺＸ１０００４—３１２） 作者简介：朱海珍（１９６９一），男，湖北襄阳人，湖南大学教授，博士 十通讯联系人，Ｅ—ｍａｉｌ：ｈｚｚｈｕ＠ｈｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ 第８期 朱海珍等：人膜蛋白ＣＤ８１的原核表达与纯化 ５３ 的顺序为六聚组氨酸（Ｈｉｓ～Ｔａｇ）、Ｔｒｉｇｇｅｒ Ｆａｃｔｏｒ （ＴＦ）、蛋白酶切位点和多克隆位点序列．蛋白酶切 位点依次为ＨＲＶ ３Ｃ ｐｒｏｔｅａｓｅ，Ｔｈｒｏｍｂｉｎ和Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ，用于去除融合蛋白的可溶性标签．ＴＦ是一种原 核的核糖体结合伴侣蛋白，相对分子质量约４．８× １Ｏ ，它能够促进新生肽链的共翻译折叠，与目的蛋 白融合表达，提高目的蛋白的可溶性．载体上带有冷 白融合表达的效率和可溶性，另一方面有利于融合 蛋白中的ＴＦ助溶蛋白的去除，获得不含助溶蛋白 标签的全长人ＣＤ８１蛋白． １材料与方法 １．１ 材 料 大肠杆菌菌株ＤＨ５ａ，ＢＬ２１（ＤＥ３），ｐＥＴ２８ｂ质 休克表达系统，严格控制载体在低温条件下才能表 达目的蛋白，进一步促进了目的蛋白的可溶性表达． 粒，人脾脏ｃＤＮＡ为本室保存；ｐＣｏｌｄ ＴＦ质粒， ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ和Ｔ４连接酶购自宝生物公司（ＴａＫａ— 人ＣＤ８１是一种四跨膜的非糖基化膜蛋白，由 Ｒａ）；ＰＣＲ试剂盒购自Ｒｏｃｈｅ公司；质粒纯化，ＤＮＡ 胞内的Ｎ端和Ｃ端、４个跨膜结构域、胞外小环和 回收试剂盒，Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ蛋白酶购自ＱＩＡＧＥＮ公司； 胞外大环４部分组成，相对分子质量约２．６×１０ ， 限制性内切酶购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；Ｎｉ—ＮＴＡ镍离子 在Ｂ细胞、Ｔ细胞、肝细胞等多种细胞中均有表达． 亲和层析柱购自ＧＥ公司；ＰＶＤＦ膜和蛋白ｍａｒｋｅｒ ＣＤ８１参与细胞的粘附和信号转导，具有影响细胞 购自Ｂｉｏ—ｒａｄ公司；ａｎｔｉ－ｈｉｓ鼠源单克隆抗体购白天 增殖和分化等生物学功能口］，是细胞表面的免疫调 根公司；羊抗鼠二抗购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＥＣＬ发 节分子＿２］，并参与丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ， 光试剂盒购自Ｔｈｅｒｍｏ公司． ＨＣＶ）感染宿主细胞，作为ＨＣＶ的一个受体介导病 １．２ ｐＣｏｌｄ ＴＦ载体的改造 毒颗粒进入宿主细胞¨３］，ＨＣＶ包膜蛋白Ｅ２与 １．２．１ ｐＣｏｌｄ ＴＦ载体的改造方案 ＣＤ８１胞外大环相互结合实现ＨＣＶ的感染＿４ ］．针 方案设计的基本原则是使用ＰＣＲ分别扩增 对ＣＤ８１的靶向药物及特异性抗体具有抑制ＨＣＶ Ｈｉｓ－Ｔａｇ前后的部分ＤＮＡ片段，ＰＣＲ产物两端分 感染的潜在功能 －７］，人膜蛋白ＣＤ８１的原核表达 别带有限制性酶切位点，在Ｈｉｓ—Ｔａｇ部分引入一个 与纯化，为今后靶向药物筛选、抗体制备及深入研究 载体不包含的限制性酶切位点，分别酶切ｐＣｏｌｄ ＴＦ ＣＤ８１与ＨＣＶ之间的关系奠定了基础． 质粒和两个ＰＣＲ产物，再将这３个片段连接成新载 ｐＥＴ２８ｂ是一种常规的原核表达载体，含有Ｔ７ 体质粒，实现以限制性酶切位点替换Ｈｉｓ—Ｔａｇ的目 启动子、乳糖操纵子和多克隆位点序列等基本功能 的．在ＮＣＢＩ上获取ｐＣｏｌｄ ＴＦ载体序列，经搜索发 元件，在蛋白原核表达与纯化实验体系中应用广泛． 现２７１～２８８位为Ｈｉｓ—Ｔａｇ序列，１０９～１ｌ４位和６９９ 在预实验中，将人ｃｄ８１基因克隆到ｐＥＴ２８ｂ载体中 ～７０４位分别为限制性酶切位点Ｎｈｅ工和Ｂｕｂ工， 尝试原核表达，发现没有可溶性目的蛋白的表达． 且Ｎｈｅ Ｉ和Ｂｕｂ工在载体中是单一的酶切位点，因 ｐＣｏｌｄ ＴＦ不仅有ｐＥＴ２８ｂ中的基本功能元件，还包 此可用于本载体的改造．ＰＣＲ扩增１０９～２７０位的 含了冷休克表达系统和ＴＦ助溶蛋白，通过严格控 ＤＮＡ片段Ｐ１和２８９～７０４位的ＤＮＡ片段Ｐ２，并在 制目的蛋白低温表达，以及ＴＦ的可溶性标记功能 Ｐ１ ３ 端和Ｐ２ ５ 端的引物中添加限制性酶切位点 和分子伴侣作用，可以使一些表达困难的基因获得 Ｓｐｅ工．Ｎ＾Ｐ工和Ｂｕｂ工双酶切ｐＣｏｌｄ ＴＦ载体，Ｎｈｅ 更高概率的可溶性表达．本课题改造ｐＣｏｌｄ ＴＦ载 工和Ｓｐｅ工双酶切Ｐ１，Ｓｐｅ Ｉ和Ｂｕｂ工双酶切Ｐ２，再 体，在保留冷休克及融合表达系统的前提下，去除原 将酶切后的载体、Ｐ１和Ｐ２进行连接，获得重组质粒 载体上的Ｈｉｓ—Ｔａｇ序列，一方面提高了人ＣＤ８１蛋 （图１）． １０９位 ２７Ｏ位 ２８９位７ｏ４位 Ｉ Ｎｈｅ Ｉ Ｉ Ｈｉ．Ｔａｇ Ｉ。 ＢｕｂＩ Ｉ ｐＣｏ￣ＴＦ序列 ＡＣＴＡＧＴ ＡＣ＇ｒＡＧＴ Ｉ－ Ｉ Ｉ经改造后 ｐＬ１１８序列 Ｐ１ Ｉ Ｐ２ 图１ ｐＣｏｌｄ ＴＦ载体改造方案图 Ｆｉｇ．１ Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｄｉａｇｒａｍ ｏｆ ｖｅｔｏｒ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐＣｏｌｄ ＴＦ ５４ 湖南大学学报（自然科学版） １．２．２ ｐＣｏｌｄ ＴＦ载体的改造方法 洗涤，最后用Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钠， Ｐ１ ５ 端（Ｎｈｅ Ｉ）引物：５ ｃｇｃｇｃｇｃｔａｇｃｇｃｔａｇｃｇ— ｃａｔａｔｃｃａｇｔｇｔａ一３ ；Ｐ１ ３ 端（Ｓｐｅ工）引物：５ 一ｃｔｇｃａｇａｃ— ｔａｇｔｃａｃｔｔｔｇｔｇａｔｔｃａｔｇｇｔｇ一３’；Ｐ２ ５’端（Ｓｐｅ工）引物： ５ 。ｃｇｃｇｃａｃｔａｇｔａｔｇｃａａｇｔｔｔｃａｇｔｔｇａａａｅｃａｃｔｃ一３ ；Ｐ２ ３ 端 ５００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣ１，５００ ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑，ＰＨ７．４）洗脱 目的蛋白．收集的Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ即为目的蛋白，具 体操作参照Ｎｉ—ＮＴＡ层析柱使用说明． １．４ Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ蛋白酶切 （Ｂｕｂ Ｉ）引物：５＇－ｃｔｇｃａｇｇｃａｔｇｃｃｇｔｃａａｃｇｔｃａ一３ ；引物 ４Ｏ Ｌ酶切反应体系：１０ ｇ融合蛋白，１Ｕ Ｆａｃ— ｔｏｒ Ｘａ蛋白酶，Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ至４０ Ｌ．酶切反应 混合液２０℃孵育９ ｈ，然后混合液在Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ 中透析过夜，再利用Ｎｉ—ＮＴＡ层析柱获取不含ＴＦ 合成与纯化由上海生工公司完成．应用ＰＣＲ试剂盒 扩增目的片段的反应体积为５Ｏ Ｌ．循环参数为：９５ ℃预变性２ ｍｉｎ；然后９５℃３０ Ｓ，６０℃３０ Ｓ，７２℃ ４０ ８，３５个循环；７２℃延伸５ ｍｉｎ．按照限制性内切 酶的使用说明，分别双酶切ｐＣｏｌｄ ＴＦ载体、Ｐ１和 Ｐ２，使用Ｔ４连接酶将酶切后的片段相连接，将连接 产物转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，挑取生长在平板上的单 克隆菌落，培养后提取质粒进行酶切鉴定． １＿２．３ ｐＬ１１８载体的酶切鉴定及测序 按照限制性内切酶的使用说明，用Ｓｐｅ工单酶 切ｐＣｏｌｄ ＴＦ和ｐＬ１１８载体，用ＮｈｅＩ，ＳｐｅＩ和Ｂｂｕ Ｉ三酶切ｐＣｏｌｄ ＴＦ和ｐＬ１１８载体，１ 琼脂糖凝胶 电泳鉴定．使用Ｐ１ ５ 端引物和Ｐ２ ３ 端引物对 ｐＬ１１８进行正反测序，由上海生工公司完成． １．３蛋白的表达与纯化 １．３．１ 空载体和重组质粒蛋白的表达 以人脾脏ｃＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增ｃｄ８１基因 的编码序列，将其装入ｐＥＴ２８ｂ或ｐＬ１１８载体中．５ 端（Ｎｄｅ工）弓Ｉ物：５ 一ｃｃｃａｔａｔｇｇｇａｇｔｇｇａｇｇｇｃｔｇｃａｃｃａａ一 ３ ，将其克隆到ｐＥＴ２８ｂ载体中的３ 端（ＢａｍＨ Ｉ） 引物：５＇－ｃｇｇｇａｔｃｃｔｃａｇｔａｃａｃｇｇａｇｃｔｇｔｔ一３ ，将其克隆到 ｐＬｌ１８载体中的３ 端（Ｐｓｔ Ｉ和Ｈｉｓ－Ｔａｇ）引物：５ ｃｔｇｃａｇｃｔｇｃａｇｔｃａｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇｇｔａｃａｃｇｇａｇｃｔｇｔｔｃ ｃｇｇａｔ一３ ．将需要表达蛋白的质粒转人大肠杆菌菌株 ＢＬ２１（ＤＥ３）中，３７℃摇菌过夜，次日以１：５０扩大 培养至ＯＤ值０．６～０．８，２５℃诱导ｐＥＴ２８ｂ和 ｐＥＴ２８ｂ—ｈＣＤ８１菌表达１２ ｈ，１６℃诱导ｐＣｏｌｄ ＴＦ， ｐＬ１１８和ｐＬ１１８－ｈＣＤ８１表达２４ ｈ，收集细菌沉淀， 用于蛋白纯化或一８Ｏ℃冻存备用． １．３．２ 人ＣＤ８１蛋白的纯化 使用美国ＧＥ公司的Ｎｉ—ＮＴＡ镍离子亲和层析 柱纯化蛋白，由于ｐＬ１１８－ｈＣＤ８１质粒表达的融合蛋 白是可溶性的，因此在非变性条件下（Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆ— ｅｒ：２０ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钠，５００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣ１，５ ｍｍｏｌ／ Ｌ咪唑，ＰＨ７．４）裂解细菌和纯化目的蛋白．采用溶 菌酶超声破碎法裂解细菌，将裂解液上清通过Ｎｉ— ＮＴＡ层析柱后，用Ｗａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ ｍｍｏｌ／Ｌ磷 酸钠，５００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣ１，５０ ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑，ＰＨ７．４） 助溶蛋白的全长人ＣＤ８１蛋白，过程方法同上述人 ＣＤ８１蛋白的纯化． １．５ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析 细菌裂解液上清或纯化的蛋白进行ＳＤＳ— ＰＡＧＥ，随即将电泳后的蛋白转移到ＰＶＤＦ膜上，用 ５ 的脱脂牛奶室温封闭ＰＶＤＦ膜１ ｈ，ＴＢＳＴ震荡 洗涤ＰＶＤＦ膜３次，每次５ ｒａｉｎ．加入１：１ ０００稀释 的ａｎｔｉ—ｈｉｓ鼠源单克隆抗体，室温孵育１ ｈ，ＴＢＳＴ 洗涤３次，每次５ ｍｉｎ．再用ＨＲＰ标记的羊抗鼠二 抗室温孵育１ ｈ，ＴＢＳＴ洗涤３次，每次５ ｍｉｎ．最后 用ＥＣＬ发光试剂显色． ２ 结 果 ２．１ ｐＬｌｌ８载体的构建与鉴定 以融合型冷休克原核表达载体ｐＣｏｌｄ ＴＦ为模 板，ＰＣＲ扩增载体１０９～２７０位的ＤＮＡ片段Ｐ１和 ２８９～７Ｏ４位的ＤＮＡ片段Ｐ２，载体中２７１～２８８位 为Ｈｉｓ－Ｔａｇ序列，并在Ｐ１ ３ 端和Ｐ２ ５ 端的引物中 添加限制性酶切位点Ｓｐｅ Ｉ（图１），ＰＣＲ产物经２ 琼脂糖凝胶电泳后分别出现约２００ ｂｐ和４５０ ｂｐ的 特异性条带，与预期Ｐ１和Ｐ２的大小一致（图２）．Ｐ１ 和Ｐ２分别双酶切处理后，与经过Ｎｈｅ工和Ｂｂｕ工酶 切的ｐＣｏｌｄ ＴＦ载体片段连接，获得重组质粒．酶切 鉴定结果显示，重组质粒能被Ｓｐｅ Ｉ单酶切，ｐＣｏｌｄ ＴＦ质粒则不能被酶切．Ｎｈｅ Ｉ，Ｓｐｅ Ｉ和Ｂｂｕ Ｉ三酶 切重组质粒，出现与Ｐ１和Ｐ２大小相同的２个ＤＮＡ 片段，而ｐＣｏｌｄ ＴＦ质粒只出现大小约６５０ ｂｐ的 ＤＮＡ片段（图３）．ＤＮＡ测序证实，重组质粒１００～ ７１０位序列中Ｈｉｓ—Ｔａｇ序列被限制性酶切位点Ｓｐｅ 工序列ＡＣＴＡＧＴ替代，其他序列保持不变，获得与 设计序列完全一致的质粒，将原质粒和重组质粒分 别转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），原核表达显示改造前 后质粒的表达水平不受影响，均有５４ ｋｕ左右的空 载蛋白表达（图４中泳道３和泳道４）．将此新质粒 ５６ 湖南大学学报（自然科学版） 两个蛋白片段，目的蛋白不含Ｈｉｓ—Ｔａｇ，不利于目的 蛋白的再回收．本文对ｐＣｏｌｄ ＴＦ载体进行改造，使 之不含Ｈｉｓ—Ｔａｇ序列，将目的基因克隆到该载体 时，通过在目的基因３ 端引物添加Ｈｉｓ—Ｔａｇ序列， 其融合蛋白表达的顺序为ＴＦ助溶蛋白、蛋白酶切 位点、目的蛋白、Ｈｉｓ—Ｔａｇ，其中Ｈｉｓ－Ｔａｇ不仅可用 于融合蛋白的纯化，也可用于融合蛋白酶切后目的 蛋白的纯化，因为Ｈｉｓ－Ｔａｇ仍然保留在目的蛋白 上，也可作为标签用于Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ中目的蛋白的 检测，以及结合在Ｎｉ—ＮＴＡ等载体上，用于进一步 目的蛋白功能研究和特异性药物筛选等． 通过对ｐＣｏｌｄ ＴＦ载体序列中限制性酶切位点 的分析，发现位于Ｈｉｓ—Ｔａｇ序列前端的Ｎｈｅ工和后 端的Ｂｕｂ Ｉ是载体中单一的酶切位点，且载体不含 酶切位点Ｓｐｅ工．通过设计特定的ＰＣＲ引物，并运 用ＰＣＲ、限制性酶切、连接等分子生物学方法，成功 去除ｐＣｏｌｄ ＴＦ载体中的Ｈｉｓ－Ｔａｇ序列，并且不影 响原载体的蛋白表达能力，将此新质粒命名为 ｐＩ １１８．ｐＬ１１８继承了原载体高效蛋白可溶性表达 的优点，并使之有利于去除融合蛋白中的ＴＦ助溶 蛋白，将Ｈｉｓ—Ｔａｇ保留在目的蛋白上．在应用ｐＬ１１８ 表达融合蛋白时要特别注意的是：在目的基因３ 端 引物引入Ｈｉｓ－Ｔａｇ序列时，将Ｈｉｇ－Ｔａｇ序列放置在 目的基因的编码序列和终止密码子之间，如果Ｈｉｓ— Ｔａｇ序列放置在终止密码子之后，融合蛋白的表达 将提前终止而不含Ｈｉｓ－Ｔａｇ． 膜蛋白具有多种多样的细胞功能，是基础研究 及药物开发的理想靶标，然而研究膜蛋白有一个难 题，它们的过表达对宿主有毒性而限制蛋白产量，或 产生包涵体增加纯化难度．人ＣＤ８１是一种四跨膜 蛋白，将其克隆到ｐＥＴ２８ｂ载体中尝试原核表达，发 现没有可溶性目的蛋白的表达，关于ＣＤＳ１原核表 达的文献报道也集中于ＣＤ８１胞外大环可溶片段的 表达．ＣＤ８１参与细胞的粘附和信号转导，具有影响 细胞增殖和分化等生物学功能，是细胞表面的免疫 调节分子，并作为受体介导ＨＣＶ感染宿主细胞．近 期有报道称，ＣＤ８１不仅是ＨＣＶ感染中的一个受 体，还可影响ＨＣＶ ＲＮＡ的复制 ］，或通过激活细 胞的Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ信号通路而影响ＨＣＶ在宿 主细胞中的生活周期Ｉｇ］，在慢性丙型肝炎病人的血 清中，可溶性的ＣＤ８１蛋白水平升高，并参与病人肝 纤维化的形成¨１ ，因此对ＣＤ８１的进一步研究具有 重要的理论与实践意义． ４ 结 语 本文将ＣＤ８１克隆到ｐＬ１１８载体中，实现了 ＣＤ８１融合蛋白高效可溶性表达，使用Ｎｉ—ＮＴＡ亲 和层析柱对融合蛋白纯化，再利用Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ蛋白 酶去除ＴＦ助溶蛋白，成功获得含有Ｈｉｓ—Ｔａｇ的全 长ＣＤ８１蛋白．人膜蛋白ＣＤ８１的表达纯化证实了 ｐＬ１１８载体使表达困难的基因获得更高概率的可溶 性表达，为ＣＤ８１靶向药物筛选、抗体制备及深入研 究ＣＤ８１与ＨＣＶ之间的关系奠定了基础．ｐＬ１１８载 体的构建以及ＣＤ８１蛋白的表达纯化方法具有一定 的创新性，为表达困难的基因实现原核表达提供了 一种新的思路和方法． 参考文献 ［１］ＩＥｖＹ ｓ，ＴＯＤＤＳＣ，ＭＡＥＣＫＥＲＨ ＣＤ８１（ＴＡＰＡ一１）：ａｍｏｌｅ— ｃｕｌｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９８８，１６：８９—１０９． Ｅ２］ＬＥＶＹ Ｓ，ＳＨＯＨＡＭ Ｔ．Ｔｈｅ ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ ｗｅｂ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｉｍ— ｍｕｎｅ－ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００５，５ （２）：１３６—１４８． ［３］ＰＩＬＥＲＩ Ｐ，ＵＥＭＡＴＳＵ Ｙ，ｃＡＭＰＡＧＮ０ＬＩ Ｓ，ｅｔ。ｚ．Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｃ ｖｉｒｕｓ ｔｏ ＣＤ８１ ＥＪ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２８２（５３９０）： ９３８—９４１． ｒ４］ ＦＬＩＮＴ Ｍ，ＭＡＩＤＥＮＳ Ｃ，Ｌ０ＯＭＩｓ—ＰＲＩｃＥ Ｌ Ｄ，ｅｔａ１．Ｃｈａｒａｅ— ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ Ｅ２ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＤ８１［Ｊ］．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，１９９９，７３（８）： ６２３５—６２４４． ［５］ＰＥＴＲＡＣＣＡ Ｒ，ＦＡＬＵＧＩ Ｆ，ＧＡＬＬＩ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃ— ｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ－ＣＤ８１ ｂｉｎｄｉｎｇ［Ｊ］．Ｊ Ｖｉｒｏ１，２０００，７４（１０）：４８２４—４８３０． ［６］ ＳＴＡＭＡＴＡＫＩ ｚ，ＧＲ０ＶＥ Ｊ，ＢＡＬＦＥ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉ— ｒｕｓ ｅｎｔｒｙ ａｎｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ，２００８，１２（３）： ６９３—７１２． ［７］ ＡＳＨＦＡＱ Ｕ Ａ，ＱＡＳＩＭ Ｍ，ＹＯＵＳＡＦ Ｍ Ｚ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＨＣＶ ３ａ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｅｎｔｒｙ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｈｏｓｔ ＣＤＳ１ ａｎｄ ＨＣＶ Ｅ２ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［Ｊ］．Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ，２０１１，９：１９４． ［８３ ｚＨＡＮＧＹ Ｙ Ｙ，ＺＨＡＮＧ Ｂ Ｈ，ＬＳＨＩＩ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｎｏｖｅｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８１ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ｖｉｒ— ｏｌ，２０１０，８４（７）：３３９６—３４０７． ｒ９］ ＢＲＡＺＺＯＬＩ Ｍ，ＢＩＡＮＣＨＩ Ａ，ＦＩＬＩＰＰＩＮＩ Ｓ，ｅｔ ａＺ．ＣＤ８１ ｉｓ ａ ｃｅｎｔｒａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｖｅｎｔｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉ— ｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００８，８２ （１７）：８３１６—８３２９． ［１Ｏ］ＷＥＬＫＥＲ Ｍ Ｗ，ＲＥＩＣＨＥＲＴ Ｄ，ＳＵＳＳＥＲ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｅ— ｒｕｍ ＣＤ８１ ｉｓ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ａｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｓｅｒｕｍ ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］． ＰＬｕＳ Ｏｎｅ，２０１２，７（２）：ｅ３０７９６．
