红米中花色苷的提取工艺及其体外降糖活性研究

Nov.導1Q2 卷•药学研究•本文引用：郭晓宇，胡宇恒，古丽斯坦・阿不来提，等.红米中花色昔的提取工艺及其体外降;

糖活性研究［J］.医科大学学报,2019,42(11):14-146 & doi： 10.3969/j.issn.［

1009-5551.2019.11.018

: t红米中花色甘的提取工艺及其体外降糖活性研究郭晓宇，胡宇恒，古丽斯坦•阿不来提，热娜•吉恩斯.唐晓敏，姚 军(医科大学药学院，乌鲁木齐830011)摘要：目的研究红米中花色昔的最佳提取工艺及体外降糖活性。方法采用单因素实验

(温度、时间、提取时间、提取温度、pH值、乙醇浓度)和响应面实验确定红米中花色著的最佳提取 工艺。采用pH示差法测定红米中花色昔的含量，使用4-硝基酚-2-D-*喃葡萄糖昔(PNPG)法和

碘比色法测定红米中花色昔对g葡萄糖昔酶和a-淀粉酶的抑制率。结果红米中花色昔的最佳 提取工艺为：75%乙醇，pH为0.7,提取时间2.5 h,料液比1 : 7,提取次数2次，提取温度45C。在此

条件下，测得红米中花色昔的含量为2.5 mg/go红米花色著对cr葡萄糖昔酶和a-淀粉酶具有体外抑

制作用。结於本方法简便、可靠，适用于红米中花色昔的提取，红米花色昔具有体外降糖活性。关键词：红米；花色昔;a-葡萄糖著酶；a-淀粉酶；降糖作用中图分类号:R914

文献标识码：A 文章编号:1009-5551(2019)11-14-05doi：10.3969/j.issn.1009-5551.2019.11.018Study on the extraction process of anthocyanin from red rice and its

hypoglycemic activity in vitroGUO Xiaoyu, HU Yuheng, Gulstan Abulaiti^Rena Jiensi,TANG Xiaomin,YAO Jun(School of Pharmacy , Xinjiang Medical University , Urumqi 830011, China )Abstract： Objective To study the optimal extraction process and hypoglycemic activity of anthocyanins

from red rice. Methods Through a series of single-factor experiments and response surface experiments, the optimal extraction conditions of anthocyanin by solvent extraction were obtained, and the inhib让ion rates of a-glucosidase and a-amylase were determined. The content of anthocyanin in red rice was deter­

mined by pH differential method, and the inhibition rate of a-glucosidase and a-amylase was determined by 4-nitrophenol-2-d-pyranoglucoside ( PNPG) method and iodine colorimetry. Results The optimal

extraction condition of anthocyanins as follows： 75% ethanol, pH = 0.7, extraction time 2.5 h, ratio of material to liquid was 1 : 7 , extraction times twice, and extraction temperature 45 °C. Under these condi­tions, the extraction rate of anthocyanin was 2.5 mg/g. The anthocyanin of red rice inhibited both a-gluco- sidase and a-amylase to some extent« and the anthocyanin content was proportional to the inhibition rate of the double enzyme within a certain concentration range. Conclusion The method is simple, reliable and suit­able for the extraction of anthocyanins from red rice. Red rice anthocyanins have hypoglycemic activity in vitro. Keywords: Oryza punctata ； anthocyanins； a-glucosidase； a-amylase； hypoglycemic effect基金项目：医科大学第十三期大学生创新性实验计划项目(CX2018097)作者简介：郭晓宇(1998-),男，在读学士，研究方向：药学。通信作者：姚 军，男，教授•博士，博士生导师，研究方向：药物分析,E-mail：380531866@qq.como第11期郭晓宇，等：红米中花色昔的提取工艺及其体外降糖活性研究1465红米（Opza punctata ）为禾本科植物红糯稻 （.Oryza sativa var.glutinosa ）的种仁，因其种皮呈 红色而得名曲，国内外学者研究发现红米含有丰富 的花色昔，其中主要含有矢车菊素-3-葡萄糖#（Cy-

3-G）、芍药素-3-葡萄糖昔以及二甲花翠素等，具有 抗氧化、降血脂、抗动脉粥样硬化等药理作用\"7」。 民间有利用红米食疗调节血糖的用法，而对其降糖 作用机制的研究尚少。糖尿病是一种以高血糖为特 征的内分泌代谢疾病⑸，患者初期通过食疗便即可

控制病情，重症患者需要配合药物治疗曲。a-葡萄 糖昔酶和a-淀粉酶在广泛在人类肠道内存在，这两

种酶直接参与人体内糖原与淀粉的代谢。a-葡萄糖 昔酶抑制剂通过抑制肠道内的a-葡萄糖昔酶，来延 缓糖类的吸收从而达到降低血糖的效果。a-淀粉酶 抑制剂则是通过抑制a-淀粉酶，来减少人体对与淀 粉的吸收，来达到降血糖的效果\"7】。因此，a-葡萄

糖昔酶和a-淀粉酶的抑制率可以作为评价红米中 花色昔的体外降糖活性的指标UO-'3J。响应面法已

广泛用于药材中有效成分的提取，能较好的考察提 取过程不同提取因素的交互作用，筛选较优的提取 工艺［14_15\\本实验通过响应面法优化红米中花色 昔的提取工艺，采用PNPG法和碘比色法测定红米

花色昔对a-葡萄糖昔酶和a-淀粉酶的抑制率，现报 道如下。1材料与方法1.1仪器 C38型粉碎机（美的集团有限公司），

ME2O4E型电子天平秤、FE28型酸度计（梅特勒-托 利多仪器有限公司），Spectrumlab-22PC型可见分 光光度计（上海棱光有限公司）.SB-1000型旋转蒸 发仪（EYELA东京理化器械株式会社）。1.2试剂a-葡萄糖昔酶（国药集团化学试剂有限 公司，批号G8823）,a-淀粉酶（国药集团化学试剂有 限公司，批号G8290）,对硝基苯-p-D-Ptt喃半乳糖昔 （美国Solarbio公司，批号N8200）,阿卡波糖片（德 国拜耳公司，批号BJ43010）,无水乙醇（天津市富宇 精细化工有限公司，批号20170326）,冰醋酸（天津 博迪化工股份有限公司，批号20161008）,盐酸（天 津市富宇精细化工有限公司，批号20180606）。1.3药材 红米2018年11月购买于乌鲁木齐市 北园春农贸市场，产地为吉林省通化市，经医科 大学药学院帕丽达•阿不力孜教授鉴定为禾本科红 糯稻（Oryza sativa var.glutinosa ）的种仁。1.4红米花色昔的制备及含量测定方法红米用 蒸憎水洗净，进行粉碎，过60目筛，得到红米粉末， 称取红米粉末10 g,采用回流提取法，筛选不同温 度、提取时间、乙醇浓度、提取pH、料液比、提取次 数获得红米花色昔提取液，3 000 r/min离心5 min,

取上清液.调节pH为1.0和4.5,测定520 nm和

700 nm处吸光度，按公式：总花色昔含量（mg/g） = ［（pHl.OA52o — pHl.OAroo）— （pH4.5A；,,f） — pH4.5A-00）］ XMXa/eXm［式中M为摩尔质量449.2 g/mol；a为稀 释因子;e为摩尔消光系数26 900 L/（mol • cm） ；m为 样品质量，g］计算总花色昔含量。1.5单因素实验1.5.1提取温度的考察 称取红米粉末4份，每份 10 g,加入75%乙醇50 ml八调节pH为1,分别在 30、40、50、60C的条件下，回流提取2.5 h后，按 “1.4”项下方法测定红米中花色昔含量。1.5.2提取时间的考察 称取红米粉末5份，每份 10 g,加入75%乙醇50 ml.,在40€,pH = l的条件 下,进行回流提取，分别提取1、2、2.5、3、4 h,按“1. 4”项下方法测定红米中花色昔含量。1.5.3乙醇体积分数的考察 称取红米粉末5份， 每份10 g,在40-C,pH= 1的条件下.分别加入 55%、65%、75%、85%、95% 乙醇 50 mL,回流提取 2.5 h,按T.4”项下方法测定红米中花色昔含量。1.5.4提取pH值的考察 称取红米粉末5份，每 份10 g,加入75%乙醇50 mL,分别在40°C与pH 为0.25、0.5、0.75、1、2的条件下，回流提取2.5 h,按 T.4”项下方法测定红米中花色昔含量。1.5.5提取料液比的考察 称取红米粉末5份，每 份10 g,在40C与pH = l的条件下.分别加入75% 乙醇 30、50、70、100、200 mL,回流提取 2.5 h,按 “1.4”项下方法测定红米中花色昔含量。1.5.6提取次数的考察称取红米粉末4份，每份 10 g,在40C与pH = l的条件下，加入75%乙醇 50 mL,回流分别提取1、2、3、4次，每次2.5 h,合并 提取液，按T.4”项下方法测定红米中花色昔含量。1.6响应面试验设计根据单因素实验筛选出对 红米花色昔提取率影响较大的3个因素分别为 pH、提取温度和提取时间.设计三因素三水平响应 面实验.通过实验结果使用Design Expert 10软件 分析来确定花色昔的最佳提取工艺.见表1«表1响应面实验设计表水平-101A：pH 值0,2500.6251.000B：提取时间/h2.02.53.0C：温度/C4050601.7 a-葡萄糖昔酶抑制率测定分别取0.1mmol/LPNPG 2 mL,加入0.2 mol/L pH6.8磷酸缓冲液 2 mL和浓度分别为50、100、150、200 Mg/mL红米 花色昔提取液1 mL,37 C水浴5 min,加入1 mL

1466 医科大学学报第42卷浓度为0.05 U/mL的「葡萄糖昔酶液，37°C水浴

20 min,加入 4 mL 浓度为 0.2 mol/L 的 NazCO^ 溶 液，终止反应，测定400 nm处吸光度。用磷酸缓冲 液代替酶液和提取液作空白对照，用磷酸缓冲液代 替提取液作背景对照，以阿卡波糖溶液代替红米花 色昔提取液作阳性对照，按公式a-葡萄糖昔酶抑制 率（％） = A空白一（A样畐一A背黎）/ A空白X 100 %计算 抑制率。1.8 a-淀粉酶抑制率的测定取1.5%的可溶性淀

粉1 mL,加入0.2 mol/L pH = 6.2的磷酸缓冲液

5 mL,37'C水浴 5 min,加入 3 mL 0.05 U/mL 的 a~ 淀粉酶液和浓度分别为50、100、150、200 /ig/mL红 米花色1?提取液1 mL,37'C水浴30 min,取0.5 mL 混合液’加入0.05 mol/L碘液6 mL终止反应，测 定580 nm处吸光度。用缓冲液代替酶液和提取液 作为空白对照，用缓冲液代替提取液作为背景对照, 以阿卡波糖溶液代替红米花色昔提取液作为阳性对 照，按公式a-淀粉酶抑制率（％） = A样晶一A背黎/

A住白—A背暴X 100%。2结果2.1单因素实验结果2.1.1提取温度对花色昔含量的影响当乙醇体

积分数为80%,料液比为1 : 5,提取次数为1次.Ph 为1，提取时间为2.5 h,提取温度为50°C时，花色昔 含量达到最大值，为2.35 mg/g,见图1。2. 7「(2.4、営00)2. 1、1.8哪妣1.5汪1.2題0.9住

0.60.30.030

40

50

60提取温度/C图1温度对花色昔提取含量的影响2.1.2乙醇体积分数对花色昔含量的影响 当温 度为40C,料液比为1 : 5,提取次数为1次，提取 pH为1,提取时间为2.5 h,乙醇体积分数为75% 时，花色昔含量达到最大值，为2.2 mg/g,见图2。2.1.3 pH值对花色昔含量的影响当温度为 40C,乙醇体积分数为75%,料液比为1 : 5,提取次 数为1次，提取时间为2.5 h,pH为0.5时，花色昔 的含量达到最大值，为2.4 mg/g,见图302.1.4 料液比对花色昔含量的影响当温度为 40C,乙醇体积分数为75%,提取次数为1次，提取 时间为2.5 h, pH为1,料液比为1 : 7时，花色昔的 含量达到最大值，为2.44 mg/g,见图40(、営&0、)如#注旳住

55

65

75 85 95乙醇体积分数/%图2乙醇体积分数对花色昔含量的影响7

4

2芒(1書28

、)2.15.

袒#21.L9也±16巴

O.O.3O.

0.25 0.50 0.75 1 2pHffi图3 pH值对花色昔含量的影响1：3 1：5 1：7 I ：10 1：20料液比图』料液比对花色昔含量的影响2.1.5提取次数对花色昔含量的影响当温度为 40C,乙醇体积分数为75%,料液比为1 : 5,提取时

间为2.5 h,提取pH为1,提取次数为2次时，花色

昔的含量达到最大值，为2.36 mg/g.见图5。2. 7(2.4bol2. 13

、1.8緬IM1.5汩1. 2題0.9住

0.60.30.012 3 4提取次数/次图5提取次数对花色昔含量的影响2.1.6提取时间对花色昔含量的影响当温度为 40C,乙醇体积分数为75%,料液比为1 : 5,提取次

数为1次，提取pH为1,提取吋间为2.5 h时，花色 昔的含量达到最大值，为2.4mg/g,见图6。第11期郭晓宇，等：红米中花色昔的提取工艺及其体外降糖活性研究1467表2响应面时间设计表)#曾、如勺曰兰

2.2响应面实验结果分析以红米花色昔提取量为 响应面值丫，采用Design-Expert 10软件进行多元回

(8、提取时间/h试验次数1pH值1-11提取时间/h001温度厂C-1花色昔含量/（mg/g）2.331.7723-10012.1145671000012.51.942.16-11100-10-12.322.111.722.341.88图6提取时间对于花色昔含量的影响100-10001-111

121314151617-1归拟合分析.得到的二次回归拟合方程：丫= —5.86

00101-12.522.222.062,12+ 0.15 A + 1.49 B+3.36 C-0.01 AB-0.01 AC +

0.07 BC-0.01 A2-1.28 B2-0.57 C2,P= 0.027 8, 差异达到显著水平，证明此模型的合理性，失拟值P

11-1-1-10010002.342.31值＞0.05,说明模型失拟程度低，因而其模型拟合程 度好。该回归方程的拟合程度可由决定系数R?和 调整决定系数来说明，应=0.919 6（应＞0.9）,

0表3方差来源模型响应面二次模型方差分析表自由度均方Rl =0.774 8,说明该模型可以模拟77.48%的响应 值。但各因素之间的交互作用不显著，见表2、3。A

平方和F值6.350P值显著性0.760910.0842.78X10-25.50X10-3**A-CB-pHC-hABAC0,2900.0270.2900.02721.700（温度）、B（pH）、C（时间）之间交互作用影响见图7

1112.0307.0400.0902.1700.04018.4002.10X10T4.52X10-2*—9。经过响应面软件模拟得到最优提取工艺为：提 取温度45C,pH值0.7,提取时间2.5 h,料液比

0.0940.0010.0941.23X10-3 0.0297.7OX1OT2.00X10-»0.0290.006111111 : 7,乙醇体积分数75%,提取2次。进行3次平

行实验对优化结果进行验证，花色昔平均含量达到 了 2.46 mg/g.理论值为 2.52 mg/g, RSD= 2.5% ,

BC6.25 X10-* 0.2400.1200.0758.40 X 10~1A2B2C2残差0.2400.1200.0757.80X10-3**9.0005.03.00X10-26.30X10 一 2说明该理论提取工艺可行。0.066532140.013失拟项2.3红米花色昔对于a-葡萄糖昔酶和a-淀粉酶的

0.0410.0260.8300.0140.0131.0505.20X10-1纯误差总误差抑制作用红米花色昔对a-葡萄糖昔酶有抑制效 果，存在剂量依赖关系，见图10。注：* P ＜0.05为显著°(0、如

血碩岂

(8、旨)■、

旨)

M、如相題突

_

2.252X)/224025 3.0 C:时间/h图7 A（温度）、B（pH）交互作用影响 的响应面图图8 B（pH）、C（时间）交互作用影响的响应面图

图9 A（温度）、C（时间）交互作用影 响的响应面图1468医科大学学报第42卷r

80 -

一―阿卡波糖T-红米花色昔10080604020050

-•一阿卡波糖-红米花色昔50

a 150

花色昔含量/(mg/g)100 200100 150 200花色昔含量/ (mg/g)图10红米花色昔对a-葡萄糖昔酶(a)和a淀粉酶(b)的抑制作用3讨论目前国内对红米生物活性的研究尚处于起步阶

[6]

尿病杂志,2019,15(4):42-43.周瑶，高博，徐万水，等.基层糖尿病健康管理协同服务的现况 及需求研究[J].中国全科医学,2019,22(11):1258-12.王周，张驰翔，蒲博，等.45种蔬菜水果对旷葡萄糖昔酶和a-淀

段，研究方向主要集中在清除自由基、抗氧化、抗动 脉粥样硬化方面,红米中有效抗氧化成分为花色昔，

[7]

粉酶的抑制活性研究[J1食品科技,2015,40(3):20-22.[8]

花色昔对DPPH等自由基具有较强的清除作用，且 与花色昔浓度有一定的量效关系。由于红米作为糖

池里群，舒向荣，王霆.红杉醇抑制葡萄糖昔酶及改善糖耐量 实验研究[J].中国预防医学杂志,2018,19(11):856-860.尿病的辅助降糖代餐，本研究确定了乙醇溶剂提取 法下花色昔的最佳提取工艺，采用体外降糖实验证 明花色昔的体外降糖效果，其对于a-葡萄糖昔酶和

[9] 廖彭莹，李承曼，黄志祥，等.杨桃不同部位提取物抑制a-葡萄

糖昔酶的作用[J].大众科技,2018,20(10):36-37,5 8.[10]

刘伟，李明玺,王俊龙，等.余甘子酚类成分及其抑制a-葡萄糖 昔酶活性的研究[J].现代食品科技,2017,33(12):50-55.cr淀粉酶均有显著的抑制作用，为红米资源的开发 和利用提供了理论方向和实验依据，但对于红米中

花色昔具体的化学结构和药理活性基团等问题还需

[11] 丁浩淼，孙铁，夏彭奎，等.羊栖菜组分多糖对a-葡萄糖昔酶的 抑制作用[J]•核农学报，2019,33(2):297-304.CAO Y, ZOU S, XU H,et al. Hypoglycemic activity of the Baker's yeast p-glucan in obese/type 2 diabetic mice and the underlying mechanism [J]. Mol Nutr Food Res, 2016, 60

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